澳洲堅(jiān)果蛋白肽制備工藝及抗氧化活性研究

杜麗清+帥希祥+涂行浩

摘 要 以冷榨澳洲堅(jiān)果粕為原料，通過(guò)堿提酸沉得到澳洲堅(jiān)果蛋白，采用木瓜蛋白酶酶解澳洲堅(jiān)果蛋白制備蛋白肽。以水解度為指標(biāo)，利用單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)考察各因素對(duì)澳洲堅(jiān)果蛋白水解度的影響，同時(shí)采用ABTS自由基清除能力來(lái)評(píng)價(jià)制備的澳洲堅(jiān)果蛋白肽的抗氧化活性。結(jié)果表明：各因素對(duì)澳洲堅(jiān)果蛋白水解度影響次序?yàn)椋好附鈺r(shí)間>加酶量>酶解溫度>酶解液pH值，其最佳酶解條件為：酶解時(shí)間4.0 h、酶解液pH值9.0、加酶量200 mg/mL、酶解溫度60 ℃，在此條件下澳洲堅(jiān)果蛋白的水解度為64.01 %，其清除ABTS自由基的能力達(dá)96.58 %，說(shuō)明木瓜蛋白酶制備的澳洲堅(jiān)果蛋白肽具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

關(guān)鍵詞 澳洲堅(jiān)果 ；蛋白肽 ；抗氧化活性

中圖分類(lèi)號(hào) F307.5

Abstract With macadamia pulp as raw material， the protein of macadamia nut through alkali extraction and acid precipitation， study on the technology of macadamia nut peptide prepared by papain. The effects of four processing conditions on the degree of hydrolysis were explored by single factor and orthogonal array design methods in order to optimize these conditions. Meanwhile，the antioxidant activity of macadamia nut peptide was evaluated by ABTS scavenging activity. Results showed that the order of the factors was as follows：hydrolysis duration>enzyme dosage>hydrolysis temperature>pH，the optimized macadamia nut peptide hydrolysis parameters was：hydrolysis at 60 ℃ for 4.0 h with enzyme dosage 200 mg/mL， hydrolysis buffer pH 9.0. The hydrolysis degree of macadamia nut protein was 64.01%，with 96.58% of the ABTS scavenging activity，it had strong antioxidant activity.

Key words macadamia nut ；peptides ；antioxidant activity

澳洲堅(jiān)果（Macadamia ternifolia F. Muell.）別名澳洲核桃、夏威夷果等，屬山龍眼科澳洲堅(jiān)果屬多年生常綠喬木[1-3]。澳洲堅(jiān)果營(yíng)養(yǎng)豐富，不含膽固醇，果仁含油量高（脂肪含量高達(dá)78 %以上），酥脆可口，是世界上品質(zhì)上乘的可食木本堅(jiān)果[4-5]，于20世紀(jì)60-70年代開(kāi)始引入中國(guó)[3]，目前在中國(guó)廣東、廣西、云南及貴州等地均有種植[6]。隨著澳洲堅(jiān)果果樹(shù)的大量栽種，資源越來(lái)越豐富，澳洲堅(jiān)果產(chǎn)業(yè)已具備一定規(guī)模，但目前澳洲堅(jiān)果的深加工產(chǎn)業(yè)發(fā)展比較滯后，主要用于榨油，榨油后會(huì)產(chǎn)生大量的澳洲堅(jiān)果餅粕，其蛋白質(zhì)含量較高（32.25 %），且含有17種氨基酸，總含量為25.05 %[7]。目前，澳洲堅(jiān)果粕主要用于飼料加工，造成極大的浪費(fèi)，因此，為了提高澳洲堅(jiān)果粕蛋白的附加值，通過(guò)生物酶法技術(shù)制備蛋白肽是最有效的途徑之一。

蛋白肽是由二個(gè)或二個(gè)以上氨基酸通過(guò)肽鍵連接而形成的化合物，因其組成和排列不同而形成了種類(lèi)不同的蛋白肽，它是源于蛋白質(zhì)的多功能化合物[8]。蛋白肽除具有易被消化吸收的特性外，還具有抗氧化、降血壓、免疫調(diào)節(jié)等多種生理功能[9-10]。生物酶法技術(shù)制備蛋白肽與化學(xué)方法相比，具有產(chǎn)品安全性和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、反應(yīng)條件溫和等特點(diǎn)[11-12]。目前，已有少數(shù)學(xué)者利用堿性蛋白和中性蛋白酶來(lái)制備澳洲堅(jiān)果蛋白肽[1，7]，但采用木瓜蛋白酶酶解澳洲堅(jiān)果蛋白來(lái)制備蛋白肽還未見(jiàn)報(bào)道。

本試驗(yàn)以澳洲堅(jiān)果粕為原料，通過(guò)堿提酸沉得到澳洲堅(jiān)果蛋白，以水解度為指標(biāo)，研究木瓜蛋白酶酶解澳洲堅(jiān)果蛋白的工藝優(yōu)化條件，同時(shí)，采用ABTS自由基清除能力來(lái)評(píng)價(jià)澳洲堅(jiān)果蛋白肽的抗氧化活性，以期為澳洲堅(jiān)果粕的高值化利用提供一條途徑，同時(shí)也為澳洲堅(jiān)果蛋白肽的應(yīng)用提供科學(xué)的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑

澳洲堅(jiān)果餅粕由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所休閑加工廠提供；木瓜蛋白酶（活力≥4 000 U/mg）、絲氨酸（99.99 %）、ABTS（≥97 %）（阿拉丁化學(xué)試劑有限公司）；十水四硼酸鈉、十二烷基硫酸鈉、二硫蘇糖醇、氫氧化鈉、鹽酸、過(guò)硫酸鉀、無(wú)水乙醇均為分析純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.1.2 儀器與設(shè)備

AR224CN型分析天平（奧康斯儀器有限公司）；LXJ-IIB型高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；BCD-539WT冰箱（青島海爾股份有限公司）；HH-4型恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）；DHG-9013A鼓風(fēng)干燥箱（嘉興市中新醫(yī)療儀器有限公司）；100-1000 μL移液槍?zhuān)ǖ聡?guó)Eppendorf公司）；BSXT-06型索氏提取器（上海比朗儀器制造有限公司）；ST40高速冷凍離心機(jī)[賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司]；UV2700型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)[島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司]；S210 Seven Compact pH計(jì)（梅特勒-托利多國(guó)際股份有限公司）；玻璃儀器。

1.2 方法

1.2.1 蛋白質(zhì)樣品的制備

采用堿提酸沉法，工藝流程為：稱取100 g澳洲堅(jiān)果餅粕放入濾紙包中，用沸點(diǎn)為30-60 ℃的石油醚進(jìn)行索氏提取6 h；取出晾干，按1：50（W：V）的比例加入蒸餾水，用1.0 mol/L NaOH調(diào)pH至9.0；于45 ℃水浴磁力攪拌2 h，以4 800 r/min離心過(guò)濾10 min，將上清液pH調(diào)至4.5，于4 ℃冰箱冷藏過(guò)夜；離心，水洗3次，冷凍干燥48 h，得到澳洲堅(jiān)果粗蛋白，通過(guò)測(cè)定可知，其蛋白質(zhì)含量為84.6 %。

1.2.2 澳洲堅(jiān)果蛋白酶解液中蛋白肽含量的測(cè)定

澳洲堅(jiān)果蛋白酶解液中蛋白肽的含量參照Pedroche等[13]和Nielsen等[14]報(bào)道的o-鄰苯二甲醛法（OPA）進(jìn)行測(cè)定。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確稱取0.100 0 g絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)品，用蒸餾水溶解并定容至100 mL，得到1.0 mg/mL的絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液；采用逐級(jí)稀釋法來(lái)配置濃度分別為400、300、200、100、50、20、10 μg/mL的絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)使用液；取100 μL絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)使用液，加入4.00 mL OPA試劑（稱取3.81 g十水四硼酸鈉、100 mg SDS、8 mg OPA、88 mg二硫蘇糖醇，用蒸餾水溶解并定容至100 mL），充分混勻，在室溫下放置5 min，在340 nm下測(cè)定吸光值。

澳洲堅(jiān)果蛋白酶解液中蛋白肽的測(cè)定：取澳洲堅(jiān)果蛋白酶解液100 μL，按上述操作測(cè)定。對(duì)照組：澳洲堅(jiān)果蛋白用強(qiáng)酸充分水解后[8]，用上述操作測(cè)定其蛋白肽含量。澳洲堅(jiān)果蛋白水解度按下列公式計(jì)算：

式中：DH—澳洲堅(jiān)果蛋白水解度，%；A—澳洲堅(jiān)果蛋白酶解液中蛋白肽含量，μg/g；B—充分水解的澳洲堅(jiān)果蛋白中蛋白肽含量，μg/g。

1.2.3 澳洲堅(jiān)果蛋白酶解制備蛋白肽單因素試驗(yàn)

（1）酶解時(shí)間對(duì)澳洲堅(jiān)果蛋白水解度的影響。稱取3.000 g澳洲堅(jiān)果蛋白，將其溶解于100 mL蒸餾水中，用1.0 mol/L NaOH調(diào)節(jié)溶液pH值為8.0，加入100 mg/mL木瓜蛋白酶，在50 ℃條件下恒溫酶解不同時(shí)間，測(cè)定不同酶解時(shí)間（0、10、30、60、120、240、300 min）對(duì)澳洲堅(jiān)果蛋白水解度的影響。

（2）酶解溫度對(duì)澳洲堅(jiān)果蛋白水解度的影響。稱取3.000 g澳洲堅(jiān)果蛋白，將其溶解到100 mL蒸餾水中，用1.0 moL/L NaOH調(diào)節(jié)溶液pH值為8.0，加入100 mg/mL木瓜蛋白酶，在不同酶解溫度條件下恒溫酶解120 min，測(cè)定不同酶解溫度（40、45、50、55、60、65、70、80 ℃）對(duì)澳洲堅(jiān)果蛋白水解度的影響。

（3）加酶量對(duì)澳洲堅(jiān)果蛋白水解度的影響。稱取3.000 g澳洲堅(jiān)果蛋白，將其溶解到100 mL蒸餾水中，用1.0 mol/L NaOH調(diào)節(jié)溶液pH值為8.0，加入不等量的木瓜蛋白酶，在50 ℃酶解溫度條件下恒溫酶解120 min，測(cè)定不等木瓜蛋白酶添加量（10、20、50、100、150、200、300 mg/mL）對(duì)澳洲堅(jiān)果蛋白水解度的影響。

（4）酶解液pH值對(duì)澳洲堅(jiān)果蛋白水解度的影響。稱取3.000 g澳洲堅(jiān)果蛋白溶解到100 mL蒸餾水中，用1.0 moL/L NaOH分別調(diào)節(jié)溶液pH值為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，加入100 mg/mL木瓜蛋白酶，在50 ℃酶解溫度條件下恒溫酶解120 min，測(cè)定不同pH值對(duì)澳洲堅(jiān)果蛋白水解度的影響。

1.2.4 澳洲堅(jiān)果蛋白酶解制備蛋白肽正交試驗(yàn)

在用木瓜蛋白酶酶解澳洲堅(jiān)果蛋白制備蛋白肽單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，分別選用酶解時(shí)間（A）、酶解液pH值（B）、加酶量（C）、酶解溫度（D）共4個(gè)因素，每個(gè)因素選擇3個(gè)水平，以水解度為指標(biāo)，選用L9（34）進(jìn)行正交設(shè)計(jì)來(lái)優(yōu)化最佳酶解工藝條件。

1.2.5 澳洲堅(jiān)果蛋白酶解液抗氧化活性的測(cè)定

ABTS自由基溶液的配制和抗氧化活性測(cè)定參照李瑞等[15]的方法，并作略微修改。

樣品測(cè)定：取0.20 mL澳洲堅(jiān)果蛋白酶解液，加入4.00 mL ABTS自由基工作液，室溫下靜置反應(yīng)30 min，在734 nm下測(cè)定其吸光值，用無(wú)水乙醇調(diào)零，以蒸餾水作為空白對(duì)照。按下列公式計(jì)算其清除率：

式中：SA—ABTS自由基清除率，%；A—澳洲堅(jiān)果酶解液清除ABTS自由基的吸光值；A0—對(duì)照組清除ABTS自由基的吸光值。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 17.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果均表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差；實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用origin 8.0軟件作圖，所有結(jié)果均進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解時(shí)間對(duì)澳洲堅(jiān)果蛋白水解度的影響

通過(guò)絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，得出其線性回歸方程為y=0.001 3 x+0.004 5[x為絲氨酸含量（μg/mL），y為吸光度，R2=0.999 8]。由圖1可知，隨著酶解時(shí)間的增加，澳洲堅(jiān)果蛋白的水解度逐漸增加，在240 min達(dá)到最大值，之后趨于平緩，這可能是因?yàn)槊附馇?40 min內(nèi)，木瓜蛋白酶活性高，酶解產(chǎn)物的抑制作用小，而4 h后隨著酶解時(shí)間的增加，酶解液中蛋白肽和游離氨基酸含量逐漸增加，其產(chǎn)生的抑制作用增大，木瓜蛋白酶的活性因受到抑制而降低，水解度增加的幅度趨于平緩[16]，這與范方宇等[1]和郭剛軍等[7]研究堿性蛋白酶和中性蛋白酶對(duì)澳洲堅(jiān)果蛋白酶解的影響中，水解度隨酶解時(shí)間的變化極其相似。綜合各方面因素考慮，木瓜蛋白酶酶解澳洲堅(jiān)果蛋白的適宜時(shí)間為4 h左右，在此條件下澳洲堅(jiān)果蛋白的水解度為56.46 %。

2.2 酶解溫度對(duì)澳洲堅(jiān)果蛋白水解度的影響

由圖2可知，酶解溫度在35-60 ℃時(shí)，澳洲堅(jiān)果蛋白水解度隨著溫度的升高而增加，當(dāng)酶解溫度超過(guò)60 ℃后，水解度隨著溫度的升高而降低，這可能是由于在一定的溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，木瓜蛋白酶的催化活性增加，酶解能力增強(qiáng)，所以水解度逐漸增加，產(chǎn)生的澳洲堅(jiān)果蛋白肽也增加；當(dāng)超過(guò)最適酶解溫度后，酶的催化活性因受到抑制而減弱，甚至有可能導(dǎo)致酶失活[17]。因此，木瓜蛋白酶酶解澳洲堅(jiān)果蛋白的最適酶解溫度為60 ℃左右，在此條件下水解度達(dá)到55.78 %。

2.3 酶解液pH值對(duì)澳洲堅(jiān)果蛋白水解度的影響

由圖3可知，隨著酶解液pH值的增加，澳洲堅(jiān)果蛋白的水解度逐漸增加，這可能是由于澳洲堅(jiān)果蛋白在pH 4.0時(shí)溶解度較低，底物與酶接觸不充分，而且過(guò)高或過(guò)低的pH值均會(huì)導(dǎo)致酶的空間結(jié)構(gòu)破壞，使酶活性降低，甚至失活。在pH 8.0、pH 9.0時(shí)，澳洲堅(jiān)果蛋白的溶解度較大，底物與酶接觸比較充分，水解度增加。因此，木瓜蛋白酶酶解澳洲堅(jiān)果蛋白的適宜pH值為9.0左右，在此條件下水解度達(dá)到54.58 %。

2.4 加酶量對(duì)澳洲堅(jiān)果蛋白水解度的影響

由圖4可知，隨著木瓜蛋白酶加酶量的增加，澳洲堅(jiān)果蛋白的水解度逐漸增加，但水解度的增加幅度逐漸減弱，這可能是由于隨著木瓜蛋白酶添加量的增加，增大了底物與酶的接觸面積，從而促進(jìn)了酶催化反應(yīng)速率，所以水解度增加較快，但木瓜蛋白酶添加量超過(guò)最適加酶量后，沒(méi)有足夠的底物與過(guò)量的酶作用，導(dǎo)致蛋白水解度增加較緩[7]。因此，木瓜蛋白酶酶解澳洲堅(jiān)果蛋白的最適加酶量為200 mg/mL左右，在此條件下水解度達(dá)到57.67 %。

2.5 木瓜蛋白酶酶解澳洲堅(jiān)果蛋白制備蛋白肽正交試驗(yàn)分析

根據(jù)以上單因素實(shí)驗(yàn)，以水解度為指標(biāo)，選擇酶解時(shí)間（A）、酶解液pH值（B）、加酶量（C）和酶解溫度（D）共4個(gè)因素進(jìn)行L9（34）正交優(yōu)化設(shè)計(jì)，確定木瓜蛋白酶酶解澳洲堅(jiān)果蛋白制備蛋白肽的最優(yōu)工藝條件。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可知，木瓜蛋白酶酶解澳洲堅(jiān)果蛋白制備蛋白肽的工藝中各因素對(duì)蛋白水解度的影響為：酶解時(shí)間>加酶量>酶解溫度>酶解液pH值，其中酶解時(shí)間影響最為顯著，其最優(yōu)的工藝條件為A3B3C2D2，即酶解時(shí)間4.0 h、酶解液pH值9.0、加酶量200 mg/mL、酶解溫度60 ℃。在此條件下進(jìn)行了3組平行驗(yàn)證試驗(yàn)，其水解度平均值為64.01 %，優(yōu)于正交試驗(yàn)的結(jié)果。張興燦[18]采用木瓜蛋白酶酶解核桃蛋白來(lái)制備多肽，其水解度為14.67 %，并且本研究結(jié)果較范方宇等[1]利用堿性蛋白酶酶解澳洲堅(jiān)果蛋白制備多肽的水解度（52.50 %）高，說(shuō)明利用木瓜蛋白酶酶解澳洲堅(jiān)果蛋白制備蛋白肽更為適宜。

2.6 木瓜蛋白酶酶解澳洲堅(jiān)果蛋白制備的蛋白肽抗氧化活性分析

ABTS自由基清除能力可用來(lái)評(píng)價(jià)物質(zhì)抗氧化活性的強(qiáng)弱，ABTS自由基與物質(zhì)反應(yīng)后可使其溶液褪色，褪色越明顯說(shuō)明其抗氧化能力越強(qiáng)[19]。圖5顯示了木瓜蛋白酶酶解澳洲堅(jiān)果蛋白制備的蛋白肽以及不同濃度Vc和BHT對(duì)ABTS自由基的清除能力。由圖5可知，澳洲堅(jiān)果蛋白肽對(duì)ABTS自由基都有很強(qiáng)的清除能力，5.0 %的澳洲堅(jiān)果蛋白酶酶解液對(duì)ABTS自由基的清除能力為54.73 %，且隨著澳洲堅(jiān)果蛋白酶酶解液濃度的增加，其清除能力也增強(qiáng)，100 %澳洲堅(jiān)果蛋白酶酶解液對(duì)ABTS自由基的清除能力達(dá)到96.58 %，而100 μg/mL Vc和100 μg/mL BHT對(duì)ABTS自由基的清除能力分別為67.59 %和66.12 %。盧曉會(huì)[20]研究發(fā)現(xiàn)，菜籽肽及其分離組分對(duì)ABTS自由基清除效果較好，且其組分的相對(duì)分子質(zhì)量越小，其清除能力越強(qiáng)；范方宇等[1]研究利用堿性蛋白酶酶解澳洲堅(jiān)果蛋白所得酶解液的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)其清除羥基自由基和超氧自由基的能力都較強(qiáng)。說(shuō)明利用木瓜蛋白酶酶解澳洲堅(jiān)果蛋白制備的蛋白肽可用來(lái)開(kāi)發(fā)一種高活性抗氧化肽。

3 結(jié)論

本研究采用木瓜蛋白酶酶解澳洲堅(jiān)果蛋白制備蛋白肽，并對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。通過(guò)正交和驗(yàn)證試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其最優(yōu)酶解條件為：酶解時(shí)間4.0 h、酶解液pH值9.0、加酶量200 mg/mL、酶解溫度60 ℃，且各因素對(duì)澳洲堅(jiān)果蛋白水解度影響次序?yàn)椋好附鈺r(shí)間>加酶量>酶解溫度>酶解液pH值，在此條件下澳洲堅(jiān)果蛋白的水解度為64.01 %，其清除ABTS自由基的能力為96.58 %。本研究結(jié)果出現(xiàn)木瓜蛋白酶酶解澳洲堅(jiān)果蛋白所得酶解液具有較強(qiáng)的抗氧化活性，但對(duì)于酶解液中的蛋白肽含量、氨基酸組成、蛋白肽分子結(jié)構(gòu)及構(gòu)效關(guān)系等未進(jìn)行研究，后續(xù)將主要針對(duì)這些方面進(jìn)行深入研究。

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