高效液相色譜法測定酶法制備L-色氨酸

陳 軍， 徐禮生， 張興桃， 董 增

（宿州學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，安徽 宿州234000）

高效液相色譜法測定酶法制備L-色氨酸

陳 軍， 徐禮生， 張興桃， 董 增

（宿州學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，安徽 宿州234000）

研究了高效液相色譜法測定酶法制備L-色氨酸的最佳參數(shù)。結(jié)果表明，流動相分配比V（磷酸二氫鉀溶液）∶V（甲醇）=30∶70，流量1 mL/min，C18柱分離，柱溫38℃，檢測波長265 nm時為高效液相色譜法檢測L-色氨酸的最佳參數(shù)?；厥章试?2.00%～110.00%，外加絲氨酸沒有干擾發(fā)酵液中L-色氨酸含量測定。此方法用于樣品中的L-色氨酸的測定，分離效果良好。

高效液相色譜；L-色氨酸；酶法制備

L-色氨酸在人體是一種限制性氨基酸，也是一種必需氨基酸，在人體內(nèi)無法合成，需要從食物中攝取。作為食品添加劑[1]，早期L-色氨酸的生產(chǎn)多采用化學(xué)合成法、蛋白質(zhì)水解法等，由于酶法制備色氨酸具有成本低、周期短、產(chǎn)率高、質(zhì)量好等優(yōu)點，因此該技術(shù)將會成為L-色氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)的主要方法。目前，L-色氨酸測定方法有氨基酸分析儀 、分光光度法和熒光法等[2-9]，鑒于高效液相色譜技術(shù)具有分辨率高、速度快、重復(fù)性高等優(yōu)點，高效液相色譜法測定微生物發(fā)酵液中的L-色氨酸已有報道[10-11]，但高效液相色譜法用于酶法制備L-色氨酸的測定尚未見報道。作者通過考察流動相及其分配比、波長、柱溫等因素，確立了高效液相色譜法測定酶法制備L-色氨酸的最適色譜條件，并進行了方法評價。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

絲氨酸，甲醇，L-色氨酸，磷酸二氫鉀，氫氧化鈉，雙蒸水：以上試劑均為分析純。

島津LC-20AT型高效液相色譜儀：日本島津公司；KQ5200DB數(shù)控超聲波清洗器；80-2型電動離心機：金城國盛實驗儀器廠；PHS-3C型精密酸度計。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件確定方法 利用島津LC-20AT型高效液相色譜儀測定L-色氨酸的含量，采用0.025%磷酸溶液-甲醇體系作為流動相，分別研究流動相及分配比、流動相流速、檢測波長及柱溫對檢測結(jié)果的影響。

1.2.2 標準曲線 稱取L-色氨酸0.400 g定容1 L，配置成質(zhì)量濃度為400 mg/L的L-色氨酸標準樣品，將上述配置好的L-色氨酸標準樣品用流動相稀釋成一定的濃度梯度，將所有標準樣品采用0.30 μm微孔濾膜過濾后采用UV-紫外分光光度法檢測，繪制L-色氨酸標準樣品。

1.2.3 發(fā)酵液樣品的處理 取1.0 mL發(fā)酵液15 000 r/min離心5 min，然后用移液槍吸取其上清液，進行適當(dāng)稀釋，使其質(zhì)量濃度介于0～400 mg/L的線性范圍內(nèi)，然后用0.30 μm微孔濾膜過濾，所得濾液采用UV-紫外分光光度法[12]測定其L-色氨酸含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動相及分配比的確定

設(shè)置分配比為20∶80、25∶75、30∶70、35∶65、40∶60五個體系，由圖1可知，隨著增大流動相分配比，其波峰面積呈現(xiàn)先增大后降低趨勢，分配比流動相為30∶70的條件下，波峰面積具有最大值，綜上分析選用V（0.025%磷酸溶液）∶V（甲醇）=30∶70為該方法測定酶法制備L-色氨酸的最佳分配比流動相。

2.2 流動相流速的確定

分別選擇流動相的總流速為0.8、0.9、1.0、1.1、1.2 mL/min，觀察發(fā)酵液的波峰變化和高效液相色譜儀的壓力變化。結(jié)果表明，流速越小其保留時間越大，波峰的分離效果較好；流速越大其保留時間越小，但發(fā)酵液中物質(zhì)的分離效果變差。另外流速越大其泵壓也增大，易損壞分離柱，該法測定酶法制備L-色氨酸研究的最適流速為1.0 mL/min。

圖1 不同流動相分配比下L-色氨酸的檢測波峰面積Fig.1 Peak area of L-tryptophan under different mobile phase

2.3 檢測波長的確定

L-色氨酸含有一個苯環(huán)，紫外線區(qū)域內(nèi)有吸收峰，測定中不需添加其它顯色試劑。為了探討最適檢測波長，在工作站中設(shè)置5個檢測器波長，分別為245、255、265、275、285 nm。由圖2可知，隨著波長提高，其波峰面積呈現(xiàn)先增大后降低趨勢，波長設(shè)定為265 nm時，波峰具有最大值。確定檢測波長在265 nm時為高效液相色譜法測定酶法制備L-色氨酸研究的最佳波長。

圖2 不同紫外波長下L-色氨酸的檢測波峰面積Fig.2 Peak area of L-tryptophan under different ultraviolet wavelengths

2.4 柱溫的確定

柱溫對高效液相色譜法測定酶法制備L-色氨酸有較大影響，選擇一個合適的柱溫對檢測結(jié)果至關(guān)重要，柱溫分別設(shè)置30、35、40、45、50℃。由圖3知，隨著柱溫的提高，其波峰面積呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，其中柱溫在38℃時，L-色氨酸出現(xiàn)一個最大吸收峰面積，當(dāng)柱溫繼續(xù)升高時，L-色氨酸的波峰面積逐漸降低。綜上討論，最終確定柱溫38℃為高效液相色譜法測定酶法制備L-色氨酸研究的最優(yōu)柱溫。

圖3 不同柱溫條件下L-色氨酸的檢測波峰面積Fig.3 Peak area of L-tryptophan at different column temperature

2.5 確定色譜條件及標準曲線的確定

以島津 C18（5 μm，250 mm×4.6 mm）為分離柱，流動相分配比為V（0.025%磷酸溶液）∶V（甲醇）=30∶70，流速為1.0 mL/min，柱溫為38℃，檢測波長為265 nm，進樣量為10 μL，圖4所示為L-色氨酸標準品使用該法檢測的色譜圖，L-色氨酸的保留時間為3.520 min。

根據(jù)以上色譜條件，得L-色氨酸的標準曲線，見圖5，可知線性范圍在0～400 mg/L內(nèi)，線性相關(guān)系數(shù)為R2=0.999 3，線性關(guān)系良好。

圖4 L-色氨酸標準樣品色譜圖Fig.4 Chromatograms of L-tryptophan standard sample

圖5 L-色氨酸標準曲線Fig.5 Standard curves of L-tryptophan

2.6 加樣回收率測定

為了進一步驗證其準確性，進行了回收實驗檢測，取質(zhì)量濃度為200 mg/L的L-色氨酸標準品100 mL，然后取100 mg的L-色氨酸樣品加入到已知的200 mg/L L-色氨酸標準品中混合，將其混合液進行進樣檢測，在相同條件檢測5次，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，回收效果良好，回收率在92.00%～110.00%，平均值99%，由此可見，高效液相色譜法測定酶法制備L-色氨酸準確度較好。

表1 L-色氨酸加樣回收率測定（n=5）Table 1 Recovery test of L-tryptophan（n=5）

2.7 干擾試驗

本實驗中的L-色氨酸發(fā)酵液是通過絲氨酸經(jīng)過酶催化轉(zhuǎn)換而成的，而檢測結(jié)果證實了發(fā)酵液中含有剩余的絲氨酸，為了排除絲氨酸的影響，進行了標準品加入絲氨酸的干擾實驗。取100 mg/L絲氨酸1 mL與100 mg/L L-色氨酸等體積混合，將其混合液用高效液相色譜法進行測定，結(jié)果見圖6。色譜圖中只有L-色氨酸波峰，且其保留時間為3.520 min，這與L-色氨酸標準品的保留時間基本相同，可見在265 nm檢測波長下絲氨酸對L-色氨酸的檢測沒有影響，所以外加絲氨酸沒有干擾發(fā)酵液L-色氨酸質(zhì)量濃度的測定。

圖6 混合液色氨酸與絲氨酸的色譜圖Fig.6 Chromatograms of mixed liquor of L-tryptophan and serine

2.8 樣品的測定

采用流動相分配比V（磷酸二氫鉀溶液）∶V（甲醇）=30∶70，流量1 mL/min，柱溫38℃，檢測波長265 nm測定L-色氨酸合成酶發(fā)酵液，得出L-色氨酸色譜圖。由圖7可知，色譜柱柱效高，將波峰面積代入標準曲線中，得出發(fā)酵液中L-色氨酸質(zhì)量濃度為80mg/L。

圖7 樣品中L-色氨酸檢測色譜圖Fig.7 Results of L-Tryptophan of the sample

3 結(jié)語

通過研究確立了高效液相色譜法測定酶法制備L-色氨酸的最適色譜條件，流動相分配比V（磷酸二氫鉀溶液）∶V（甲醇）=30∶70，流量1 mL/min，C18柱分離，柱溫38℃，檢測波長265 nm。方法用于發(fā)酵液中的L-色氨酸的測定，保留時間為3.520 min，在0～400 mg/L范圍內(nèi)線性良好，回收率在92%～110%之間，外加絲氨酸沒有干擾發(fā)酵液中L-色氨酸含量測定。該方法簡便、準確、適用性強。

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Study on High Performance Liquid Chromatography Method for Determination of Enzymatic Preparation of L-Tryptophan

CHEN Jun， XU Lisheng， ZHANG Xingtao， DONG Zeng
（College of Biology and Food Engineering，Suzhou University，Suzhou 234000，China）

High performance liquid chromatography method for determination of enzymatic Preparation of L-tryptophan（L-Trp）were studied.The results showed that the optimal parameter were 0.05 mmol/L potassium dihydrogan phosphate-methanol（30∶70）as the mobile phase，the detection wavelength by 265 nm，the flow rate of 1.3 mL/min，separated on a C18 column and 38℃column temperature.The recoveries ranged from 92.00%～110.00%，and the Serine added had no interference to determination of L-tryptophan.The L-Trp in fermentation liquid was separated effectively in these conditions.

high performance liquid，L-tryptophan，enzymatic preparation

S 816.17

A

1673—1689（2017）03—0327—04

2015-03-31

安徽省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（AH20141037906）；宿州區(qū)域發(fā)展協(xié)同創(chuàng)新中心項目（2015SZXTZXKFZD01）；宿州學(xué)院科研平臺項目（2015ykf02）；宿州學(xué)院教授（博士）科研啟動基金項目（2014jb06）。

陳 軍（1980—），男，安徽蕭縣人，農(nóng)學(xué)碩士，講師，主要從事微生物發(fā)酵方面的研究。E-mail：cj998001@163.com

陳軍，徐禮生，張興桃，等.高效液相色譜法測定酶法制備L-色氨酸的研究[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報，2017，36（03）：327-330.