蛇床子素固體脂質納米粒的體內抗腫瘤活性研究

陳嬌婷　葉民珠

[摘要]目的：制備蛇床子素固體脂質納米粒（ost-SLN），并考察ost-SLN體內的抗腫瘤活性。方法：采用熔融-勻化法制備蛇床子素固體脂質納米粒，評價Ost-SLN對小鼠H22肝癌實體瘤的抑瘤作用，觀察對脾、胸腺等器官的損傷情況，比較不同濃度下對機體帶來的影響。結果：ost-SLN可不同程度地抑制H22荷瘤小鼠的腫瘤生長，而且隨著給藥濃度增加，ost-SLN的抑瘤率均上升，分別為34.2%、50.9%、68.5%。結論：ost-SLN在體內均有明顯的抗腫瘤活性，且未出現(xiàn)毒性反應，有望開發(fā)成一種高效、低毒的蛇床子素制劑。

[關鍵詞]蛇床子素；ost-SLN；抗腫瘤

蛇床子素（osthol，osc）是從傘形科植物蛇床的果實中提取分離得到的一種香豆素類化合物，其核心結構由苯環(huán)和吡喃酮環(huán)組成。藥理研究表明，蛇床子素對心血管系統(tǒng)、中樞神經系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等有重要活性，且在抗腫瘤、抗骨質疏松癥及抗變態(tài)反應等方面也均有較強的效果。但由于蛇床子素在水中難溶，口服吸收差，生物利用度低，個體差異大，限制了其在臨床上的廣泛應用。研究采用熔融-勻化法制備蛇床子素固體脂質納米粒，建立小鼠H22肝癌實體瘤模型，評價蛇床子素固體脂質納米粒對小鼠H22肝癌實體瘤的抑瘤作用，觀察對脾、胸腺等器官的損傷情況，比較其不同濃度下對機體帶來的影響和可能產生的毒副作用，為蛇床子素固體脂質納米粒的進一步臨床研究奠定基礎。

1.儀器與材料

1.1儀器 Sartorius ALC4100電子天平（廣州市上博電子科技有限公司）；85-2型數(shù)顯恒溫磁力攪拌器（鞏義市科瑞儀器有限公司）；NIROSOAVI高壓乳勻機（美國儀器集團）；高效液相色譜儀（日本島津）；高分辨透射電鏡（81W/AIS2100，西化儀器有限公司）。

1.2試藥 蛇床子素（批號：110822-200406，南京替斯艾么中藥研究所）；單硬脂酸甘油酯（批號：054K5303，上海凌峰化學試劑有限公司）；大豆卵磷脂（批號：2075523，上海愛康精細化工有限公司）；泊洛沙姆188（批號：WPWA544C，南京威爾化工有限公司）；無水乙醇（批號：20110528，上?；瘜W試劑有限公司）；甲醇（色譜純，山東浩中化工科技有限公司），其余試劑均為分析純。

1.3動物與瘤株 昆明種小鼠，體重18～22g，雌雄各半，清潔級，動物合格證號：JxA2005318，由贛南醫(yī)學院實驗動物中心提供。肝癌細胞H22由贛南醫(yī)學院藥理實驗室提供。

2.方法

2.1蛇床子素固體脂質納米粒的制備 采用熔融-勻化法制備，稱取處方量的單硬脂酸甘油酯在（75±2）℃加熱熔融后，蛇床子素用適量無水乙醇溶解后，兩者均勻混合作為油相。取處方量的大豆卵磷脂、泊洛沙姆188、水在超聲中溶解，并加熱至（75±2）℃成為水相。在攪拌下將水相緩慢滴加到油相中，制成O/W型初乳。用高壓乳均機在100 MPa壓強下，于（75±2）℃下反復乳勻5次后，迅速冷卻形成蛇床子素固體脂質納米粒混懸液。

2.2納米粒的質量評價

2.2.1ost—SLN的形態(tài)學觀察及粒徑分布形態(tài)學觀察 按照最佳方案制備的ost-SLN，采用電子顯微鏡觀察。將ost-SLN樣品，用水稀釋至適當濃度，用激光散射粒度測定儀測定其粒徑。

2.2.2包封率的測定 采用超速離心法，精密量取蛇床子素固體脂質納米粒1mL，置離心管，于10000r/min離心30min。取上清液用甲醇定容于10mL量瓶，經孔徑0.45um微孔濾膜濾過，備用。在此色譜條件（色譜柱：C18柱；檢測波長：322nm；流動相：甲醇-水（75：25）；柱溫：室溫；流速1mL/min）測定游離藥物濃度。

精密量取蛇床子素固體脂質納米粒lmL，置10mL量瓶，用甲醇定容，超聲處理，靜置，經孔徑0.45um微孔濾膜濾過，備用。采用上述色譜條件測定蛇床子素固體脂質納米粒中總藥量，并根據(jù)公式計算包封率。包封率（%）=[（總藥量-游離藥物量）/總藥量]×100%。

2.3體內抗腫瘤活性研究

2.3.1小鼠肝癌細胞H22荷瘤小鼠模型制備 H22瘤株經小鼠腹腔7d傳代1次，取第3代用于實驗，腹水瘤小鼠脫頸椎處死，無菌條件下用一次性無菌注射器抽取乳白色腹水，置于已滅菌的離心管中，細胞計數(shù)器計數(shù)，用無菌生理鹽水稀釋成1×10個/mL的腫瘤細胞懸液，接種于小鼠右前肢腋部皮下，每只0.2mL。

2.3.2Hz2肝癌小鼠分組及給藥 接種次日隨機分組，每組10只，雌雄各半。分組后立即腹腔注射給藥，藥量經預實驗確定，每天用藥1次，連續(xù)8d。分組及給藥量分別為：模型組為生理鹽水，對照組環(huán)磷酰胺組（20mg/Kg），分別用Ost、Ost-SLN的低、中、高劑量組為用藥組。藥物3個劑量組為1.0、2.0、4.0mg/Kg，每只給藥0.2mL/d。

2.3.3檢測指標末次給藥后24h（禁食不禁水），后頸椎脫臼處死各組小鼠，完整剝離腫瘤并稱重，計算抑瘤率。剖取胸腺和脾臟，計算臟器指數(shù)。

抑瘤率=（模型組平均瘤質量-用藥組平均瘤重）/模型組平均瘤質量×100%。

脾臟或胸腺指數(shù)/mg/g=脾臟或胸腺重量/體重。

2.4統(tǒng)計學方法 采用統(tǒng)計學軟件SPSS 13.0進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)加減標準差（x±s）表示，行t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3.結果

3.1納米粒的質量評價 在電子顯微鏡照片中顯示，ost-SLN大都呈規(guī)則、完整的圓形或卵圓形，粒子分散狀態(tài)良好，無粘連。形態(tài)學圖見圖1。平均粒徑分布范圍為100～200nm，分布比較均勻。粒徑分布圖見圖2。測得其包封率為59.78%。

3.2體內抗腫瘤活性研究

3.2.1小鼠瘤重的影響 ost-SLN用藥組對H22荷瘤小鼠的腫瘤抑制率達到了34.2%，與模型組比較抑瘤效果有統(tǒng)計學差異（P<0.05）。隨著給藥濃度增加，藥物的抑瘤率均上升，分別為34.2%、50.9%、68.5%。ost-SLN可以增強ost對小鼠腫瘤的抑制作用，反映了其在體內良好的靶向分布和抗腫瘤活性。見表1。

3.2.2胸腺指數(shù)和脾指數(shù)比較 各組小鼠處死時體重變化與對照組比較，發(fā)現(xiàn)用藥組中不同劑量可見ost-SLN組對小鼠體重的抑制作用較小，這應當與其在體內的靶向性分布，減少藥物在其它組織和細胞中的分布有關。用藥組中荷瘤小鼠的胸腺指數(shù)和脾指數(shù)都比模型組的免疫指數(shù)略大一些。見表2。

4.討論

實驗中采用熔融一勻化法制備ost-SLN樣品，將載藥類脂熔融物分散于熱的乳化劑水溶液中形成初乳，初乳經高壓乳均機勻質形成納米乳，室溫下冷卻固化形成SLN。該法得到的SLN粒徑小且分布窄，但高溫會增加藥物和載體的降解速度。為進一步考察蛇床子素的抑瘤活性，實驗進行了蛇床子素對荷瘤小鼠抑瘤活性的研究和對脾、胸腺等器官損傷情況的考察，觀察其給藥劑量下對機體帶來的影響和可能產生的毒副作用，以揭示其在臨床腫瘤治療中潛在的應用前景。

實驗結果顯示，環(huán)磷酰胺和ost-SLN可不同程度地抑制H22荷瘤小鼠的腫瘤生長，其中隨著給藥濃度增加，ost-SLN的抑瘤率均上升，分別為34.2%、50.9%、68.5%。表明其在體內良好的靶向分布和抗腫瘤活性；且高濃度的ost-SLN的抑瘤率比環(huán)磷酰胺更好；胸腺指數(shù)和脾指數(shù)結果表明，用藥組中荷瘤小鼠的胸腺指數(shù)和脾指數(shù)都比模型組的免疫指數(shù)略大一些，可能是接種腫瘤后刺激了免疫系統(tǒng)，也可能是吞噬作用或病理性增大。