宮頸癌術(shù)后輸注細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞治療前后外周血免疫指標(biāo)的變化

趙 花，劉征麗，許 霞

宮頸癌術(shù)后輸注細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞治療前后外周血免疫指標(biāo)的變化

趙 花1，劉征麗2，許 霞1

目的 觀察鱗癌、腺癌、腺鱗癌3種類型宮頸癌根治術(shù)后使用細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokine induced killer,CIK)治療前后外周血中免疫指標(biāo)的變化，為臨床使用CIK治療宮頸癌效果評估提供依據(jù)。方法 收集我院2014-01至2016-05腫瘤科和婦產(chǎn)科行宮頸癌根治術(shù)后患者98例(其中鱗癌56例，腺癌25例，腺鱗癌17例)CIK治療前1 d和治療1個周期后的外周血各5 ml，收集的外周血按CIK細(xì)胞治療流程進行血清分離，分離后的血清用流式細(xì)胞計數(shù)儀對血清中CD3+、CD4+、CD8+、CD4/CD8、NK細(xì)胞的比例進行檢測分析。結(jié)果 (1)98例宮頸癌根治術(shù)后使用CIK細(xì)胞治療前后外周血中免疫指標(biāo)的對比顯示CD3+、NK細(xì)胞的比例均升高，CD4+、CD4/CD8比例僅在鱗癌和腺癌中升高，CD8+治療前后變化不明顯。(2)以CD3+和NK細(xì)胞為例可以看出使用CIK細(xì)胞治療后腺癌免疫指標(biāo)較鱗癌、腺鱗癌有顯著提升(P<0.05),鱗癌治療前后，CD3+：(60.71±5.84)/(67.27±3.04)，NK細(xì)胞：(8.92±3.64)/(12.93±6.25)；腺癌治療前后，CD3+：(59.91±2.49)/(68.32±8.24)，NK細(xì)胞：(9.04±5.31)/(17.87±6.46)；腺鱗癌治療前后，CD3+：(59.01±5.90)/(65.23±7.07)，NK細(xì)胞：(8.59±3.97)/(15.07±2.71)。結(jié)論 CIK 細(xì)胞治療可以顯著提升宮頸癌根治術(shù)后患者的免疫功能，對延長生存期，提高生存質(zhì)量具有重要意義。

細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞; 宮頸癌; 免疫指標(biāo)

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一,高發(fā)年齡為30～55歲，是我國女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤發(fā)生率最高的腫瘤[1]。近年來，臨床上宮頸癌治療主要以手術(shù)與放化療為主，隨著宮頸細(xì)胞學(xué)篩查的普遍應(yīng)用，宮頸癌早期病變得以發(fā)現(xiàn)和治療，宮頸癌的發(fā)病率、病死率均有明顯下降[2]。但宮頸癌的轉(zhuǎn)移、預(yù)后不良一直是臨床治療上的難題，尤其是晚期宮頸癌患者自身免疫功能缺陷[3]，以及放療、化療后造成的免疫系統(tǒng)紊亂，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[4]。目前，細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokine induced killer,CIK)因其增殖速度快、強大的抗瘤活性、毒性小等特點，已被應(yīng)用在腎癌、結(jié)腸癌 、淋巴瘤等多種惡性腫瘤的過繼性細(xì)胞免疫治療,并取得了較好的臨床治療效果[5]，但有關(guān)CIK 治療宮頸癌的報道較少。本研究通過收集98例(鱗癌56例，腺癌25例，腺鱗癌17例)宮頸癌根治術(shù)后患者進行CIK細(xì)胞治療前后的外周血清，檢測相關(guān)的免疫指標(biāo)并整理分析，為臨床不同類型宮頸癌根治術(shù)行CIK細(xì)胞治療療效觀察提供有力依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 對象 收集2014-01至2016-05在我院腫瘤科和婦產(chǎn)科行宮頸癌根治術(shù)后患者98例。入選標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)影像學(xué)診斷無局部復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，無免疫系統(tǒng)疾病，無慢性感染疾病，無輸血和臟器移植史。所有患者簽署知情同意書，實驗設(shè)計經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 CIK細(xì)胞治療 抗凝管采集腫瘤患者外周血50 ml，加入等量細(xì)胞分離液，采用Ficoll離心法分離淋巴細(xì)胞，置于無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)(37 ℃、5%CO2)，加入IL-2和抗CD-3單克隆抗體，觀察細(xì)胞培養(yǎng)情況，每3 d換液，2周左右回收細(xì)胞。檢查細(xì)菌、真菌、支原體、內(nèi)毒素等，對CIK細(xì)胞進行百分比計數(shù)，經(jīng)質(zhì)量檢測合格后收集培養(yǎng)的細(xì)胞，予以靜脈回輸治療。

1.3 免疫指標(biāo)檢測 抗凝管分別抽取5 ml腫瘤患者治療前1 d和CIK細(xì)胞治療1個周期[(28±3)d]的血清，檢測相關(guān)的免疫指標(biāo)，包括CD3+、CD4+、CD8+、CD4/CD8、NK細(xì)胞(CD16+CD56+)。

1.4 儀器和試劑 流式細(xì)胞儀為BD FASCalibur；人淋巴細(xì)胞分離液由天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司提供；CD3、GM-CSF、尤尼芬、白介素2由北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司提供；TNF-G由上海唯科生物制藥有限公司提供。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析，對3種不同類型宮頸癌患者外周血中免疫指標(biāo)進行單因素方差分析，治療前后患者免疫指標(biāo)采用配對t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況 總共收集56例鱗癌,平均(52.7±6.3)歲；25例腺癌，平均(54.1±3.8)歲；17例腺鱗癌，平均(53±2.7)歲，3種不同類型宮頸癌患者年齡和治療前免疫指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，具有可比性。

2.2 免疫指標(biāo)結(jié)果 治療后CD3+、CD4+、NK細(xì)胞差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，CD8和NK細(xì)胞差異無統(tǒng)計學(xué)意義；在鱗癌中，CD3+、CD4+、CD4/CD8、NK細(xì)胞有統(tǒng)計學(xué)差異(圖1)；在腺癌中，CD3+、CD4+、CD4/CD8、NK細(xì)胞有統(tǒng)計學(xué)差異(圖2)。在腺鱗癌中，僅有CD3+、NK細(xì)胞有統(tǒng)計學(xué)差異(圖3)；CIK細(xì)胞治療不同類型宮頸癌前后免疫指標(biāo)變化(表1)。

圖1 宮頸癌鱗癌術(shù)后患者輸注CIK細(xì)胞治療前后外周血中免疫指標(biāo)變化

圖2 宮頸癌腺癌術(shù)后患者輸注CIK細(xì)胞治療前后外周血中免疫指標(biāo)變化

圖3 宮頸癌腺鱗癌術(shù)后患者輸注CIK細(xì)胞治療前后外周血免疫指標(biāo)變化

項目鱗癌(n=56)治療前治療后腺癌(n=25)治療前治療后腺鱗癌(n=17)治療前治療后CD3+60．71±5．8467．27±3．04①59．91±2．4968．32±8．24①59．01±5．9065．23±7．07①②CD4+38．87±8．4442．73±7．83①39．64±8．4943．78±7．62①39．71±9．4040．01±10．38②CD8+28．72±8．3228．34±8．1628．37±7．9427．92±8．7429．07±7．6827．31±11．97CD4/CD81．35±0．571．51±0．73①1．40±0．431．57±0．53①1．37±0．571．47±0．62NK8．92±3．6412．93±6．25①9．04±5．3117．87±6．46①8．59±3．9715．07±2．71①②

注：與治療前比較，①P<0.05；不同腫瘤之間比較，②P<0.05

3 討 論

宮頸癌已成為婦科常見腫瘤，藥物和手術(shù)治療對宮頸癌雖取得一定療效，但術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移十分常見，而且患者存在免疫功能低下，導(dǎo)致療效較差[6]。尋找新的治療方案，為提高患者機體免疫力、改善治療效果具有重要意義。近年來，隨著對腫瘤患者發(fā)病機制研究的深入，發(fā)現(xiàn)免疫功能與腫瘤發(fā)生發(fā)展有著密不可分的關(guān)系。有研究表明，提高免疫功能可消除和減緩腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[7]。CIK作為一種新型的免疫活性細(xì)胞，被認(rèn)為是腫瘤過繼細(xì)胞免疫治療首選方案。CIK細(xì)胞通過體外培養(yǎng)，在白介素-2、TNF-G等細(xì)胞因子的刺激下，大量擴增、成熟，然后回輸給患者使其獲得抗原特異性的腫瘤免疫效應(yīng)，CIK還具有只識別殺滅腫瘤細(xì)胞而不對機體正常細(xì)胞產(chǎn)生作用[8，9]。CIK細(xì)胞治療的臨床效果已經(jīng)在胃癌、直腸癌、膽管癌等多種腫瘤治療中的得到驗證[10]。

有研究發(fā)現(xiàn)，惡性腫瘤患者的免疫抑制與CD4+、CD8+增多有關(guān)[11]。CD3+是T細(xì)胞表面特異性表達(dá)的分子，CD4+、CD8+是輔助性T細(xì)胞，具有細(xì)胞毒性作用，CD4+能介導(dǎo)機體再次免疫，CD8+是抑制性T細(xì)胞，能夠促進B細(xì)胞增值產(chǎn)生抗體，生成CIK細(xì)胞[12]。在正常情況下 CD4/CD8比值處在動態(tài)平衡，以維持機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[13]。NK細(xì)胞可以不用識別直接對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生殺傷作用[14]。本研究中治療前相對于治療后，CD3+、CD4+的比例均有所上升，但是CD8+在3種腫瘤中均下降不明顯。CD3+、CD4+比例上升，CD4/CD8升高，表明經(jīng)CIK治療后，機體免疫功能增強，但CD4+、CD4/CD8在腺鱗癌中變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明CIK治療改善腺鱗癌的機體免疫功能不明顯。該結(jié)果可能是腺鱗癌樣本只有17例，數(shù)據(jù)離散程度(標(biāo)準(zhǔn)差)比鱗癌和腺癌高引起的。本研究中CD8+比例下降不明顯，可能與兩方面原因有關(guān)：(1)CD4+比例升高，影響CD8+在細(xì)胞中的比例；(2)CD8+實際下降不明顯。NK細(xì)胞是參與機體細(xì)胞免疫的重要細(xì)胞，CIK細(xì)胞在受到抗CD-3刺激后會釋放CD16+CD56+，這些胞漿顆粒釋放到細(xì)胞外，通過細(xì)胞毒性殺死腫瘤細(xì)胞[15]。本研究3組腫瘤前后對比中NK細(xì)胞(CD16+CD56+)比例上升，提示經(jīng)CIK細(xì)胞治療宮頸癌后，機體免疫功能加強。通過此研究數(shù)據(jù)結(jié)果顯示與國內(nèi)外文獻(xiàn)報道CIK細(xì)胞治療腫瘤效果評價一致，接受CIK細(xì)胞治療后的患者淋巴細(xì)胞水平都有不同程度增高，而且遠(yuǎn)期效果觀察對促進患者免疫系統(tǒng)重建，消除微小病灶有良好效果。

綜上所述，CIK細(xì)胞治療在宮頸癌根治術(shù)后，尤其是腺癌患者有明顯的臨床效果。CIK細(xì)胞治療對提高機體免疫功能、改善機體的抗瘤能力、延長生存期、提高生存質(zhì)量具有重要意義。

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(2016-08-11收稿 2016-11-18修回)

(責(zé)任編輯 岳建華)

Changes of immune parameters in cervical cancer patients after CIK cell therapy

ZHAO Hua1，LIU Zhengli2，and XU Xia1.

1.Department of Clinical Laboratory，2.Department of Gynaecology and Obstetrics，Shaanxi Provincial Corps Hospital of Chinese People’s Armed Police Force，Xi’an 710054

Objective To observe the changes of immune parameters of patients with different cervical cancer treated with cytokine-induced killer(CIK)cells after radical hysterectomy in order to provide data for clinical evaluation.Methods 50 ml peripheral blood was collected the day before CIK cell therapy and after a course of treatment from ninety-eight radical hysterectomy patients(56 cases of squamous carcinoma, 25 cases of adenocarcinoma,and 17 cases of adenosquamous carcinoma) treated in the Department of Gynaecology and Obstetrics and Department of Oncology between January 2014 and September 2016.According to the process of CIK cell therapy, the serum was separated, and the proportion of CD3+、CD4+、CD8+、CD4/CD8、and NK cells in the serum was analyzed using flow cytometry (FCM).Results 1.The proportion of CD3+and NK cells in the 98 patients was increased after CIK cell therapy.The proportion of CD4+and CD4/CD8 rose only in patients of squamous carcinoma and adenocarcinoma.The proportion of CD8+did not change significantly.2.The result of CD3+and NK cells suggested that after treatment the immune parameters in patients of adenocarcinoma were significantly higher than those in patients of squamous carcinoma and adenosquamous carcinoma (P<0.05).After treatment, CD3+and NK cells increased from 60.71±5.84 to 67.27±3.04 and from 8.92±3.64 to 12.93±6.25 respectively in patients of squamous carcinoma, from 59.91±2.49 to 68.32±8.24 and from 9.04±5.31 to 17.87±6.46 respectively in patients of adenocarcinoma,and finally from 59.01±5.90 to 65.23±7.07 and from 59±3.97 to 15.07±2.71 respectively in patients of adenosquamous carcinoma.Conclusions CIK cell therapy can markedly enhance the immunity of patients after radical hysterectomy. It’s of great significance for improving the quality of survival.

cytokine induced killer；cervical cancer；immune parameters

趙 花，本科學(xué)歷，主管技師。

710054 西安，武警陜西總隊醫(yī)院：1.檢驗科，2.婦產(chǎn)科

R737.3