不同采收期枳實促胃腸動力作用及其辛弗林含量的比較研究

鄧敏芝　鄧可眾　陳虹　吳華強　熊英

[摘要]目的：比較不同采收期枳實促胃腸動力作用及辛弗林含量的差異。方法：使用不同采收期枳實的提取物對正常小鼠連續(xù)灌胃7d，測定在體小腸碳末推進率和胃殘留率；利用HPLC測定辛弗林的含量。結(jié)果：不同采收期枳實中辛弗林含量以及對正常小鼠的小腸推進作用均存在一定差異，但辛弗林含量的高低與小腸推進作用并不呈線性相關(guān)。結(jié)論：枳實促胃腸動力可能是其中多種成分協(xié)同作用的結(jié)果，枳實藥材宜增加相關(guān)活性成分分析建立多指標質(zhì)量控制方法。

[關(guān)鍵詞]枳實；辛弗林；胃腸動力；不同采收期

枳實來源于蕓香科植物酸橙及其栽培變種或甜橙的干燥幼果，江西是枳實的道地產(chǎn)區(qū)之一，而江西新干縣、樟樹等道地產(chǎn)區(qū)資源調(diào)查表明，江枳實的基源植物主要為酸橙。目前，中國藥典以辛弗林含量作為枳實藥材質(zhì)量控制的定量指標。文獻分析不同品種如酸橙和甜橙、不同產(chǎn)地如江西、四川、湖南及福建枳實藥材中的辛弗林含量差異較大，炮制方法和采收時間也有顯著影響，且隨著果實的逐步發(fā)育成熟，辛弗林的含量呈降低趨勢。關(guān)于辛弗林含量測定方法的文獻研究也屢見報道，如2D-HPLC、固相萃取-HPLC等。枳實為常用理氣類中藥，研究表明枳實水煎液和辛弗林能促進正常小鼠小腸推進，枳實還可改善功能性消化不良大鼠的胃排空。

采收時間是影響中藥材質(zhì)量的重要因素之一，酸橙在每年春季5月初開花，5月中下旬至6月下旬自然脫落的幼果作為藥材枳實，至7月初果皮尚綠時的未成熟果實則當作枳殼藥用；部分植株在秋季可二次開花結(jié)果，其幼果也被當作枳實銷售。不同采收期枳實藥材的大小較為懸殊，從小到大依次稱為雞眼枳實、鵝眼枳實、小片、中片及大片。這些枳實均在市場上銷售、使用，然在在藥效方面是否存在顯著性差異尚未見文獻報道，秋季枳實中的成分和藥效等各方面亦無相關(guān)研究。本實驗觀察不同采收期枳實對在體小鼠小腸碳末推進率和胃殘留率的差異，并結(jié)合HPLC測定相應(yīng)的辛弗林含量進行對比分析，為制定適宜采收期及完善質(zhì)量標準提供依據(jù)。

1.儀器與材料

1.1藥材 2014年采集于江西省樟樹市昌傅鎮(zhèn)下余村，1～4號分別為5月下旬、6月中旬、6月下旬及10月中旬采收，經(jīng)鑒定為蕓香科植物酸橙C.aurantium L的幼果。

1.2動物 清潔級昆明種小鼠50只，體重20-25 g，雄性，由江西中醫(yī)藥大學陽明實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（贛）2011-0001。

1.3儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀（G1311C四元泵、G1329B自動進樣器、G1316A柱溫箱、G4212B DAD檢測器、Agilent 1260LC化學工作站，美國Agilent Technologies公司），METFLER TOLEDOXS3DU百萬分之一電子分析天平（瑞士METTLERTOLEDO公司）。

2.小腸推進及胃排空作用的實驗方法與結(jié)果

2.1藥物的制備 分別稱取枳實藥材適量，粉碎為中粉，加入適量蒸餾水，水煎煮提取2次，每次30min，合并濾液并濃縮，制成每lmL相當于1g原藥材的提取液。

2.2給藥及指標測定 50只小鼠隨機分為5組，每組10只，即4個枳實樣品組和空白對照組。樣品組小鼠按4g/Kg分別給予不同產(chǎn)地枳實提取物，空白組給予等體積生理鹽水。連續(xù)灌胃給藥7d，每日1次。末次給藥后，動物禁食12h，小鼠灌胃給予炭末混懸液0.5mL（2%CMC-Na和5%炭末），20min后處死動物，剖腹取出上端自幽門、下端至回盲部的腸管，鋪直后測量幽門至回盲部全長（小腸總長度）及幽門至炭末前沿的距離（炭末推進長度），計算小腸推進百分率；結(jié)扎上述小鼠的胃賁門和幽門，取濾紙拭干后稱全重，然后沿胃大彎剪開胃體，洗去胃內(nèi)容物后用濾紙拭干，稱取胃凈重，胃全重和胃凈重差值為胃內(nèi)殘留物重，并計算與所灌炭末混懸液質(zhì)量的百分比為胃殘留率。

2.3統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料采用t檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2.4結(jié)果 由表1可知，樣品組碳末小腸推進率均大于空白組，其中1、3號枳實組的小腸推進率與空白組比較有統(tǒng)計學差異（P<0.05）。不同采收期枳實的碳末小腸推進率同樣存在一定差異性，1號和2號、4號之間存在存在統(tǒng)計學差異（P<0.05）。所有樣品組的胃殘留率和空白組比較均無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。

3.HPLC測定辛弗林的方法與結(jié)果

3.1色譜條件與系統(tǒng)適用性 色譜柱：TSK-GELODS（250mm×4.6mm，5lxm）；流動相：乙腈-水（25：75，水中加0.1%磷酸和0.1%SDS）；流速：1.0mL/min，柱溫：30℃；進樣量：20uL；檢測波長：275nm；理論塔板數(shù)>15000。對照品及樣品色譜圖見圖1。

3.2對照品溶液的制備 精密稱取辛弗林適量，加甲醇溶解于容量瓶中配制成693.00ug/mL濃度的對照品溶液。

3.3樣品溶液的制備 取藥材中粉適量，精密稱定，按2015版中國藥典一部枳實項下含量測定相同方法進行制備。

3.4線性關(guān)系的考察 將配置好的母液稀釋成693.00、346.50、173.25、86.63、43.31、21.66、10.83、5.41、2.71ug/mL等一系列濃度梯度的對照品溶液。按照“3.1”項下的色譜條件進樣20ul測定，計算峰面積Y與濃度x的線性方程、檢測限及定量限，得回歸方程：Y=4.2843X+5.2456（r=0.9998），在2.71～693.00ug范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢測限為1.31ug/mL，定量限為4.36ug/mL。

3.5精密度試驗 取對照品溶液，按“3.1”項下色譜條件下連續(xù)進樣6次，計算辛弗林峰面積的RSD為0.49%，表明精密度良好。

3.6穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液（2014年5月下旬采集于江西新干縣，批號：S9），分別于0、2、4、6、8、24 h時進樣，結(jié)果，辛弗林峰面積的RSD為1.07%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.7重復性試驗 精密稱取同一份樣品適量6份（批號：S9），按“3.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“3.1”項下色譜條件進樣檢測，辛弗林含量的RSD為1.95%。表明該方法重復性良好。

3.8回收率試驗 稱取枳實粉末（批號：S9）0.5g 6份，精密加入一定量的辛弗林對照品溶液，按“3.2.2”項下制備供試品溶液，同上分析條件測定含量并計算加樣回收率。結(jié)果見表2。

3.9樣品含量測定 取不同采收期枳實藥材的水提物，按“3.2.2”項下方法平行制備2份供試品溶液，同以上色譜條件進樣分析，結(jié)果見表3。

由含量測定結(jié)果可知，不同采收期包括秋季采集江枳實中辛弗林含量均符合2015版藥典標準（>0.3%），其中以5月底收集的樣品辛弗林含量為最高，隨果實生長其中所含辛弗林呈逐步下降趨勢，在采收末期6月下旬下降約為一半；藥理實驗表明枳實的水提物對正常小鼠小腸具有明顯的推進作用，對正常小鼠胃排空無明顯影響，不同采收期枳實對正常小鼠小腸的推進作用也存在一定的差異性，以5月下旬收集樣品的活性最強，6月中旬、下旬收集樣品和秋季枳實對正常小鼠小腸的推進作用雖有所減弱，但辛弗林含量最低的6月下旬采集樣品的小腸推進作用并非為最弱，二者對比分析，枳實對正常小鼠的小腸推進作用與其中辛弗林含量的變化趨勢并不完全呈線性相關(guān)。

4.討論

不同采收期枳實中辛弗林的含量以及對正常小鼠小腸的推進作用均有明顯差異，5月下旬收集枳實中辛弗林含量高且活性強，但此時果實極小，直徑僅約0.5 cm左右，6月底采收的枳實直徑最大，約2～2.5 cm，雖含量最低但活性較好，根據(jù)對正常小鼠小腸的推進作用及藥材大小分析，枳實在5月下旬或者6月下旬采收較佳。

前期研究及文獻報道表明枳實中化學成分除辛弗林外，還含有較多的黃酮類如新橙皮苷、柚皮苷以及香豆素類如馬爾敏、水合橙皮內(nèi)酯，其中，新橙皮苷的含量可高達20%以上，而且枳實黃酮和香豆素均有胃腸動力作用。因此藥典標準中枳實藥材僅以辛弗林為定量指標的質(zhì)控標準尚需進一步完善，建議建立生物堿、黃酮以及香豆素類多指標性成分分析的質(zhì)量評價方法。