臨床級臍帶間充質細胞制備及鑒定方法研究

袁艷鵬 王淑艷 唐璽和 劉仲鳳 張愚 陳志國

臨床級臍帶間充質細胞制備及鑒定方法研究

袁艷鵬 王淑艷 唐璽和 劉仲鳳 張愚 陳志國

目的 在GLP實驗室中制備并鑒定臨床級臍帶間充質細胞（UC-MSC）。方法 新鮮獲取的臍帶去除血管并進行充分清洗，獲得的華通膠（Wharton’s jelly）機械分離后分別進行直接貼壁法和不同的酶消化法，比較獲取UC-MSC的數(shù)量差別；用不同的無血清培養(yǎng)基進行培養(yǎng)比較細胞形態(tài)是否良好，得到最佳形態(tài)的UC-MSC。體外培養(yǎng)第3代后進行UCMSC質檢，包括細胞活性，生長曲線，無菌檢測，人類相關病毒、支原體、內(nèi)毒素檢測，染色體核型分析，F(xiàn)ACS免疫表型檢測及分化能力檢測。不同消化方法獲取細胞數(shù)之間比較采用兩樣本配對t檢驗。結果 膠原酶Ⅱ消化獲得的UC-MSC數(shù)（5.3×106±0.58個/ml）與膠原酶Ⅰ+ 0.25﹪胰酶消化法（2.53×105±0.03個/ml）及直接貼壁法（2.6×105±0.05個/ml）之間差異有統(tǒng)計學意義（P ＜ 0.05），與膠原酶Ⅰ消化法獲取細胞數(shù)（5.1×106±0.57個/ml）之間差異無統(tǒng)計學意義（P = 0.07），但培養(yǎng)視野最干凈；MesenCult-ACF Medium培養(yǎng)獲得的UC-MSC形態(tài)最佳；UC-MSC質檢細胞活性凍存前達99.8﹪，凍存復蘇后達99﹪；無細菌、支原體、乙肝病毒、丙肝病毒、梅毒螺旋體、艾滋病毒、肺炎支原體、EB病毒、巨細胞病毒污染；內(nèi)毒素檢測結果均＜ 1 EU；CD73/CD90/CD105陽性率達98﹪，CD34/CD45/HLA-DR呈陰性，陽性率＜ 2﹪；染色體核型分析無突變或缺失；UC-MSC具有成脂、成骨或成軟骨方向分化的能力。結論 通過優(yōu)化分離和培養(yǎng)條件，采用無血清及無動物來源的培養(yǎng)系統(tǒng)，在GLP實驗室內(nèi)可獲得臨床級UC-MSC。

臍帶； 間質細胞； 膠原酶類； 培養(yǎng)基、無血清； 細胞分化

間充質干細胞（mesenchymal stromal cells，MSCs）最早從骨髓中發(fā)現(xiàn)[1]，隨著MSCs的廣泛應用，逐漸在多種組織中也發(fā)現(xiàn)了MSCs，包括脂肪、胎盤、臍帶、臍血、羊膜及肌肉等[2]。目前臍帶間充質干細胞（umbilical cord mesenchymal stromal cells，UC-MSC）由于其增殖能力強，免疫調(diào)節(jié)作用及多向分化能力被廣泛用于細胞移植治療，但獲取UC-MSC的方法各不相同，本實驗室在GLP實驗室中采用無血清及無動物來源的培養(yǎng)基制備臨床級UC-MSC。

材料與方法

一、材料及試劑

足月順產(chǎn)新生兒臍帶（首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院婦產(chǎn)科）；100 ml培養(yǎng)瓶（德國DURAN GROUP公司）、無菌手術器械（上海醫(yī)療器械有限公司）；10 cm培養(yǎng)皿、T75培養(yǎng)瓶（美國Corning公司）；膠原酶Ⅰ、膠原酶Ⅱ、DNA酶Ⅰ（美國Sigma公司）；Mesen Cult-ACF Medium、Mesen Cult-ACF Dissociation Kit、Mesen Cult-ACF Freezing Medium（加拿大Stem Cell Technologies公司）；人MSCs培養(yǎng)基（北京百樂通生物科技有限公司）；加強型人MSCs培養(yǎng)基（天津市灝洋生物制品科技有限公司）；倒置相差顯微鏡（日本Nikon公司）；乙型肝炎病毒核酸檢測試劑盒、人類免疫缺陷病毒1型核酸檢測試劑盒、丙型肝炎病毒核酸檢測試劑盒、人類巨細胞病毒核酸檢測試劑盒、梅毒螺旋體核酸檢測試劑盒、EB病毒核酸檢測試劑盒、肺炎支原體核酸檢測試劑盒（湖南圣湘生物公司）；人MSCs成脂、成骨、成軟骨分化試劑盒（賽業(yè)生物科技有限公司）；細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher公司）。

二、方法

1.新鮮臍帶的處理及華通膠（Wharton's jelly）獲取：產(chǎn)婦順利分娩后獲取20 cm左右臍帶，放置于含有Hank's Solution 10 ml及1﹪P ～ S（青鏈霉素）溶液的100 ml培養(yǎng)瓶內(nèi)，轉運盒常溫轉運至GLP內(nèi)準備間，將臍帶分離為3 ～ 5 cm小段并用DPBS（不含鈣和鎂離子的磷酸鹽緩沖液）和75﹪酒精分別清洗3遍至液體澄清，將2根臍動脈和1根臍靜脈剝離后再次清洗即可獲得華通膠。該研究經(jīng)由首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院倫理委員會審批，告知產(chǎn)婦及家屬簽署知情同意書。

2.比較不同酶消化法UC-MSC獲取的數(shù)量：將華通膠機械分離為1 ～ 2 mm3小塊，轉移入50 ml離心管中，等量加入DPBS 250×g，4°離心5 min，棄上清液，重復2次。用無血清培養(yǎng)基重懸組織塊，其中1/4直接接種于T75培養(yǎng)瓶內(nèi)，培養(yǎng)基能夠浸濕培養(yǎng)瓶底即可，組織塊要達到底面積的50﹪～ 70﹪即可放入孵箱內(nèi)培養(yǎng)；其余3/4平均分為3份，分別用等體積膠原酶Ⅰ、膠原酶Ⅱ和膠原酶Ⅰ+ 0.25﹪胰酶37℃消化5 h，之后均用DNA酶Ⅰ處理3 min，DPBS清洗2遍后計數(shù)并接種至T75培養(yǎng)瓶內(nèi)，放入無血清培養(yǎng)基10 ml后混勻孵育。

直接貼壁培養(yǎng)的組織塊5 d后換液，之后每3天換液1次；酶消化法獲得的UC-MSC每3天換液，統(tǒng)一在培養(yǎng)第15天時用Mesen Cult-ACF Dissociation Kit消化UC-MSC計數(shù)，比較4種方法獲取細胞的數(shù)量。

3.比較不同無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)UC-MSC的形態(tài)：獲得UC-MSC后分別采用3種不同培養(yǎng)基Mesen Cult-ACF Medium（Stem Cell Technologies）、人MSC培養(yǎng)基（北京百樂通生物科技有限公司）和加強型人MSC培養(yǎng)基（天津市灝洋生物制品科技有限公司）培養(yǎng)UC-MSC，比較哪種培養(yǎng)基獲得的細胞形態(tài)最佳。

4.UC-MSC的質檢：UC-MSC培養(yǎng)至第3代后進行凍存前及凍存后細胞活性鑒定；每次傳代計數(shù)細胞數(shù)了解UC-MSC生長曲線；隨機采集細胞培養(yǎng)上清（48 h未換液）進行無菌檢測（常見有氧菌和厭氧菌）；隨機選取P3和P4培養(yǎng)上清（48 h未換液）各3個樣本進行支原體PCR檢測；應用人內(nèi)毒素ELISA試劑盒對P3和P4培養(yǎng)上清（48 h未換液）各3個樣本進行檢測；人類相關病毒（乙肝病毒、丙肝病毒、艾滋病毒、EB病毒、巨細胞病毒、梅毒螺旋體和肺炎支原體）用熒光定量PCR試劑盒檢測；取P4增殖期細胞進行染色體核型鑒定；P3細胞固定后分別標記表面抗原CD73-FITC、CD90-PE、CD105-PE、CD34-APC、CD45-PE和HLA-DRPE進行FACS免疫表型檢測。

5.UC-MSC的分化：第3代UC-MSC消化后按照人MSC成脂、成骨、成軟骨分化試劑盒，簡單描述為成骨分化在六孔板內(nèi)接種2×105/孔UCMSC，細胞生長至60﹪～ 70﹪融合時更換為成骨分化培養(yǎng)基，每3 d換液1次，3周后應用茜素紅染色觀察成骨分化情況；成脂方向分化在六孔板內(nèi)每孔接種2×105/孔UC-MSC，細胞生長至100﹪融合時更換為成脂分化培養(yǎng)基A，3 d后更換成脂分化培養(yǎng)基B培養(yǎng)1 d，重復4次，之后持續(xù)用培養(yǎng)基B培養(yǎng)至3周，應用油紅“O”染色鑒定成脂情況；成軟骨分化將2.5×105/管UC-MSC放入15 ml離心管內(nèi)，用不完全培養(yǎng)基150×g離心5 min，離心過程重復2次，之后棄上清，再用0.5 ml完全培養(yǎng)基（含TGF-β3）重懸細胞后再次150×g離心5 min，將離心管蓋擰松放入孵箱內(nèi)，每2 ～ 3 d更換完全培養(yǎng)基0.5 ml（換液時避免吸到細胞團），3周后將得到的軟骨顆粒固定后石蠟包埋切片進行阿辛藍染色鑒定。

三、統(tǒng)計學分析方法

應用SPSS16.0統(tǒng)計軟件，不同消化方法獲取細胞數(shù)據(jù)以±s表示，兩種消化方法獲取細胞數(shù)之間比較采用兩樣本配對t檢驗，以P ＜ 0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。FACS數(shù)據(jù)應用FlowJo軟件分析并作圖。

結 果

1.不同方法獲取UC-MSC的數(shù)量比較：經(jīng)過15 d的培養(yǎng)，直接貼壁法獲得的細胞數(shù)為2.6× 105±0.05個/ml，膠原酶Ⅰ消化法可獲得5.1× 106±0.57/ml，膠原酶Ⅱ消化法可獲得5.3× 106±0.58/ml，膠原酶Ⅰ+ 0.25﹪胰酶消化法可獲得2.53×105±0.03/ml，膠原酶Ⅱ與膠原酶Ⅰ+ 0.25﹪胰酶消化法及直接貼壁法之間存在顯著性差異（P ＜0.0001），與膠原酶Ⅰ消化法獲取細胞數(shù)差異無統(tǒng)計學意義（P = 0.07），但鏡下發(fā)現(xiàn)膠原酶Ⅱ消化法培養(yǎng)視野最干凈。不同方法獲取細胞數(shù)結果比較Medium（STEM CELL Technologies）的培養(yǎng)基獲得的細胞形態(tài)最佳，另外兩種培養(yǎng)基獲取的細胞形態(tài)欠佳。具體細胞培養(yǎng)形態(tài)見圖2。見圖1。

2.不同培養(yǎng)基獲取的UC-MSC形態(tài)不同：目前UC-MSC的培養(yǎng)基較多，但用于臨床級的培養(yǎng)基必須是無血清和無動物來源的培養(yǎng)基，選取3種不同公司培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，比較得出MesenCult-ACF

圖1 不同酶消化法獲取細胞數(shù)比較

3.細胞活性比較：凍存前每次傳代都計數(shù)細胞活性，活性可達99.8﹪，凍存后復蘇UC-MSC活性可達99﹪，且細胞放置在冰上保存24 h細胞活性仍可達80﹪。

4.UC-MSC生長曲線：從原代獲取的UC-MSC開始，每次傳代后計數(shù)細胞，橫軸為細胞代次，縱軸為細胞計數(shù)，顯示UC-MSC的生長曲線（圖3）。

5.細菌、支原體、內(nèi)毒素、人類相關病毒及核型檢測：（1）細菌檢測：細胞培養(yǎng)上清送檢驗科進行無菌檢測3次，常見有氧菌和厭氧菌檢測均為（-）；（2）支原體檢測：隨機選取P3和P4培養(yǎng)上清進行支原體PCR檢測，凝膠電泳顯示陽性對照為270bp條帶，而陰性對照及6個樣本結果均為陰性，結果見圖4；（3）內(nèi)毒素檢測隨機選取P3和P4培養(yǎng)上清各3個樣本應用人內(nèi)毒素ELISA試劑盒檢測內(nèi)毒素水平，結果吸光度均＜ 1 EU，詳細結果見表1；（4）人類相關病毒檢測：應用圣湘生物7個人類病毒核酸檢測試劑盒熒光定量PCR的方法分別檢測P3及P4培養(yǎng)上清的病毒水平，結果均為（-）；（5）染色體核型分析 UC-MSC P4傳代后第2天（增殖期）送檢驗科進行染色體核型分析，為46XX，無突變或缺失（圖5）。

6.FACS細胞免疫表型檢測 UC-MSC P3細胞消化后DPBS清洗、固定及表面抗原免疫表型檢測，CD73/CD90/CD105呈陽性，陽性率達98﹪，CD34/ CD45/HLA-DR呈陰性，陽性率＜ 2﹪，符合MSC的免疫表型（圖6）。

表1 UC-MSC不同代次細胞內(nèi)毒素檢測結果

圖2 倒置相差顯微鏡下觀察不同培養(yǎng)基獲取UC-MSC形態(tài)比較（×20）

圖3 UC-MSC生長曲線

圖4 支原體PCR檢測結果

圖5 UC-MSC染色體核型分析

7.UC-MSC成脂、成骨、成軟骨三方向分化檢測將UC-MSC P3消化后按照分化試劑盒說明向成骨、成脂、成軟骨方向分化，21 d左右分別進行茜素紅、油紅“O”及阿辛藍染色鑒定（圖7）。

圖6 UC-MSC免疫表型FACS檢測結果

圖7 倒置相差顯微鏡下觀察UC-MSC成骨、成脂、成軟骨分化結果（×20）

討 論

MSC自有學者報道以來，一直是基礎研究及臨床應用的熱點，主要由于其來源于早期中胚層，有自我增殖能力、多向分化的潛能等。目前獲取的MSC多從成人骨髓而來，其獲取過程為有創(chuàng)性，獲取的量極少，且因患者年齡及疾病原因不能得到滿意的MSC。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種組織中存在MSC，如脂肪、肌肉、胎盤、羊膜、臍血及臍帶等[2]。臍帶為連接胎兒與母體的重要紐帶，產(chǎn)婦順利分娩后臍帶的紐帶作用隨即消失成為棄物，故獲取臍帶相對容易，對產(chǎn)婦及胎兒無任何影響，與骨髓MSC相比較，UCMSC增殖能力及細胞活性更高，免疫原性更低[3]，且有報道表明臍帶可獲取最大量的UC-MSC[4]，逐漸成為基礎與臨床研究的新寵。

UC-MSC的獲取方法目前主要有直接貼壁培養(yǎng)法及酶消化法[5-9]，兩大類方法各有可取之處，本實驗對比了直接貼壁法與不同酶消化法獲取細胞的數(shù)量，發(fā)現(xiàn)直接貼壁法步驟簡單，獲取的細胞形態(tài)良好，但從華通膠內(nèi)爬出足夠細胞的時間較長，污染的幾率明顯上升，且傳代時組織塊不易分離；酶消化法分別比較了膠原酶Ⅰ，膠原酶Ⅱ及膠原酶Ⅰ+ 0.25﹪胰蛋白酶的消化效率，發(fā)現(xiàn)5 h組織塊基本消化完畢，與郝世凱等[10]研究結果相似，消化后得到的UC-MSC經(jīng)3 ～ 5 d培養(yǎng)后即可在鏡下看到明顯的細胞增殖，同一時間點消化收集細胞得到的細胞數(shù)經(jīng)統(tǒng)計學分析提示膠原酶Ⅱ消化法得到的細胞數(shù)較多。由此可知用酶消化法與直接貼壁法相比不易污染且獲得的細胞數(shù)更多，而酶消化法中膠原酶Ⅱ消化得到的UC-MSC細胞數(shù)最多且培養(yǎng)視野最干凈。

目前培養(yǎng)UC-MSC的培養(yǎng)基中多存在胎牛血清、臍血血清等血清成分[11]，UC-MSC在血清存在的培養(yǎng)基中生長良好，但由于臍血血清獲取的量有限，不能維持足夠的培養(yǎng)周期，胎牛血清中含有動物源性成分，可能攜帶動物來源的病毒等病原體，且血清中成分復雜，不能預測臨床應用中存在的風險。已有學者采用無血清培養(yǎng)基進行UC-MSC的培養(yǎng)，可以獲取形態(tài)良好的UC-MSC[12-13]，但用于臨床移植的培養(yǎng)基中最好無血清也不存在動物成分[14]。本實驗室比較了3種無血清及無動物來源的MSC培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)用MesenCult-ACF Medium（Stem Cell Technologies）的培養(yǎng)基獲得的細胞生長良好，形態(tài)最佳，且消化酶、酶中止劑及細胞凍存液均采用無血清及無動物成分的試劑，保證全程獲取UC-MSC的過程不存在人員以外的物質，保證臨床使用安全性。

本實驗室通過在GLP實驗室制備UC-MSC，獲得的UC-MSC起始數(shù)量較多，貼壁能力強，成簇狀或漩渦狀生長，生長增殖能力強，細胞活性無論在凍存前還是凍存后均在99﹪以上，生物學活性無明顯改變[15]，且在冰上放置24 h細胞活性仍達80﹪，細胞各種無菌檢測及病毒、支原體等檢測均為陰性，細胞免疫表型提示CD73、CD90、CD105等間質細胞標記高表達，陽性率達98﹪，CD34、CD45等造血干細胞標記基本不表達，陽性率低于1﹪，MHC-Ⅱ類分子標記HLA-DR表達陽性率低于2﹪，經(jīng)體外誘導分化可向成骨、成脂及成軟骨方向分化，以上特征均符合MSC的鑒定標準[16]。

本實驗室長期致力于干細胞的移植治療研究，通過本實驗室的臍帶酶消化法、無血清及無動物來源的培養(yǎng)體系的建立，臨床移植相關的細胞檢測鑒定，能夠為臨床移植提供良好的細胞供體。

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Generation of clinical grade umbilical cord mesenchymal stromal cells

Yuan Yanpeng, Wang Shuyan, Tang Xihe, Liu Zhongfeng, Zhang Yu, Chen Zhiguo.Cell Therapy Center, Xuanwu Hospital Capital Medical University, Beijing 100053, China

Corresponding author: Chen Zhiguo, Email:chenzhiguo@gmail.com

Objective To produce clinical grade umbilical cord mesenchymal stromal cells（UC-MSCs）with a umbilical cord in a GLP lab.Methods The umbilical cord was collected after delivery and the arteries, veins and blood cells were removed.Different treatment conditions were applied to compare the yield of UC-MSCs.The Wharton's jelly was cut to 1 mm3cubes, which were then either directly placed into an adhesive culture dish, or digested with different types of collagenases, followed by expansion in three types of serum free culture medium.After three passages in vitro, the cells were characterized and analyzed for cell viability, morphology, growth, sterility, endotoxin levels, chromosome karyotyping, surface antigen expression, and differentiation capacity.Data analysis between different groups was performed with coupled t test.Results Digestion with collagenase Ⅱor collagenaseⅠachieved the highest yield of MSCs（5.3×106±0.58/ml and 5.1× 106±0.57/ml, respectively, P = 0.07）, both higher than treatment with collagenaseⅠ + 0.25﹪trypsin（2.53×105±0.03/ml）and enzyme-free method..The culture medium appeared clear after collagenase Ⅱ digestion.MSCs cultured in Stemcell MesenCult-ACF Medium showed optimal cell morphology.Before freezing, the cell viability was 99.8﹪, and 99﹪ after freezing and thawing.The obtained MSCs were negative for bacteria or mycoplasma contamination, hepatitis B virus（HBV）,hepatitis C virus（HCV）, human immunodeficiency virus（HIV）, Mycoplasma pneumonia（MP）, Treponema pallidum（TP）, EB virus（EBV）, and cytomegalovirus（CMV）.The endotoxin levels were less than 1 EU as tested by ELISA.FACS results showed that more than 98﹪of the obtained cells were positive for CD73, CD90 and CD105, and more than 98﹪of the cells negative for CD34, CD45 and HLA-DR.The cells showed a normal karyotype and could be differentiated into adipocytes, osteoblasts and cartilage cells.Conclusion Clinical grade MSCs are generated in a GLP lab with optimized isolation/culture conditions.

Umbilical cord; Stromal cells; Collagenases; Culture media, serum-free; Cell differentiation

2016-09-26）

（本文編輯：陳媛媛）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2017.02.001

100053 北京，首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院細胞治療中心

陳志國，Email：chenzhiguo@gmail.com

袁艷鵬，王淑艷，唐璽和，等.臨床級臍帶間充質細胞制備及鑒定方法研究[J/CD].中華細胞與干細胞雜志（電子版），2017，7（2）：65-70.