黑素小體在不同膚色皮膚類型角質(zhì)形成細胞內(nèi)的分布：黑素小體簇不是具有降解功能的細胞器

黑素小體是人體皮膚黑素細胞、視網(wǎng)膜色素上皮細胞和脈絡(luò)膜黑素細胞內(nèi)合成黑素的細胞器。雖然與溶酶體一樣都有溶酶體膜蛋白和水解酶，但黑素小體是起源于胞吞途徑的一種獨立的細胞器類型，且不能通過胞吞示蹤劑檢測到，另外其pH 值較高，因此被歸類為溶酶體相關(guān)細胞器。在表皮內(nèi)，將黑素小體轉(zhuǎn)運至鄰近的角質(zhì)形成細胞至少存在3 種機制：細胞吞噬作用、胞吐/胞吞作用，或經(jīng)絲狀偽足轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移后的黑素小體會分布于角質(zhì)形成細胞的細胞核周圍，形成所謂的黑素小體微傘結(jié)構(gòu)，保護DNA 免受紫外線損傷。皮膚內(nèi)黑素小體分布具有種族差異，也決定著個體的膚色。例如，黑素小體在深色皮膚中彼此孤立，而在淺色皮膚中聚集成簇，形成所謂的黑素小體復(fù)合物或包裹體。有意思的是，這種分布被認為是受角質(zhì)形成細胞起源決定的。有文獻報道，將淺膚色的角質(zhì)形成細胞與深膚色的黑素細胞共培養(yǎng)時，黑素小體在轉(zhuǎn)移之后會發(fā)生簇集形成黑素小體簇。相反，將深膚色的角質(zhì)形成細胞與淺膚色的黑素細胞共培養(yǎng)時，黑素小體則呈彌散孤立狀分布。

本研究旨在定性和定量分析不同膚色類型中黑素小體的特征。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，存在于中度或輕度色素沉著皮膚內(nèi)的黑素小體簇是由單層外膜包裹的黑素核構(gòu)成，表現(xiàn)出溶酶體相關(guān)細胞器特征，但不是自噬體或溶酶體。表明它們不是具有降解功能的細胞器，而是作為黑素小體的儲存庫和一種光防護結(jié)構(gòu)。

一、材料和方法（詳細內(nèi)容參見原文）

二、結(jié)果和討論

1.黑素小體在不同膚色人群皮膚內(nèi)的分布不同：該研究分析了能夠代表膚色多樣性（由最淺到最深）的13 個人的皮膚樣本。使用光譜色度計根據(jù)ITA（individual typological angle）分類評估各樣本的膚色類型，并分為3組：輕度色素沉著皮膚組（包括極淺色和淺色皮膚，n=4）、中度色素沉著皮膚組（包括中間色、黃褐色和棕色皮膚，n=6）和重度色素沉著皮膚組（深色皮膚，n=3）。使用低倍率透射電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)整個表皮內(nèi)黑素小體分布隨色素沉著水平不同而異。就重度色素沉著皮膚來說，其整個表皮內(nèi)黑素小體的數(shù)量最多，是輕度色素沉著的5倍；基底層角質(zhì)形成細胞內(nèi)含有的黑素小體亦最多（約60%），尤其是在細胞核上方；棘細胞層、顆粒層和角質(zhì)層的角質(zhì)形成細胞內(nèi)也能檢測到很多黑素小體。在中度色素沉著皮膚中，60%的黑素小體存在于基底層角質(zhì)形成細胞內(nèi)，但不如重度色素沉著皮膚內(nèi)含量豐富；棘細胞層、顆粒層和角質(zhì)層內(nèi)仍然可觀察到黑素小體。在輕度色素沉著皮膚中，黑素小體大多位于基底層內(nèi)（超過80%），而在棘細胞層和角質(zhì)層內(nèi)幾乎觀察不到。在極淺色皮膚內(nèi)，只有基底層的角質(zhì)形成細胞內(nèi)有少量黑素小體。這些發(fā)現(xiàn)與之前研究結(jié)果（針對基底層）一致，并進一步對基底層到角質(zhì)層的情況進行了定性和定量描述。

對于簇集和孤立的黑素小體，其數(shù)量、分布和大小會隨皮膚色素沉著類型的不同而異。在輕度色素沉著皮膚中，簇集狀和孤立狀黑素小體的比例幾乎相等，分別為55%和45%。中度色素沉著皮膚中也能觀察到黑素小體的不均勻分布模式，其角質(zhì)形成細胞內(nèi)含有大量黑素小體簇；簇集狀黑素小體的平均含量為70%，孤立狀則占30%。

總之，中度和輕度色素沉著皮膚中，簇集狀黑素小體與孤立狀黑素小體的比例隨著ITA 的增加而降低：黃褐色皮膚（ITA：24°）占80%，極淺色皮膚（ITA：66°）占44%。該結(jié)果表明，中度色素沉著皮膚中同時存在簇集狀和孤立狀黑素小體并非亞洲人皮膚所特有，而是與皮膚色素沉著程度有關(guān)。

在重度色素沉著皮膚中，基底層角質(zhì)形成細胞內(nèi)主要為孤立狀的黑素小體（93%），只有少量表現(xiàn)出簇集狀（7%），且都均勻分布在角質(zhì)形成細胞內(nèi)。

與重度色素沉著皮膚相比，中度和輕度色素沉著皮膚中的孤立狀黑素小體明顯較小，這與之前結(jié)果一致。輕度色素沉著皮膚中小的、簇集狀黑素小體與重度色素沉著皮膚中大的、孤立狀黑素小體的總體大小相當(dāng)。因此可得出結(jié)論：表皮基底層黑素核能夠以某種既定的尺寸存在以達到最佳光防護效果，這對于生發(fā)層細胞來說特別重要。同樣，相比輕度色素沉著皮膚中少量簇集狀的黑素小體，在中度色素沉著皮膚中觀察到的大量簇集狀黑素小體，可能與較高紫外線照射環(huán)境中人對自然的適應(yīng)有關(guān)，因為在這些環(huán)境中皮膚需要更強的光防護。無論何種皮膚類型，失去黑素小體膜的裸露的黑素小體（即黑素核）都會被單層外膜包裹成孤立狀或簇集狀。整體比對方法顯示簇集狀黑素核包埋在一種高電子密度但不均勻的顆粒狀基質(zhì)中。這種單層膜界定的黑素核不可能直接來源于轉(zhuǎn)移的黑素小體或黑素細胞的胞膜，因為在細胞間隙中發(fā)現(xiàn)了沒有膜結(jié)構(gòu)的黑素核。

2.孤立狀和簇集狀黑素核的三維結(jié)構(gòu)：使用電子斷層掃描在亞細胞水平上確定組織中孤立狀和簇集狀黑素核的結(jié)構(gòu)。三維重建圖像顯示，簇集狀黑素核常表現(xiàn)為不規(guī)則形狀，整個膜也會遵循黑素核在網(wǎng)絡(luò)中的形狀和位置。

簇集狀的黑素核輪廓清晰但邊界模糊，因此很難區(qū)分單一的黑素核。這表明，簇集狀的黑素核內(nèi)包含的黑素沉積并不像在孤立狀黑素小體內(nèi)一樣被緊緊地包裹。尤其是在輕度和中度色素沉著皮膚中，較低密度的邊界提示，色素可能會從黑素小體纖維狀基質(zhì)中分離，后者通常由PMEL蛋白產(chǎn)生的生理性淀粉樣蛋白組成。由于顆粒狀基質(zhì)的性質(zhì)仍未闡明，因此研究者認為它可能起源于這種黑素的分離。相反，在孤立狀黑素小體內(nèi)，黑素形成了由膜界定的致密核。

X 線斷層掃描同樣顯示，黑素小體與粗面和滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)緊密接觸，與線粒體一起位于細胞核周圍區(qū)域。可以觀察到重度色素沉著皮膚中與孤立狀黑素小體接觸的管狀結(jié)構(gòu)，或中度和輕度色素沉著皮膚中與簇集狀黑素小體接觸的管狀結(jié)構(gòu)。這些短管含有顆粒狀物質(zhì)，可能對應(yīng)已報道的與黑素小體緊密接觸的核內(nèi)體小管，在黑素小體的生物合成和維持中具有關(guān)鍵作用。不能排除這些小管可能有助于降解包埋有黑素的結(jié)構(gòu)蛋白。然而，當(dāng)它們從黑素小體中出現(xiàn)時，也可以認為這些小管是通過重塑膜結(jié)構(gòu)及其內(nèi)容物來參與黑素小體運動的。表明黑素小體一旦轉(zhuǎn)移至角質(zhì)形成細胞，存在生物合成和內(nèi)穩(wěn)態(tài)機制繼續(xù)維持黑素小體的功能。黑素小體周圍富含細胞器的環(huán)境表明，如同在黑素細胞內(nèi)一樣，在角質(zhì)形成細胞內(nèi)黑素小體與細胞器存在交互接觸。這種接觸可能具有不同的功能，如脂質(zhì)或鈣的內(nèi)平衡，這對于黑素小體的完整性可能是必需的。

3.簇集狀黑素核不是自噬體也不是酸性細胞器：白種人和亞洲人皮膚中的黑素小體簇已有描述，但是其結(jié)構(gòu)特征和性質(zhì)仍未被闡明，它們被認為是具有降解功能的溶酶體結(jié)構(gòu)。因為自噬在白種人皮膚內(nèi)極為活躍，且黑素小體能夠被角質(zhì)形成細胞吞噬，所以一種合理的假設(shè)是，這種簇狀結(jié)構(gòu)相當(dāng)于黑素吞噬體，可能是黑素小體降解的場所。該研究對3種不同類型皮膚的超薄冰凍切片進行免疫金標(biāo)記，以確定黑素小體/溶酶體膜蛋白（LAMP1、CD63）、溶酶體水解酶（組織蛋白酶Ⅴ）和自噬相關(guān)蛋白（LC3A）在整個表皮的分布。使用弱堿3-（2，4-二硝基苯氨基）-3′-氨基-N-甲基二丙胺（DAMP）研究黑素小體簇的酸度。在高度、中度和輕度色素沉著表皮中，在孤立狀和簇集狀黑素核的膜結(jié)構(gòu)上檢測到LAMP1 和CD63。與黑素細胞相比，角質(zhì)形成細胞內(nèi)出現(xiàn)的黑素小體（孤立狀或簇集狀）的LAMP1 標(biāo)記略高。LAMP1的標(biāo)記數(shù)量較大可能與黑素小體從黑素細胞向角質(zhì)形成細胞轉(zhuǎn)移的模式有關(guān)。尤其是，如果黑素核被胞吐出來然后被角質(zhì)形成細胞吞噬，那么LAMP1就可能與溶酶體融合的吞噬體膜有關(guān)，但這并不意味著簇狀結(jié)構(gòu)具有可降解的特性。同樣，在簇狀結(jié)構(gòu)中不存在LC3A（自噬標(biāo)記物）和組織蛋白酶Ⅴ（L2），盡管它們被發(fā)現(xiàn)都位于表皮上層，與自噬在表皮分化晚期的構(gòu)成作用一致。組織蛋白酶D 也有類似的結(jié)果。有文獻報道，在輕度色素沉著皮膚中組織蛋白酶Ⅴ/L2的標(biāo)記增加，但是沒有對其分布進行詳細描述。因此，這些結(jié)果表明，簇集的黑素核和孤立狀黑素小體并不對應(yīng)著自噬溶酶體/黑素吞噬體。在角質(zhì)形成細胞內(nèi)的孤立狀黑素小體和簇狀結(jié)構(gòu)中檢測到CD63的標(biāo)記，其密度低于黑素細胞內(nèi)黑素小體上的標(biāo)記量。然而，鑒于超薄冰凍切片中的標(biāo)記效率，這個發(fā)現(xiàn)是有意義的。此外，它引出了一種假設(shè)，即轉(zhuǎn)移至角質(zhì)形成細胞的黑素小體保持了溶酶體相關(guān)細胞器的特征，因為這種四次跨膜蛋白與溶酶體相關(guān)細胞器有關(guān)，而其本身并不是溶酶體標(biāo)記物。用一種抗2，4-二硝基苯酚抗體可以檢測到弱堿性DAMP蓄積在內(nèi)體/溶酶體結(jié)構(gòu)中，但是在轉(zhuǎn)移的黑素小體和簇狀結(jié)構(gòu)中幾乎檢測不到，該結(jié)果進一步驗證了黑素小體簇具有非自噬體、非降解功能的特性。數(shù)據(jù)表明，根據(jù)皮膚黑素細胞內(nèi)黑素小體的定義（溶酶體膜蛋白，CD63，pH值高于溶酶體），黑素小體簇表現(xiàn)出同樣特性，但是它們不含溶酶體水解酶。因為黑素小體簇并不具有自噬結(jié)構(gòu)，不含LC3，并且不是酸性的，該研究提示它們可能相當(dāng)于保存在基底層內(nèi)的黑素儲存庫。

黑素小體簇是如何形成的？通過細胞模型和體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)移的黑素小體并不攜帶黑素細胞內(nèi)黑素小體膜上出現(xiàn)的蛋白質(zhì)（如TYRP?1）。這些結(jié)果提示了一種通過黑素核的胞吐和胞吞作用的黑素小體轉(zhuǎn)移模式，一旦攝取，隨后便形成簇狀結(jié)構(gòu)。在該研究中，人的皮膚樣本無論其色素水平如何，常常可以在黑素細胞與角質(zhì)形成細胞之間的細胞外間隙內(nèi)觀察到單個黑素核。然而，不同的轉(zhuǎn)移模式是可能共存的，可能取決于所使用的模型系統(tǒng)和皮膚區(qū)域。

上述結(jié)果可總結(jié)為以下兩種模型：①黑素小體在不同膚色類型皮膚中的分布，②黑素核在角質(zhì)形成細胞中的轉(zhuǎn)移和結(jié)構(gòu)。根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)，可以提出關(guān)于黑素小體簇的作用和形成的問題和假設(shè)。

根據(jù)皮膚類型，黑素小體的分解被視為一個漸進過程。在體外，與深膚色皮膚相比，淺色皮膚源性角質(zhì)形成細胞表現(xiàn)為黑素小體的損耗加速。該研究顯示，黑素小體簇不是可降解的或自噬性的細胞器。因為它們似乎并不對應(yīng)可降解的酸性結(jié)構(gòu)，而可能是在紫外線應(yīng)激下快速被動員的光防護性或儲存性結(jié)構(gòu)。與黑素小體簇密切接觸的線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的存在也證實了這一假設(shè)。這種接觸可能有助于維持簇狀結(jié)構(gòu)的內(nèi)穩(wěn)態(tài)，其方式與之前描述的黑素細胞內(nèi)孤立狀黑素小體相似。基底層內(nèi)簇狀結(jié)構(gòu)的功能值得進一步研究。人們很容易假設(shè)，在中度和輕度色素沉著皮膚中，與小的孤立狀黑素小體相比，黑素小體聚集在一起使其表面擴大可以增加它們吸收/過濾紫外線的效率。而且，被膜包繞的簇集或孤立狀黑素核具有潛在效應(yīng)分子，能夠有助于它們朝向細胞核及其上方運動，以確保其光防護作用。

通過揭示角質(zhì)形成細胞內(nèi)黑素小體簇的結(jié)構(gòu)和代謝，該研究結(jié)果為以下3 點開辟了新的方向：①了解不同膚色類型中皮膚色素沉著的機制；②揭示自然光防護作用的機制；③制定健康或疾病狀態(tài)下色素沉著的調(diào)節(jié)機制。