兩種人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞源外泌體分離方法的比較

劉高米洋潘興華和法蓮陸容劉菊芬何潔王紅陽

兩種人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞源外泌體分離方法的比較

劉高米洋1,2潘興華2和法蓮3陸容4劉菊芬2何潔2王紅陽1

目的 探索人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（hUMSCs）來源的外泌體的最佳分離條件并對其進(jìn)行生物學(xué)鑒定。方法 無血清培養(yǎng)法培養(yǎng)hUMSCs，培養(yǎng)上清中收集外泌體，超高速離心法（ult-exo）和沉淀法分離外泌體（pri-exo），Western Blot檢測外泌體標(biāo)志性蛋白CD63、HSP70、HSP90和陰性對照蛋白TAPA1，透射電鏡觀察分離所得外泌體生物學(xué)形態(tài)，高清晰質(zhì)譜分析外泌體包裹蛋白種類。結(jié)果 無血清培養(yǎng)法能夠在不改變細(xì)胞生物學(xué)形態(tài)的條件下獲取hUMSCs源外泌體，透射電鏡下可見超高速離心可以獲得具有典型雙層膜結(jié)構(gòu)的外泌體，大小在100 nm左右，而沉淀法分離所得產(chǎn)物不具有典型的外泌體形態(tài)表征，大小在30 nm左右；Western Blot結(jié)果表明超高速離心法所得外泌體CD63、HSP70、HSP90均呈現(xiàn)陽性，陰性對照蛋白TAPA1呈現(xiàn)陰性，沉淀法只能檢測到HSP90；高清晰質(zhì)譜檢測出超高速離心法分離所得外泌體有169種蛋白，沉淀法有102種，共有蛋白79種。結(jié)論 超高速離心法和沉淀法所得外泌體在蛋白標(biāo)志物、生物學(xué)形態(tài)和內(nèi)含蛋白種類均有差別，本實驗結(jié)果提示分離hUMSCs源外泌體超高速離心法優(yōu)于沉淀法。

臍帶； 間質(zhì)干細(xì)胞； 外泌體； 分離； 鑒定

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一種來自中胚層間充質(zhì)，具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞，主要存在于全身結(jié)締組織和器官間充質(zhì)[1-2]中。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUMSCs）從分娩后的廢棄組織臍帶中分離和培養(yǎng)，臍帶中的華通氏膠不但含有豐富的MSCs，且其來源的細(xì)胞在形態(tài)學(xué)、擴(kuò)增能力、分化功能以及表面標(biāo)志物等生物學(xué)鑒定結(jié)果都符合間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)[3]，是目前最具有轉(zhuǎn)化應(yīng)用前景的間充質(zhì)干細(xì)胞。研究表明，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞能夠修復(fù)損傷組織[4]，改善或者治療多種免疫系統(tǒng)疾病[5]，但其長期植入體內(nèi)存在細(xì)胞分化不良和潛在促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)化的缺點[6]，限制了hUMSCs的臨床轉(zhuǎn)化的步伐。

近年來，研究發(fā)現(xiàn)外泌體（exosomes）是由活細(xì)胞釋放，直徑30 ～ 100 nm，含有來源細(xì)胞的胞膜、蛋白質(zhì)、miRNA和lncRNA等成分，通過膜融合進(jìn)行物質(zhì)傳輸和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[7]。Lai等[8]發(fā)現(xiàn)MSCs分泌的外泌體中包含多種活性蛋白質(zhì)參與細(xì)胞結(jié)構(gòu)的維持、運動、信息交流以及組織的修復(fù)與再生。因此推測，MSCs的外泌體有可能成為一種替代細(xì)胞治療的新手段和藥物載體。研究表明：MSCs是目前發(fā)現(xiàn)分泌外泌體能力最強(qiáng)的細(xì)胞[9]，MSCs源外泌體能夠保護(hù)腎臟，修復(fù)藥物、腎切除等導(dǎo)致的腎損傷[10]，減輕心肌缺血/再灌注（I/R）損傷[11]，保護(hù)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的肺損傷[12]，通過轉(zhuǎn)運miRNA-133b到神經(jīng)組織以保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)[13]，并通過轉(zhuǎn)運多種抗炎因子起到免疫調(diào)節(jié)的作用[14]。但外泌體的分離鑒定方法依然是限制外泌體應(yīng)用的最大難點，國內(nèi)相關(guān)的研究也相對較少，因此本研究對比兩種分離純化hUMSCs來源外泌體的方法，旨在為MSCs來源外泌體的臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

材料與方法

一、材料

DMEM/F12培養(yǎng)基（美國BI公司），胎牛血 清（美 國BI公 司），Anti-CD63 antibody、Anti-CD9 antibody、Anti-hsp90 antibody、anti-hsp70 antibody、Anti-TAPA1 antibody、兔anti Mouse IgG H&L（HRP）、羊 anti Rabbit IgG H&L（HRP）（美國Abcam公司），牛血清白蛋白（美國Sigma公司），BCA蛋白定量試劑盒（美國Thermo fisher公司），快速銀染試劑盒（中國碧云天公司），百萬層級層流超凈工作臺（SW-CL-2F型，蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司），細(xì)胞培養(yǎng)37℃，CO2孵箱（美國Thermo公司），電泳槽（美國Bio-rad公司），倒置相差顯微鏡（日本奧林巴斯公司），多功能酶標(biāo)儀（美國Biotek公司），超高速離心機(jī)（日本日立公司），exosome isolation kit（美國101bio公司）。

二、主要方法

1.hUMSCs分離和培養(yǎng)：在產(chǎn)婦及其家屬知情同意并通過醫(yī)院倫理審查（編號：2012009）情況下，取本院足月剖腹產(chǎn)新生兒臍帶，產(chǎn)婦無傳染性疾病，胎兒無先天性疾病和畸形。生理鹽水反復(fù)沖洗以去除臍帶殘留血液。將臍帶剪碎后轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中，用含20﹪FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，次日補(bǔ)液，3 d后換液，7 d后觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，達(dá)到80﹪融合后傳代培養(yǎng)。

2.hUMSCs源外泌體的提取和分離：待第4 ～6代huMSCs融合率為80﹪～ 90﹪時，無血清培養(yǎng)24 h后收集培養(yǎng)上清4 ℃保存待用。超速離心法分離外泌體如下：4 ℃條件下2 000×g離心10 min取上清液，10 000×g離心30 min取上清液，100 000×g離心90 min，小心棄上清液，收集底部沉淀用PBS溶解稀釋后，再次100 000×g離心90 min,洗滌1次，棄上清液，PBS重懸，-80 ℃凍存。沉淀法按照101bio試劑盒說明書操作，純化后所得外泌體-80 ℃凍存。

3.外泌體生物學(xué)形態(tài)觀察：銅網(wǎng)上加入樣本10 μl，吸附1 ～ 2 min，濾紙條垂直于液面吸走液體，干燥1 min，加入染色劑醋酸雙氧鈾染色1 min，干燥后透射電鏡下觀察形態(tài)并拍照。

4.外泌體蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析：外泌體中加入SDT裂解液冰上裂解15 min，煮沸10 min，超聲破碎（25 Hz）1 min，13 680×g四度離心10 min，取上清BCA法定量蛋白，F(xiàn)ASP法酶解蛋白，NanoDrop定量肽段，隨后進(jìn)行LC-MS/MS分析。

5.銀染檢測EXO蛋白：SDT或者RIPA裂解液將外泌體冰上裂解并超聲，4℃ 13 680×g離心10 min去除沉淀，收集上清獲得外泌體蛋白樣本，BCA法定量后取3 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，隨后按照碧云天快速銀染試劑盒提供的使用說明書操作，拍照并保存。

6.Western Blot：去除細(xì)胞培養(yǎng)基后用預(yù)冷的PBS洗2次，加適量RIPA裂解液冰上裂解10 min，超聲破碎細(xì)胞（25 Hz，1 min），13 680×g四度離心10 min；取上清BCA法定量蛋白；將配置好的蛋白樣本至于100 ℃恒溫加熱器上變性10 min后冰上放置；進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳；半干轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜；室溫封閉1 h；TBST洗膜2 ～ 3次，每次5 ～ 10 min ；室溫孵育一抗2 ～ 3 h或者4 ℃孵育過夜，回收抗體后，TBST洗3次，每次5 min；室溫孵育二抗1.5 ～ 2 h或者4 ℃孵育過夜，回收抗體后，TBST洗3次，每次5 ～ 10 min；ECL法顯色，拍照，保存數(shù)據(jù)。

結(jié) 果

一、hUMSCs的分離培養(yǎng)

組織塊直接貼壁法培養(yǎng)hUMSCs次日即可看見少許細(xì)胞貼壁（圖1a），3 ～ 5 d后可見細(xì)胞爬出（圖1b），傳代后的細(xì)胞轉(zhuǎn)移時呈纖維樣（圖1c），稠密呈漩渦狀生長（圖1d）。

二、hUMSCs源外泌體生物學(xué)形態(tài)

為了不破壞外泌體原有形態(tài)并保持其典型雙層膜結(jié)構(gòu)，將分離得到的外泌體取30 μl分裝存于4 ℃?zhèn)溆茫ú怀^3 d）。按照負(fù)染法將超離法和沉淀法所得外泌體進(jìn)行制樣，透射電鏡下觀察2種不同分離方法所得外泌體形態(tài)可見，超速離心法分離所得外泌體直徑為100 nm左右，具有典型的杯狀結(jié)構(gòu)（圖2a），沉淀法所得外泌體直徑為30 nm左右，形態(tài)為規(guī)則的圓形，不能觀察到典型的杯狀結(jié)構(gòu)（圖2b）。

三、銀染檢測exosome蛋白

圖1 倒置顯微鏡下觀察人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的生長形態(tài)（×40）

銀染的靈敏度可達(dá)0.3 ng蛋白，而考馬斯亮藍(lán)染色是靈敏度為100 ng蛋白，因此我們采用銀染而非考馬斯亮藍(lán)染色檢測exosome蛋白。結(jié)果（圖3）顯示超速離心法（泳道1）所得外泌體蛋白豐度高于沉淀法（泳道2），在分子量20 kD以下蛋白沉淀法中基本檢測不到。

四、Western Blot 檢測exosome蛋白標(biāo)志物

電鏡和銀染結(jié)果共同提示超速離心法和沉淀法所分離產(chǎn)物中含有多種蛋白質(zhì)，因此為進(jìn)一步明確所得產(chǎn)物是外泌體而非其他莫型囊泡結(jié)構(gòu)，行Western Blot 檢測所得蛋白樣本是否含有外泌體陽性標(biāo)志物。圖4提示超高速離心法（泳道1）可以檢測到外泌體陽性標(biāo)志物CD63，HSP70，HSP90而陰性對照TAPA1則未被檢出，沉淀法（泳道2）只能檢出HSP70和HSP90，同時能雜出陰性對照TAPA1。

五、質(zhì)譜分析外泌體蛋白組

本研究通過高精度質(zhì)譜對超離法和沉淀法所得外泌體蛋白組進(jìn)行定性定性分析，超離法（圖5a）能夠檢測到169種蛋白質(zhì)，沉淀法（圖5b）能夠檢出102種蛋白質(zhì)；對比可得兩種分離方法所得外泌體中共有的蛋白質(zhì)為79種（圖5c）。將質(zhì)譜檢測結(jié)果用DAVID數(shù)據(jù)庫分析uc-exo蛋白有148種蛋白被注釋（表1附后），pri-exo蛋白有74種被注釋（表2附后）。

圖2 電鏡下觀察兩種方法得到的外泌體形態(tài)（×67 000）

圖3 銀染檢測外泌體蛋白豐度

圖4 Western Blot檢測外泌體標(biāo)志

圖5 高清晰質(zhì)譜分析外泌體蛋白組

討 論

外泌體的研究國內(nèi)尚處于起步階段，其分離方法是目前制約外泌體研究和應(yīng)用轉(zhuǎn)化的最主要因素，有研究表明細(xì)胞在不同的狀態(tài)分泌的外泌體內(nèi)含物不同[15]，不同的分離方法得到的外泌體理化性質(zhì)也不同[16]，這導(dǎo)致了外泌體研究存在大量不可控性和難重復(fù)性。因此本研究針對hUMSCs來源的外泌體，利用最經(jīng)典的多步超速離心法和目前最常見的基于PEG沉淀法的外泌體分離試劑盒對外泌體進(jìn)行分離和鑒定，為hUMSCs源外泌體的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用提供數(shù)據(jù)。

本研究首先通過組織塊貼壁法獲得原代hUMSCs，利用其貼壁生長特性多次傳代培養(yǎng)獲得純化的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，顯微鏡觀察3代到6代的hUMSCs，可見典型的漩渦生長特征，并進(jìn)行表面抗原鑒定，符合間充質(zhì)干細(xì)胞特征。因此認(rèn)為上述方法分離純化得到的細(xì)胞為hUMSCs。為排除常規(guī)培養(yǎng)體系中胎牛血清中外泌體的影響，待hUMSCs貼壁生長融合率達(dá)70﹪時，去除原有培養(yǎng)基，PBS沖洗殘留培養(yǎng)基上清，換為無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)hUMSCs 24 h后收集無外源外泌體污染的培養(yǎng)上清。采用多步超速離心法和基于沉淀法的試劑盒分別提取外泌體，投射電鏡對其形態(tài)學(xué)觀察可見，多步超速離心法分離純化得到的外泌體直徑約100 nm左右，其直徑遠(yuǎn)大于試劑盒分離純化得到的外泌體（直徑約30 nm左右），超離所得外泌體可觀察到典型的不規(guī)則立體的杯托樣雙層膜結(jié)構(gòu)，而試劑盒所得外泌體電鏡下觀察不到典型雙層膜結(jié)構(gòu)，呈現(xiàn)規(guī)則的圓形或橢圓形。為進(jìn)一步明確兩種分離方法所得外泌體內(nèi)含蛋白的差異，分別用銀染，Western Blot以及高精度質(zhì)譜對所得外泌體蛋白樣本進(jìn)行分析。銀染的結(jié)果提示超離法所得外泌體蛋白豐富程度顯著高于沉淀法，結(jié)合電鏡觀察結(jié)果可推測基于沉淀法的試劑盒分離純化所得外泌體可能在分離純化過程中受到破壞，損失了部分內(nèi)含物。為明確上述實驗分離所得產(chǎn)物是外泌體而非其他非外泌體囊泡，需要驗證所得產(chǎn)物是否含有外泌體標(biāo)志物同時不含有其他非外泌體囊泡標(biāo)志物。目前，國際上較多學(xué)者采用4次跨膜蛋白CD63、CD9、CD81、CD82以及熱激活蛋白家族的HSP90、HSP70還有多泡體生成相關(guān)蛋白Alix、TSG101為外泌體陽性標(biāo)志物，而TAPA1為其他非外泌體囊泡特有標(biāo)志物，因而被看做外泌體陰性標(biāo)志物。通過Western Blot檢測CD63，HSP90，HSP70和TAPA1可見，超離法分離所得外泌體CD63、HSP90，HSP70為陽性，TAPA1為陰性而試劑盒分離所得產(chǎn)物僅僅HSP90，HSP70表達(dá)且TAPA1為陽性，提示超離法能夠得到較試劑盒法更純的外泌體，試劑盒法所得產(chǎn)物可能不純或者外泌體被破壞。由于Western Blot能夠提供的數(shù)據(jù)有限，本研究采用高精度質(zhì)譜的方法進(jìn)一步分析外泌體蛋白組，以明確兩種方法所得外泌體中蛋白組分的異同。質(zhì)譜結(jié)果可見，本研究中hUMSCs源外泌體通過超離法分離純化能夠檢測出169種蛋白質(zhì)，基于沉淀法的試劑盒分離所得外泌體能夠檢測出102種蛋白質(zhì)，其中有79中蛋白被同時檢出。經(jīng)生物信息學(xué)分析表明這些蛋白質(zhì)參與了28種生物過程，包括外泌體生成和免疫，細(xì)胞相互作用等。在這些蛋白質(zhì)中，與治療作用相關(guān)的可能包括表面受體（PDGFRB、EGFR、PLAUR）、信號分子（RRAS/NRAS、MAPK1、GNA13/GNA12、CDC42和VAV2）、黏附分子（FN1、EZR、IQGAP1、CD47、整合素、LGALS1/LGALS3），熱激活蛋白家族成員（HSP90，HSP70，HSP60）和MSCs相關(guān)表面抗原。其中，蛋白酶體20S核心顆粒的7條α和7條β鏈MSCs-exo都有表達(dá)，且免疫蛋白酶體中的3個亞基表達(dá)水平較高，提示hUMSCs-exo可能具有損傷修復(fù)功能。數(shù)據(jù)表明，兩種方法所得外泌體的確有較大差異。綜合上述結(jié)果，不論是從形態(tài)結(jié)構(gòu)，蛋白水平還是蛋白豐度，超離法均優(yōu)于基于沉淀法的試劑盒。但超離法外泌體產(chǎn)量低，耗時長，對離心機(jī)要求高，若要進(jìn)行細(xì)胞實驗和動物實驗還需要對器材進(jìn)行滅菌處理，因而限制該方法的廣泛運用。

綜上所述，超離法和沉淀法相比，能夠獲得形態(tài)完整，純度更高的外泌體，但產(chǎn)量低，

工作量大；試劑盒法雖然需要的原材料較少，但存在破壞外泌體結(jié)構(gòu)，有雜蛋白污染的問題。

1 姚志成, 劉波.間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)肝再生的研究進(jìn)展[J].中華肝臟外科手術(shù)學(xué)電子雜志, 2016(03)：198-200.

2 馮文磊, 張猛, 徐芳潔, 等.共培養(yǎng)體系間充質(zhì)干細(xì)胞對同源內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖和血管形成的影響[J].醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報, 2015(03)：229-235.

3 Seshareddy K, Troyer D, Weiss ML.Method to isolate mesenchymallike cells from Wharton's Jelly of umbilical cord[J].Methods Cell Biol, 2008, 86(1)：101-119.

4 Weiss ML, Medicetty S, Bledsoe AR, et al.Human umbilical cord matrix stem cells： preliminary characterization and effect of transplantation in a rodent model of Parkinson's disease[J].Stem Cells, 2006, 24(3)：781-792.

5 Kalwitz G, Endres M, Neumann K, et al.Gene expression profile of adult human bone marrow-derived mesenchymal stem cells stimulated by the chemokine CXCL7[J].Int J Biochem Cell Biol, 2009, 41(3)：649-658.

6 Razzouk S, Schoor R.Mesenchymal stem cells and their challenges for bone regeneration and osseointegration[J].J Periodontol, 2012, 83(5)：547-550.

7 Théry C, Amigorena S, Raposo G,et al.Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids[J].Curr Protoc Cell Biol,2006, Chapter 3：Unit 3.22.

8 Lai RC, Yeo RW, Tan KH, et al.Mesenchymal stem cell exosome ameliorates reperfusion injury through proteomic complementation[J].Regen Med, 2013, 8(2)：197-209.

9 Yeo RW, Lai RC, Zhang B, et al.Mesenchymal stem cell： an efficient mass producer of exosomes for drug delivery[J].Adv Drug Deliv Rev, 2013, 65(3)：336-341.

10 He J, Wang Y, Sun S, et al.Bone marrow stem cells-derived microvesicles protect against renal injury in the mouse remnant kidney model[J].Nephrology (Carlton), 2012, 17(5)：493-500.

11 Arslan F, Lai RC, Smeets MB, et al.Mesenchymal stem cell-derived exosomes increase ATP levels, decrease oxidative stress and activate PI3K/Akt pathway to enhance myocardial viability and prevent adverse remodeling after myocardial ischemia/reperfusion injury[J].Stem Cell Res, 2013, 10(3)：301-312.

12 Zhu YG, Feng XM, Abbott J, et al.Human mesenchymal stem cell microvesicles for treatment of Escherichia coli endotoxin-induced acute lung injury in mice[J].Stem Cells, 2014, 32(1)：116-125.

13 Xin H, Li Y, Buller B, et al.Exosome-mediated transfer of miR-133b from multipotent mesenchymal stromal cells to neural cells contributes to neurite outgrowth[J].Stem Cells, 2012, 30(7)：1556-1564.

14 Mokarizadeh A, Delirezh N, Morshedi A, et al.Microvesicles derived from mesenchymal stem cells： potent organelles for induction of tolerogenic signaling[J].Immunol Lett, 2012, 147(1/2)：47-54.

15 Kim HS, Choi DY, Yun SJ, et al.Proteomic analysis of microvesicles derived from human mesenchymal stem cells[J].J Proteome Res, 2012, 11(2)：839-849.

16 Paolini L, Zendrini A, Di Noto G, et al.Residual matrix from different separation techniques impacts exosome biological activity[J].Sci Rep, 2016, 6：23550.

Comparisons of two isolation methods for exosomes from human umbilical cord mesenchymalstem cells

Liu-Gao Miyang1,2, Pan Xinghu2, He Falian3, Lu Rong4, Liu Jufen2, He Jie2, Wang Hongyang1.1International Co-operation Laboratory on Signal Transduction, Eastern Hepatobiliary Surgery Institute, Second Military Medical University, 225 Changhai Road, Shanghai 200438, China;2Cell Biological Therapy Center of Kunming General Hospital, Chengdu Military Region of Chinese People's Liberation Army, Cell Biological Medicine integrated Engineering Laboratory of State and Region of Yunnan Province, Kunming 650032, China;3Kunming General Hospital Clinical Collage of Kunming Medical University, Kunming 650032, China;4Department of Pediatric, Shanghai Children's Hospital, Shanghai 200062, China

Corresponding author: Wang Hongyang, Email:hywang@vip.sina.com

Objective To explore the best method of separating exosomes secreted by human umbilical cord mesenchymal stem cells（huMSCS）.Methods Exosomes were collected from huMSCS in the serum-free medium culture system by either ultracentrifugation or precipitation methods.Western Blot was used to detect TAPA1, CD63, HSP70, and HSP90 of exosomes.Tansmission electron microscope was used to observe exosome morphology, and proteome of exosomes isolated via the two methods was compared.Results Exosomes isolated via ultracentrifigation were around 100 nm in diameter under transmission electron microscopy and were positive for CD63, HSP70, and HSP90, while negative for TAPA1; exosomes isolated via 101 Kit were around 30 nm in diameter and were positive only for HSP90.High-resolution mass spectrometry（HRMS）revealed 169 proteins in exosomes isolated via ultracentrifigation while only 102 proteinswere identified in exosomes isolated via 101 Kit.Comparative analysis dates from HRMS indicated that there were 79 proteins shared by exosomes isolated by the two methods.Conclusion Exosomes isolated by ultracentrifugation and precipitation are different in biomarkers and proteome profile, and ultracentrifugation method is superior to precipitation method.

Umbilical Cord; Mesenchymal Stem Cells; Exosomes; Isolation; Identification

2016-08-02）

（本文編輯：陳媛媛）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2017.02.004

國家自然科學(xué)基金（81170316）

200438 上海，第二軍醫(yī)大學(xué)東方肝膽外科醫(yī)院國際合作生物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究中心1；650032 昆明，成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院細(xì)胞生物治療中心 干細(xì)胞與免疫細(xì)胞生物醫(yī)藥技術(shù)國家地方聯(lián)合實驗室 云南省細(xì)胞治療技術(shù)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點實驗室2；650032 昆明醫(yī)科大學(xué)成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院臨床學(xué)院3；200062 上海市兒童醫(yī)院兒科4

王紅陽，Email：hywang@vip.sina.com

劉高米洋，潘興華，和法蓮，等.兩種人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞源外泌體分離方法的比較[J/CD].中華細(xì)胞與干細(xì)胞雜志（電子版），2017，7（2）：81-86.