毛囊源性黑色素細胞的生物學特性及其體外培養(yǎng)技術(shù)研究進展

樊蕊蕊劉菲琳郝德順張琪張瑩瑤鄭彤李士倫王鴻艷戚良晨 劉晉宇

毛囊源性黑色素細胞的生物學特性及其體外培養(yǎng)技術(shù)研究進展

樊蕊蕊1,2劉菲琳3郝德順4張琪1張瑩瑤1鄭彤1李士倫5王鴻艷6戚良晨7劉晉宇1

黑色素細胞（MC），是脊椎動物皮膚、毛發(fā)著色的主要細胞，主要存在于表皮基底層，這部分細胞約占基底細胞的10﹪；另外還有少量存在于毛囊、內(nèi)耳血管紋、眼睛脈絡(luò)膜等，它的功能或者數(shù)量的突變，會導致一系列難治性脫色素性疾病。目前針對表皮來源的MC研究已經(jīng)很多，體外培養(yǎng)技術(shù)也比較成熟，但表皮MC不能為毛發(fā)著色，毛囊源性MC能夠合成黑色素，且移植后能夠歸巢到皮膚，從而為色素障礙性疾病的治療提供理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。本文就毛囊源性MC的生物學特性，鑒定方法，以及體外培養(yǎng)技術(shù)的研究進展進行了綜述。

毛囊； 黑素細胞； 生物學； 細胞培養(yǎng)技術(shù)

自Sangiovanni在1819年首次描述了黑色素細胞（melanocyte，MC）形態(tài)結(jié)構(gòu)及其與皮膚色素沉著的關(guān)系以來，人們對MC的研究日益增多；1837年，Henle證實了MC與皮膚色素沉著的關(guān)系；1917年有研究學者首次將3,4-二羥本丙氨酸（DOPA），即多巴，引入了MC的研究，并證明多巴是MC內(nèi)酶的特異性作用底物，多巴染色方法為研究MC一個重要的手段[1]；1954年研究發(fā)現(xiàn)受損皮膚組織中有色素細胞存在，但由于缺乏對MC的標記方法，未能區(qū)分是臨近正常皮膚MC遷移而來，還是原本存在的非色素化的前體細胞的分裂、分化產(chǎn)生新的色素細胞所致[2]。隨著人們對MC認識的逐步深入，一些由MC的功能或數(shù)量改變引起的色素障礙性疾病逐漸找到了良好的治療手段，這也促使人們對MC的研究更為深入。

一、MC生物學特性

（一）胚胎發(fā)育過程

MC來源于神經(jīng)嵴干細胞，沿著神經(jīng)管通過體節(jié)逐步遷移至神經(jīng)節(jié)，不斷分化成黑素干細胞[3-4]。黑素干細胞在體節(jié)與真皮之間沿背外側(cè)途徑遷移到外胚層：皮膚、毛囊，并最終在外胚層分化為MC[5]，胚胎發(fā)育過程見圖1；另外，在形態(tài)上，每一個MC與其毗鄰的約36個角朊細胞密切關(guān)聯(lián)，形成一個相互作用的單位，MC的形態(tài)和功能是被角朊細胞以旁分泌的形式分泌生物因子來調(diào)節(jié)的。

（二）MC的形態(tài)

成熟的MC細胞體積較大，具有樹突狀結(jié)構(gòu)；不成熟的MC細胞體積較小，樹突結(jié)構(gòu)較為少見[7]。各個部位的MC形態(tài)也不同，首先在毛囊中，毛母質(zhì)區(qū)域的細胞不僅細胞的樹突較長而且體積也是最大的；其次在隆突部位MC的形態(tài)見圖2：細胞成兩極狀或三極狀，細胞的樹突相對較小，且胞體積大小也不如前者，細胞核折光性較強，比毛囊間充質(zhì)干細胞形態(tài)要窄細一些；最后在皮膚的表皮層基底膜中的MC體積則介于前兩者之間[8-9]。

圖2 相差顯微鏡下觀察到的隆突部位毛囊中毛囊源性黑色素細胞（×100）

圖1 黑色素細胞的胚胎發(fā)育過程示意圖[6]

（三）MC的功能

毛囊中MC有生長期、退行期和靜止期，MC在周期循環(huán)中不同時期具有不同的功能。處于生長期的MC可以合成黑色素，不僅能夠使皮膚、毛發(fā)著色，而且可以有效抵抗自由基和活性氧對皮膚DNA的損傷[10]；而退行期和靜止期的MC不能合成黑色素顆粒，不能為皮膚和毛發(fā)著色，隨著生長周期的循環(huán)進入生長期，作為MC的儲存庫，可以為生長期毛囊提供黑色素干細胞，進而分化為成熟的MC，當白癜風色素再生時，能被激活，從隆突部位向表皮移動，至色素脫失處，使皮膚著色[11-12]。

（四）MC參與毛囊周期循環(huán)

脊椎動物毛發(fā)的生長包括兩部分：（1）毛干的生長；（2）色素合成，這個過程需要毛囊干細胞與黑色素干細胞協(xié)同作用[13]。毛囊隆突區(qū)內(nèi)黑色素干細胞是毛發(fā)著色的來源細胞[6]。毛囊中的MC是隨著毛囊的生長周期的循環(huán)不斷發(fā)生增殖和分化的，參與到整個毛囊周期性循環(huán)過程：即在毛囊生長的休止期間，隆突部位存在著未成熟的MC，但是隨著毛囊生長期的進入，該部位的大部分MC向下遷移，增殖并且逐漸成熟，最終定位于真皮毛乳頭上方；隆突部位一小部分MC仍處于未成熟的狀態(tài)[14-15]，過程如圖3所示，這部分MC的酪氨酸酶表達受阻，長期處于未激活的狀態(tài)[16]，不合成黑色素。這類MC即為黑色素干細胞，其主要功能是為表皮和毛囊提供種子細胞來源，黑色素干細胞功能缺失，使得色素合成不足，將會導致灰、白色毛發(fā)的產(chǎn)生。

（五）MC遷移過程

毛囊隆突區(qū)細胞具有多向分化潛能，不僅能向下遷移形成毛球部，而且能向上遷移參與表皮的維持和毛囊的形成。有研究認為該類細胞可能經(jīng)過兩個獨立的遷移分化途徑，即隆突區(qū)-表皮途徑和隆突區(qū)-毛發(fā)途徑[17-18]，如圖4所示，這一觀點也解釋了毛囊中的MC如何使得皮膚和毛發(fā)著色的。

（六）MC分布以及各部位的特性

毛囊源性MC在生長期的分布可以分成以下幾個部分：（1）漏斗區(qū)MC，該區(qū)細胞與表皮中MC相似，有樹突狀結(jié)構(gòu)形成；（2）隆突區(qū)MC，該部分細胞具有較強的增殖能力，樹突相對較小，無黑色素合成，表達gp100。未活化的無色素性黑素細胞（amelanotic melanocytes，AMMC）不僅數(shù)量多，且胞體小，多數(shù)程兩極狀結(jié)構(gòu)，不能合成黑色素顆粒，但其體外培養(yǎng)貼壁率高，增殖活躍，AMMC主要存在于生長期毛發(fā)外毛根鞘（ORS）中，多巴反應(yīng)陰性的AMMC在一定條件下可以轉(zhuǎn)化為多巴反應(yīng)陽性的細胞[19]；（3）毛乳頭上方的MC有較弱的增殖能力，是唯一將合成的黑色素顆粒轉(zhuǎn)移至毛干的一類細胞；（4）毛球外側(cè)的MC具有較強的增殖能力，但無黑色素合成[20]。也有研究發(fā)現(xiàn)毛囊漏斗部和毛球部位MC比毛囊中部皮脂腺以下的MC體積大，NK1/β抗體反應(yīng)更強，毛囊中部MC的樹突很少，推測可能是黑素前體細胞[21]。

（七）黑色素顆粒的合成

MC的一個重要特點是合成黑色素小體，黑色素顆粒主要是在黑色素小體生產(chǎn)和存儲的，這也是MC重要的生理功能[22]。在MC內(nèi)的黑色素是以酪氨酸為原料，經(jīng)酪氨酸酶催化作用后形成，酪氨酸酶是該過程的關(guān)鍵限速酶。再者，多巴（DOPA）、TYRP-1、TYRP-2、MITF 等多種蛋白均與酪氨酸酶活性功能息息相關(guān)，且相互之間是相輔相成的關(guān)系，例如：L-DOPA可以增強酪氨酸酶的活性，而TYRP-1又可以穩(wěn)定酪氨酸酶，黑色素小體具有吞嗟和分泌功能，稱之為溶酶體相關(guān)細胞器[23-24]。依據(jù)黑色素小體結(jié)構(gòu)特征，可以將黑色素小體的分化過程分為四個主要的階段：（1）第1期，黑色素小體生長基質(zhì)的形成階段，無黑色素顆粒合成、分泌[25][36]；（2）第2期，基本完全形成了黑色素小體基質(zhì)，褐黑素小體表面開始有和色素顆粒沉積，真黑素小體上還沒有[25][36]；（3）第3期，真黑素小體和褐黑素小體的表面基本均有黑色素顆粒沉積[25][36]；（4）第4期，黑色素小體趨于成熟化，并且有大量黑色素顆粒合成[25][36]。

圖3 毛囊源性黑色素細胞的周期循環(huán)示意圖[14]

圖4 黑色素細胞分化遷移路徑[17]

（八）黑色素顆粒的轉(zhuǎn)運

黑色素在MC內(nèi)合成后，通過MC的樹突結(jié)構(gòu)以黑色素顆粒的形式轉(zhuǎn)運至周圍表皮和生長期毛基質(zhì)角朊細胞中去，黑色素轉(zhuǎn)運過程需要MC中微管驅(qū)動蛋白、動力蛋白和肌球蛋白c5a等的參與[25]。最近也有新的研究表明：黑色素的轉(zhuǎn)運受多種內(nèi)外性因素的影響，內(nèi)源性的例如：Manassantin B、Rab36、Mregdsu基因的產(chǎn)物-Melanoregulin；外源性因素如：氧化應(yīng)激以及紫外線的照射等因素均會影響該過程[27-28][30]。

（九）MC標志物的闡述

1.MITF（microphthalmiaassocitate transcription factor）[28]：又稱小眼畸形關(guān)聯(lián)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，該基因MTIF是神經(jīng)嵴細胞定向分化發(fā)育成黑素細胞過程中最早發(fā)生的標志之一，能夠調(diào)控酪氨酸基因家族的表達，從而參與黑素生成的調(diào)控。Mitf蛋白有多種變體，其中MITF-M特異性地表達在MC以及黑素瘤細胞中，對于MC的存活、增殖、分化以及色素合成均有重要意義[31]。

2.c-Kit：在維持MC的存活中起關(guān)鍵作用，但并不具有特異性表達于MC的能力；MC的遷移依賴于細胞表面的c-Kit與Kit-R的結(jié)合完成[32]。

3.TYR：是催化黑色素合成過程的核心限速酶，能夠作用于多巴，促進合成黑色素顆粒[31][33]。

4.TRP-1、TRP-2：這兩種蛋白主要參與優(yōu)黑素生成，為優(yōu)黑素生成的速度調(diào)節(jié)器，合成黑色素的下游酶[34]。

5.S-100：有多種亞型，其中s100-A4型特異性表達于MC以及朗格漢斯細胞中，提示S-100一定程度上可以作為MC的標志蛋白。

6.PAX3：PAX3蛋白是轉(zhuǎn)錄因子，是PAX家族的一員，該基因最早在胚胎期的神經(jīng)嵴前體細胞中表達，參與黑色素母細胞分化遷移以及發(fā)育過程，而且均起到了較重要的作用，因此又被認為是特異性較強的因子。另外又因PAX3蛋白在MC瘤和痣中的表達量較正常皮膚MC明顯多，因此，PAX3已經(jīng)作為MC瘤鑒別的一種標記蛋白[34]。

7.g-100：g-100蛋白是前體黑素小體和成熟黑素小體上的膜分子蛋白，能夠被NKI-β抗體、HMB-45抗體識別，為以后做免疫組織化學、免疫熒光提供依據(jù)。

上述這些標志物是MC存在的標志，但是沒有哪一種標志物是毛囊源性MC絕對特異性標志物，所以結(jié)合以上幾種標志物才更具說服力，也可以為以后的鑒定工作提供依據(jù)。

二、毛囊源性MC體外培養(yǎng)方法

毛囊源性的MC獲取不易，增殖能力不強，且極易分化，基于這些生物學特性，進一步證實了其體外培養(yǎng)的難度，故在分離、體外培養(yǎng)技術(shù)方面仍需進一步探索和優(yōu)化。下面就目前常用的體外培養(yǎng)方法進行介紹，并對其中的方法和細節(jié)提出了改進優(yōu)化方案。

（一）細胞的分離

毛囊源性的MC體外培養(yǎng)的組織來源主要是人和小鼠的皮膚。人的皮膚可取自人類面部皮膚及包皮，其中包皮含有較多的MC；對于小鼠而言，一般取生長期小鼠的背部皮膚，2 cm2的皮膚即可滿足培養(yǎng)要求。依據(jù)前人研究成果發(fā)現(xiàn)，鼠MC比人的更容易分化，培養(yǎng)要求更高。目前，毛囊中MC的分離方法主要有：酶消化法以及組織塊貼壁法。對于酶消化法而言，依據(jù)溫度的不同，又有冷消化法和溫消化法之分[33]。

組織塊貼壁法，即是先在解剖顯微鏡下分離出單根毛囊置于孔板中，用解剖刀片劃開外毛根鞘，放上培養(yǎng)液培養(yǎng)，可有MC從毛囊中爬出。這類方法獲得的細胞純度相對較高，狀態(tài)較好，但由于毛囊中MC比例較少，故爬出的細胞較少，細胞密度不夠，不易存活，成功率較低。

酶消化法，所用的酶主要有胰蛋白酶、中性蛋白酶（dispase Ⅱ）、Ⅰ型膠原酶、Ⅳ型膠原酶幾種。取下組織塊，剪成小塊，用酶進行消化，若是37 ℃下消化即為溫消化法；若是4 ℃過夜消化即為冷消化法，輕輕吹打酶消化后的組織塊，經(jīng)過濾網(wǎng)過濾后，收集毛囊，再用胰蛋白酶消化毛囊，獲得毛囊細胞，用選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)即可獲得較純的MC。這類方法相對簡單，成功率較高，但是獲得的細胞較雜，純度不夠，其中的角朊細胞以及成纖維細胞不易去除，影響MC的存活以及增殖。已有研究成果顯示：先用中性蛋白酶消化皮膚，將表皮與真皮分離開來，再用Ⅰ型膠原酶，37 ℃下消化表皮，獲取MC。據(jù)研究表明：這種方法獲得的MC產(chǎn)量好和活力高，培養(yǎng)至第三代時純度已經(jīng)達到要求，可用于后期研究[35]。

（二）培養(yǎng)液的選擇

依據(jù)文獻報道MC細胞的培養(yǎng)液多種多樣，較常用的基本培養(yǎng)液有DMEM、RPMI1640、Ham、M254等。

1.Eagle培養(yǎng)液：Eagle研制成了細胞生長最低必需培養(yǎng)液MEM，是MC培養(yǎng)中較常用的培養(yǎng)液[33]。DMEM是在MEM基礎(chǔ)上經(jīng)修改而成的，適用于多種細胞系和組織的生長，也比較適合于MC的培養(yǎng)，但是需要再向其中加入多種生長因子以及高濃度的血清，因為MC細胞相比于毛囊間充質(zhì)干細胞而言，增殖能力不夠強，且比較容易分化，所以培養(yǎng)條件要求更高。而研究者多用其來培養(yǎng)皮膚表皮中的MC，因為表皮中的MC來源豐富，更容易培養(yǎng)，而對于原本研究就比較少的毛囊MC而言，培養(yǎng)條件遠遠不夠，在MC擴增上難以實現(xiàn)。

2.RPMI-1640培養(yǎng)液：該培養(yǎng)基能適應(yīng)包括MC在內(nèi)的多種細胞的生長，無論是原代和傳代培養(yǎng)效果都不錯，是目前細胞培養(yǎng)應(yīng)用最多的培養(yǎng)基之一[36]。但是，問題同樣存在，究其原因大同小異，毛囊中MC相比于毛囊中的其他類型細胞，例如：間充質(zhì)干細胞以及角朊細胞，是比較難以培養(yǎng)的，若是想獲得擴增后的毛囊MC用于皮膚、毛發(fā)色素障礙性疾病的移植治療更是困難重重，所以也注定了毛囊MC培養(yǎng)條件的苛刻，雖然有研究者使用該培養(yǎng)基培養(yǎng)出了MC，但是一般都是人表皮的MC，相比于人類，鼠的MC更容易分化，該培養(yǎng)基在MC的擴增和純化上還是難以達到要求。

3.Ham培養(yǎng)液：培養(yǎng)基的特點是在配方中加入了一定量的微量元素，可以在血清含量較少（2﹪ ～ 10﹪）的情況下培養(yǎng)細胞[37]。而MC的培養(yǎng)條件正是需要低血清培養(yǎng)，因為較高的血清濃度會促進成纖維細胞的增殖而抑制MC的增殖，不利于擴增，所以有研究者使用Ham培養(yǎng)液來獲取MC，但是效果也不理想，因為該培養(yǎng)基無促進MC增殖以及抑制其分化的細胞因子，所以擴增和純化MC是比較困難的。

4.M254培養(yǎng)液：是一種專門用來培養(yǎng)MC的培養(yǎng)基，可以直接作為選擇培養(yǎng)基使用[38]，一方面，其血清含量較低，避免了高血清濃度對于MC分化的影響；另一方面，眾所周知，在從毛囊中獲取MC的過程因為選擇的是酶消化法，所以獲得細胞還不夠純，混有大量的成纖維細胞，成纖維細胞的大量增殖會抑制MC的生長，而M254培養(yǎng)基中補充物HMGS內(nèi)含有TPA等抑制成纖維細胞增殖的細胞因子，從而有效地避免了此問題的出現(xiàn)；再者，M254培養(yǎng)基中還有很多能夠促進MC增殖的細胞因子，從而大大提高了細胞培養(yǎng)效率，這也是本實驗室在研究MC中使用M254培養(yǎng)基的重要原因。

皮膚組織中MC的數(shù)量較少，且細胞分裂能力弱，因此在體外培養(yǎng)時常須添加MC有絲分裂劑。1982年Eisinger利用在培養(yǎng)基中添加促癌劑十四烷酰佛波醇已酯（yetradecanoyl-phorbol-acetate，TPA），霍亂毒素（cholera toxin，CT）的方法，首次成功地在體外獲得了MC的分化培養(yǎng)，為研究色素代謝性疾病提供了實驗依據(jù)。目前常用的添加劑：有TPA、bFGF（basic fibroblast growth factor）、IBMX（3-isobutyl-1-methylxanthine）、CT（cholera toxin）、ET-3（內(nèi)皮素-3）[39]、基因素、干細胞因子還有2015年最新發(fā)現(xiàn)的雌激素、腎上腺髓質(zhì)激素（adrenal medulla，ADM）等在MC增殖方面有重要作用等。眾所周知，TPA是一種促癌因子，在MC培養(yǎng)中適當濃度TPA能促進MC貼附和增殖，抑制角質(zhì)形成細胞及成纖維細胞的貼附和生長；CT可促MC生長而抑制成纖維細胞的生長；IBMX是一種磷酸二酯酶抑制劑，抑制細胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷（cAMP）分解[40]，而CT可提高cAMP水平，是蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）的激動劑，故通過cAMP／PKA信號途徑刺激MC增殖，IBMX和CT可加強TPA的作用[40-41]；bFGF是MC重要的促生長因子，它可促進MC增殖；粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（GMCSF），是由角朊細胞分泌的，據(jù)文獻報道其可以抑制角質(zhì)形成細胞，促進MC的生長[41]；基因素（Geneticin），可選擇性殺死快速增殖的成纖維細胞[42]；外源性雌激素乙烯雌酚（DES），在10-8～ 10-6mol/L的濃度會增強酪氨酸酶的活性，繼而促進黑色素顆粒的合成，最終提高MC的增殖能力[43]；腎上腺髓質(zhì)激素，可以促進MC樹突的形成以及黑色素的合成以及積累，進而促進其增殖[44]。

上述幾種添加劑是一把雙刃劍，其在促進MC分裂的同時，也使得培養(yǎng)的細胞存在一定毒性，例如：CT仍是一種有毒素的生物制劑，不安全隱患依然存在；最近有研究者發(fā)現(xiàn)一些組合后的生長因子，如堿性成纖維細胞生長因子與肝細胞生長因子的組合使用以及內(nèi)皮素-1與擴散因子的組合使用等在不添加其他物質(zhì)的情況下，也能引起MC的大量增殖[44]，具有更廣闊的應(yīng)用前景。以下介紹幾種組合以及培養(yǎng)的細胞形態(tài)：

1.鋪角朊細胞為滋養(yǎng)層，用絲裂霉素C處理之后將原代MC種植于其上，用RPMI培養(yǎng)基加入TPA、CT，因為角朊細胞會分泌一些可溶性因子以及外泌體，促進MC的生長以及增殖[10][37]，所以這種方法培養(yǎng)的MC胞核遮光性更強，增殖能力也會更強。

2.MCD153培養(yǎng)基+CT+SCF+ ET+bFGF：該條件下的細胞多具有2 ～ 3個樹突，胞體較大，細胞形態(tài)呈三角形或兩極狀，少量具有多樹突[39]。

3.Hamf-12-DMEM培養(yǎng)基+CT+bFGF+雙抗+胎牛血清+基因素：該條件下的MC形態(tài)上呈梭型，胞體較小，邊緣不很清晰，黑素顆粒少，胞體色淡，但生長的速度較快，多數(shù)細胞處于分裂期[35-36]。

4.HamF-12-DMEM培養(yǎng)基+TPA+IBMX+CT+雙抗+胎牛血清+基因素：該系統(tǒng)下的MC呈多極性，細胞樹突多在3個以上，胞體較大，色深，黑素顆粒多，邊界清晰，生長速度較慢，多數(shù)呈現(xiàn)其功能性[36][38]。

5.M254完全培養(yǎng)基：內(nèi)含有TPA，bFGF，ITS可以消除成纖維細胞以及角朊細胞，培養(yǎng)的細胞多數(shù)為兩極狀，內(nèi)有黑色素顆粒的合成。在M254完全培養(yǎng)基條件下的細胞，不僅增殖能力較強而且具有合成黑色素顆粒的功能，符合移植要求，應(yīng)用潛能較大，目前應(yīng)用也較多，但是價格昂貴，一定程度上限制了其應(yīng)用。

（三）鑒定方法

由于MC本身缺乏特異性較強的標志物，并且就目前研究水平而言，對于MC和其前體細胞—黑色素干細胞很難鑒別開來，所以在鑒定方法上學者們并不統(tǒng)一，且國內(nèi)外研究者們鑒定側(cè)重點也有所不同。下面就幾種常用的鑒定方法進行總結(jié)：

1.從形態(tài)上：首先，在相差顯微鏡下觀察到的MC應(yīng)該是兩極或者三極狀的，胞核折光性較強，比毛囊間充質(zhì)干細胞形態(tài)要窄細一些。其次，經(jīng)典的染色即L-DOPA染色，這種方法的原理是利用酪氨酸酶跟其反應(yīng)底物多巴進行反應(yīng)，會有棕色或者黑色顆粒呈現(xiàn)。再者，可以利用透射電鏡來觀察MC胞漿里的黑色素顆粒，可以觀察到不同階段的黑色素顆粒[45-46]。

2.在mRNA水平上：首先是RT-PCR，MC內(nèi)有特異性基因，如：MITF、TRP1、TYR、TRP2、Kit等，如果能夠PCR出目的條帶，一定程度上也能說明問題。再者，實時定量PCR，該方法比RT-PCR更靈敏，且能反映趨勢，更能說明這一點。

3.在蛋白水平上：首先，最精確、最重要的就是Western Blot方法，它是一種既能定性又能半定量的研究方法[47]。如果細胞中能夠表達MC的標志蛋白，如：MITF蛋白，TYR，TRP1，TRP2，S-100蛋白，g-100蛋白，再結(jié)合細胞的形態(tài)，基本確定MC。其次，免疫熒光染色，是利用熒光標記的抗體檢測MC抗原：MITF蛋白，TYR，TRP1，TRP2，S-100蛋白，g-100蛋白的表達。再者，還有免疫細胞化學染色，利用的也是抗原-抗體特異性結(jié)合的原理，采用生物素與底物反應(yīng)呈現(xiàn)顏色來顯示抗原的存在。最后，還有細胞流式術(shù)來定量檢測MITF蛋白，TYR，TRP1，TRP2，S-100蛋白，g-100蛋白表達比例和強度。雖然MC鑒定方法很多，但是沒有哪一種方法能獨立確定MC，采用多種方法聯(lián)合鑒定MC的方法更具有說服力。

（四）影響MC分離獲取成功的因素分析

通過查閱大量的文獻以及本實驗室研究經(jīng)驗，總結(jié)了如下影響MC分離獲取成功的因素：

首先，取材方面，若是取人毛囊中的MC，最好是頭皮，毛囊豐富；若是鼠，最好是處于生長期的乳鼠背部皮膚，因為生長期毛囊較活躍，MC處于分裂期，更易培養(yǎng)[48]。

其次，取下皮膚后最好選用酶消化法，對所用酶的種類、濃度以及消化的時間、溫度的控制也很重要，要避免消化不夠以及消化過分，損害MC。再者，接種細胞的密度也尤為重要，密度太小或者太密，MC均不易存活，需要仔細摸索。

再次，培養(yǎng)基以及因子組合的選擇也應(yīng)該引起重視。以上介紹了多種基礎(chǔ)培養(yǎng)基以及因子，各有利弊，也需仔細考慮。還有，血清的濃度也會影響細胞的生長，血清濃度太高，MC很容易分化，生長旺盛的成纖維細胞會慢慢地擠掉MC，最終導致MC越來越少。

最后，傳代培養(yǎng)過程中，胰酶是否需要加EDTA以及消化時間的長短也會嚴重影響MC的狀態(tài)，因為MC相比成纖維細胞對胰酶更為敏感，所以建議消化時間縮短，以提高MC的存活率，減少細胞毒性。

三、問題與展望

目前，色素障礙性疾病尤其是白癜風，白化病以及人在衰老過程中的白發(fā)癥不僅影響美觀使得人們自信心不足，而且已經(jīng)嚴重影響到人們的身心健康，這類疾病一定程度上已經(jīng)被歸類于難治性疾病，傳統(tǒng)上的治療方法例如：激素治療、放射治療，以及免疫調(diào)節(jié)治療甚至于皮膚移植，這些方法不僅存在著免疫排斥等的風險，而且治療效果也不佳。所以，細胞移植法應(yīng)運而生，極大程度上彌補了傳統(tǒng)療法的不足，還有著自身無可替代的自體來源的優(yōu)勢，大量的實驗研究已證明自體MC移植一定程度上對于色素障礙難治性疾病的治療有促進作用，所以這個領(lǐng)域已成為再生醫(yī)學研究的熱點。HF作為一種重要、豐富且容易獲取的組織，目前研究的也越來越熱，HF-MCs與皮膚表皮來源的MC相比有很大的優(yōu)勢，因為表皮內(nèi)MC也是由毛囊內(nèi)遷移分化而來的，比表皮內(nèi)的MC增殖活性以及合成黑色能力更強；再者HF具有周期性，故其內(nèi)MC也會隨著HF周期循環(huán)而不斷更新，MC的周期性循環(huán)過程解釋了人類從青年到衰老過程中皮膚和毛顏色變化的原因，這一點在表皮MC內(nèi)是不具備的。

目前體外培養(yǎng)表皮中MC的技術(shù)已經(jīng)相對成熟，而毛囊源性MC的技術(shù)目前仍存在著困難，因為這是由毛囊源性MC本身的生物學特性決定的，其不僅在毛囊中含量極少，增殖能力較弱，且比較容易分化，所以對培養(yǎng)條件要求較高。研究表明，在毛囊源性MC的培養(yǎng)過程中，首先是純化問題，在大多數(shù)的毛囊源性MC培養(yǎng)過程中都混雜有成纖維細胞或者角朊細胞，而這兩種細胞增殖能力較MC強，所以更增加了MC的培養(yǎng)難度；其次，是毛囊源性MC的增殖問題，其增殖夠不夠強，雜細胞的生長過旺，直接抑制MC的增殖；最后，是毛囊源性MC的易分化問題，相比于人類表皮MC，毛囊源性MC更容易老化，這一點對于細胞移植治療色素障礙性疾病是致命的，所以以上三點亟待解決。

體外培養(yǎng)毛囊源性MC有助于更深入的了解其生物學特性，開闊了MC的應(yīng)用前景，在后期的研究工作中也具有一定指導價值，為MC的增殖和色素代謝以及色素性疾病研究等提供了重要的細胞模型，也為白癜風、灰發(fā)癥等色素障礙性疾病的治療提供新思路。

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Progress in biology and in vitro culture of hair follicle-derived melanocytes

Fan Ruirui1,2, Liu Feilin3, Hao Deshun4, Zhang Qi1, Zhang Yingyao1, Zheng Tong1, Li Shilun5, Wang Hongyan6, Qi Liangchen7, Liu Jinyu1.1Department of Toxicology, School of Public Health,4Department of Pathology, School of Basic Medical Sciences, Jilin University, Changchun 130021, China;2Department of Pathology, The First Hospital of Nanping, Nanping 353000, China;3The Second Affiliated Hospital of Jilin University, Ophthalmic hospital, Changchun 130021, China;5Department of Oncology, Lishu First People's Hospital, Siping 136500, China;6Department of Obstetrics and Gynecology, Jilin General Hospital of Armed Police Force, Changchun 130021, China;7Department of Thoracic Surgery, China-Japan Friendship Hospital, Jilin University, Changchun 130021, China

Corresponding author: Liu Jinyu, Email:jy_liu@jhu.edu.cn

Melanocytes are main cells in the vertebrate for staining skin and fair and locate in hair follicles and epidermis during embryonic development.They account for about 10﹪of basal cell.There are a small number of melanocytes in hair follicle, choroid membranes and vasa aurisinternae.The decrease of cell number or dysfunction of melanocytes will results in pigment disorders.Research about melanocytes in epidermis of skin is abundant and the culture technique is mature.However, no theory is widely accepted for hair color fading.Melanocytes in hair follicles can produce melanin to protect the skin from ultraviolet light radiation, and home to the skin posttransplant.These evidences provide theoretical and experimental basis for the treatment of pigment disorder.We review the current progress and future direction about the biological characteristics and cultivation technique of hair follicle-derived melanocytes.

Hair Follicle; Melanocytes; Biology; Cell culture techniques

2016-10-07）

（本文編輯：陳媛媛）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2017.02.010

130021 長春，吉林大學公共衛(wèi)生學院毒理教研室1，基礎(chǔ)醫(yī)學院病理教研室4；353000 南平，福建醫(yī)科大學附屬南平市第一醫(yī)院病理科2；130021 長春，吉林大學附屬第二醫(yī)院院眼科3；136500 四平，梨樹縣第一人民醫(yī)院腫瘤科5；130021 長春，武警吉林總隊醫(yī)院婦產(chǎn)科6；130021 長春，吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院胸外科7

劉晉宇，Email：jy_liu@jlu.edu.cn

樊蕊蕊，劉菲琳，郝德順，等.毛囊源性黑色素細胞的生物學特性及其體外培養(yǎng)技術(shù)研究進展[J/CD].中華細胞與干細胞雜志（電子版），2017，7（2）：117-123.