星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化柚皮素包合物自微乳給藥系統(tǒng)

王章姐， 施伶俐， 華 芳， 楊夢(mèng)凡

（安徽新華學(xué)院 藥學(xué)院，安徽 合肥230088）

星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化柚皮素包合物自微乳給藥系統(tǒng)

王章姐， 施伶俐， 華 芳， 楊夢(mèng)凡

（安徽新華學(xué)院 藥學(xué)院，安徽 合肥230088）

研究星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化柚皮素包合物自微乳化給藥系統(tǒng)最佳處方。通過(guò)測(cè)定柚皮素包合物在各介質(zhì)中的溶解度，利用偽三元相圖初步篩選柚皮素包合物自微乳給藥系統(tǒng)組分；以柚皮素在不同自微乳處方中的載藥量和粒徑為指標(biāo)，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面優(yōu)化法，確定最佳處方。柚皮素包合物自微乳最佳處方選擇油酸乙酯為油相，聚山梨酯80為乳化劑，PEG 400為助乳化劑，油相比例為14.39%，Km值為2.05，最佳處方中載藥量為159.435 mg/g，粒徑為28.35 nm。關(guān)鍵詞：柚皮素包合物；自微乳；星點(diǎn)設(shè)計(jì)；效應(yīng)面法

柚皮素（naringenin，NAR）是一種二氫黃酮類(lèi)化合物，有研究報(bào)道，柚皮素具有抗癌、抗炎、抗菌、抗氧化、解痙利膽等多方面藥理作用[1-3]，但NAR水溶性和脂溶性均較差、口服生物利用度低，故其口服制劑在臨床上應(yīng)用受到了限制。前期對(duì)柚皮素包合物進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，將NAR用β-CD包合后，其溶出度有所增加。

在處方和工藝優(yōu)化時(shí)，通常需要考察多個(gè)自變量對(duì)因變量的影響，國(guó)內(nèi)常用正交設(shè)計(jì)或者均勻設(shè)計(jì)對(duì)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化，但這兩種方法實(shí)驗(yàn)精度低。星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)精度高，實(shí)驗(yàn)次數(shù)少，所建立的數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)性較好[4-5]。自微乳給藥系統(tǒng)（self micro-emulsifying drug delivery system，SMEDDS）由油相、表面活性劑和助表面活性劑構(gòu)成的均一、澄清的液體，該系統(tǒng)在胃腸道內(nèi)通過(guò)胃腸道蠕動(dòng)自發(fā)形成粒徑小于100 nm的O/W型乳劑，SMEDDS可作為疏水性、難吸收等藥物的優(yōu)良載體，可增加藥物的表面積和溶解度[6]。作者采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化NAR包合物自微乳給藥系統(tǒng)，為制備臨床應(yīng)用新劑型奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

NAR原料藥：批號(hào)HK20131222，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%，陜西慧科植物開(kāi)發(fā)有限公司；NAR對(duì)照品：中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110722-201018；β-環(huán)糊精：上海源葉生物科技有限公司；聚氧乙烯氫化蓖麻油：Cremophor RH40，北京鳳禮精求商貿(mào)有限責(zé)任公司；聚山梨酯80：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；辛酸葵酸三甘油脂：GTCC，英國(guó)Croda公司；油酸乙酯：上海源葉生物科技有限公司；1，2丙二醇：北京鳳禮精求商貿(mào)有限責(zé)任公司；聚乙二醇400：PEG 400，上海源葉生物科技有限公司；油酸、異丙醇：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；聚氧乙烯辛基苯基醚：OP乳化劑，上海玖意化學(xué)試劑有限公司；乙醇等其余試劑均為分析純。

1.2 儀器

DF-101S型智能集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：河南省予華儀器有限公司；SHZ-DI-Ⅱ型循環(huán)水式真空泵：浙江黃巖求精真空泵廠；Zetasizer Nano ZS納米粒電位分析儀：馬爾文儀器有限公司；Autoscience AS3120超聲波清洗機(jī)：奧特賽恩斯儀器有限公司；UV-2550紫外-可見(jiàn)分光光度儀：日本島津公司；BT125D電子分析天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；DZF1.0型真空干燥箱：上海長(zhǎng)源儀器設(shè)備廠；CP2115D電子天平：Satorius公司。

1.3 方法

1.3.1 NAR-β-CD包合物的制備 在前期研究基礎(chǔ)上，稱取100 g β-CD溶于水中，加熱溶解制成β-CD飽和水溶液，備用。稱取20 g NAR原料藥，加入適量70%乙醇，置于48.11℃恒溫磁力攪拌中，加入β-CD飽和水溶液，磁力加熱攪拌84.72 min，靜置，放入冰箱中冷藏24 h，真空抽濾，用無(wú)水乙醇多次洗滌濾餅，干燥，得到橙黃色固體即為NAR-β-CD包合物[7]。

1.3.2 NAR-β-CD包合物在不同介質(zhì)中溶解度的測(cè)定 分別稱取約2 g不同油相、乳化劑和助乳化劑置于帶塞西林瓶中，加入過(guò)量的NAR-β-CD包合物，攪拌后密封超聲30 min，以促進(jìn)其溶解，然后在 37℃水浴中平衡 48 h，10 000 r/min離心 10 min，取上清液，用0.45 μm的微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液用甲醇稀釋至適宜倍數(shù)，作為供試品溶液。分別精密吸取供試品20 μL，以HPLC法測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算相應(yīng)成分在不同介質(zhì)中的溶解度。

1.3.3 NAR-β-CD包合物自微乳的制備 取NAR-β-CD包合物、乳化劑、助乳化劑，精密稱定，依次加入具塞錐形瓶中，置37℃水浴中溶解，混勻。再取油相，精密稱定，加入上述錐形瓶中，同樣條件下混勻，得到NAR-β-CD包合物自微乳。

1.3.4 自微乳粒徑的測(cè)定 取NAR-β-CD包合物自微乳適量，加水稀釋50倍，用納米粒分析儀測(cè)定自微乳乳滴的粒徑。

1.3.5 飽和載藥量的測(cè)定 將過(guò)量的NAR-β-CD包合物加入到空白自微乳中，于60℃水浴中渦旋攪拌，以促進(jìn)其溶解，然后在37℃水浴中平衡48 h，10 000 r/min離心10 min，上清液用0.45 μm的微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液用甲醇稀釋至適宜倍數(shù)，采用HPLC測(cè)定NAR含量，計(jì)算飽和載藥量。

1.3.6 偽三元相圖初步篩選 將不同質(zhì)量比的乳化劑與助乳化劑Km值 （3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3）混勻后，與油相按9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9的比例混合，滴加水相中并觀察，直至形成帶有藍(lán)色乳光溶液或澄清透明溶液，采用origin 9.0程序繪制偽三元相圖，以相圖中自微乳存在區(qū)域的大小來(lái)篩選乳化劑和助乳化劑。

1.3.7 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化處方 在前期偽三元相圖篩選處方的基礎(chǔ)上，選擇對(duì)自微乳性質(zhì)影響較大的兩個(gè)因素油相質(zhì)量分?jǐn)?shù)（X1）及Km（X2）為考察因素，運(yùn)用偽三元相圖對(duì)Km值進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Km為4時(shí)，出現(xiàn)較大面積凝膠區(qū)域，故Km的范圍為1～3；油相質(zhì)量分?jǐn)?shù)越低越有利于自微乳體系的形成和穩(wěn)定，故將油相質(zhì)量分?jǐn)?shù)的范圍為10%～40%。以載藥量、粒徑為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法對(duì)處方進(jìn)行優(yōu)化，因素水平見(jiàn)表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2[8]。

表1 星點(diǎn)設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Factors and levels of central composite design

表2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Central composite design and response

2 結(jié)果與分析

2.1 NAR-β-CD包合物在不同介質(zhì)中溶解度的測(cè)定

由表3可知，NAR-β-CD包合物在不同油相中的溶解度順序依次為油酸乙酯＞GTCC＞油酸，且NAR-β-CD包合物在油酸乙酯中的溶解度明顯大于油酸和GTCC，故油相確定為油酸乙酯。NAR-β-CD包合物在不同乳化劑中的溶解度順序依次為OP乳化劑＞聚山梨酯80＞Cremophor RH40，NAR-β-CD包合物在不同助乳化劑中的溶解度順序依次為PEG 400＞異丙醇＞1，2-丙二醇，故乳化劑初步確定為OP乳化劑或聚山梨酯80，助乳化劑初步確定為異丙醇或PEG 400。

表3 NAR-β-CD包合物在不同介質(zhì)中的溶解度Table 3 Solubility of NAR-β-CD inclusion complex in different media

2.2 偽三元相圖初步篩選處方

在Km值（1∶1）相同的條件下，自微乳區(qū)域的面積見(jiàn)圖1。即當(dāng)油相為油酸乙酯，乳化劑為聚山梨酯80，助乳化劑為PEG400時(shí)的所形成的自微乳區(qū)域最大。因此初步選定該處方為后續(xù)待優(yōu)化處方。

2.3 星點(diǎn)-設(shè)計(jì)效應(yīng)面法優(yōu)化處方

2.3.1 模型擬合 采用Design Expert 8.0.6軟件，分別對(duì)各因素水平進(jìn)行多元線性回歸和非線性回歸（二項(xiàng)式公式擬合），多元線性回歸方程：載藥量（Y1）＝131.21-6.04A-2.17 B，r＝0.254；粒徑 （Y2）＝42.79-3.03A＋1.13 B，r＝0.158；通過(guò)多元線性回歸方程可以看出，相關(guān)系數(shù)均較低，表示自變量與因變量之間線性相關(guān)性較差，多元線性回歸擬合度不佳，預(yù)測(cè)性較差，故采用二項(xiàng)式擬合。二項(xiàng)式擬合模型為載藥量 （Y1）＝149.30-6.04A-2.17B-4.38AB－6.51A2－22.89B2，r＝0.9；粒徑 （Y2）＝29.52-3.03A＋1.13B-3.68AB＋1.56A2＋20.01B2，r＝0.934。兩個(gè)二項(xiàng)式擬合方程的相關(guān)系數(shù)分別是0.9和0.934，表明此設(shè)計(jì)模型擬合程度良好，可以用此模型對(duì)NAR包合物自微乳處方進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。

2.3.2 效應(yīng)面優(yōu)化 由Design Expert 8.0.6軟件繪制不同影響因素對(duì)于響應(yīng)值的三維曲線，載藥量的效應(yīng)曲面見(jiàn)圖2。根據(jù)方程和響應(yīng)面圖確定NAR包合物自微乳的最優(yōu)處方為：油相比例為14.39%，Km值為2.05；載藥量理論值為159.435 mg/g，粒徑理論值為28.35 nm。

圖1 不同乳化劑及助乳化劑的偽三元相圖Fig.1 Different surfactants and cosurfactants on pscudo-ternary phase diagram

圖2 載藥量、粒徑的效應(yīng)面的三維圖Fig.2 Response surface plot （3D）of drug loading capacity and particle size

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)優(yōu)化的最佳處方，制備N(xiāo)AR包合物自微乳驗(yàn)證試驗(yàn)，并對(duì)載藥量和粒徑進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4。其中偏差＝（預(yù)測(cè)值－實(shí)測(cè)值）/預(yù)測(cè)值。通過(guò)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)可知，最優(yōu)處方粒徑和載藥量的真實(shí)值與預(yù)測(cè)值之間為顯著性差異，說(shuō)明星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法所建立的模型預(yù)測(cè)性良好，可較好地應(yīng)用于NAR包合物自微乳的處方優(yōu)化。

表4 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面優(yōu)化法驗(yàn)證Table 4 Verification of the central composite designresponse surface methodology

其中，載藥量偏差為1.12%，粒徑偏差為1.28%。

3 結(jié)語(yǔ)

自微乳的基本組成包括油相、乳化劑和助乳化劑，本處方油相篩選時(shí)，選用半合成中鏈甘油三酯衍生物，因其具有不同的飽和度或水解基團(tuán)，可增加藥物的溶解度并具有一定的乳化能力。本研究中乳化劑的選擇一般采用高親水親油平衡 （HLB11-15）值的非離子型乳化劑，如較為常用的聚山梨酯80、Cremophor RH40等，可改變小腸上皮細(xì)胞膜的流動(dòng)性和細(xì)胞間緊密連接，增加藥物的膜滲透性，改善藥物的吸收。處方中助乳化劑選擇能與乳化劑相溶的低相對(duì)分子質(zhì)量的醇類(lèi)如PEG400、異丙醇等可輔助溶解藥物，主要用于提高膜的牢固性和界面膜的柔順性流動(dòng)性，調(diào)節(jié)助乳化劑的HLB值，同時(shí)又減少乳化劑的用量，降低其潛在毒性。

在自微乳處方篩選中，通過(guò)測(cè)定NAR-β-CD包合物溶解度，可以看出NAR-β-CD包合物在各介質(zhì)中溶解度明顯大于NAR在各介質(zhì)中的溶解度，但NAR在油酸乙酯中溶解度仍然最大，且明顯大于其他油相[9]。NAR在乳化劑聚山梨酯80和OP乳化劑中溶解度均較好；在助乳化劑PEG 400中溶解度最大，異丙醇次之，但溶解度相差不是太大，均可考慮作為處方成分使用。

β-CD包合和制成自微乳都是增加難溶性藥物溶解度和提高難溶性藥物口服生物利用度的常用方法，本研究首次將包合技術(shù)和自微乳化技術(shù)相結(jié)合，先將NAR制成包合物，增加了NAR的溶解度和穩(wěn)定性，再將NAR-β-CD包合物制成自微乳，進(jìn)一步增加NAR的溶解度，此方法拓展了包合技術(shù)的應(yīng)用范疇，創(chuàng)新了自微乳化技術(shù)的形式。

作者在測(cè)定溶解度的基礎(chǔ)上采用偽三元相圖所形成微乳區(qū)的大小初步篩選乳化劑和助乳化劑，在相同Km時(shí)，乳化劑為聚山梨酯80，助乳化劑為PEG400時(shí)所形成的區(qū)域最大。

運(yùn)用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化NAR-β-CD包合物自微乳處方時(shí)，以載藥量和粒徑為考察指標(biāo)，粒徑越小，油水界面積越大，穩(wěn)定性、吸收越好，生物利用度越高；載藥量愈大，越有利于靈活調(diào)整臨床用藥劑量，愈易滿足臨床需要。

前期實(shí)驗(yàn)將NAR制成NAR-β-CD包合物，并比較了兩者在人工胃液中90 min的累積溶出率，結(jié)果表明，NAR制成NAR-β-CD包合物后溶出度顯著提高。將NAR-β-CD包合物制成自微乳后，其溶出度是否比NAR-β-CD包合物高，在后續(xù)工作中有待進(jìn)一步研究。

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Optimization of Self-Microemulsifying Drug Delivery System for Naringenin-β-Cyclodextrin Inclusion Complex by Central Composite Design and Response Surface Method

WANG Zhangjie， SHI Lingli， HUA Fang， YANG Mengfan
（School of Pharmaceutical Sciences，Anhui Xinhua College，Hefei 230088，China）

This study was aim to investigate the formula of self-microemulsifying drug delivery system for naringenin naringenin-β-cyclodextrin （NAR-β-CD）inclusion complex by central composite design-response surface method.The solubility test of NAR-β-CD inclusion complex in different secondary solvents and pseudotemary phase diagam were utilized to select components of NAR-β-CD inclusion complex self-microemulsifying drug delivery system.According to the drug loading and particle size of naringenin in different self-microemulsifying drug prescriptions，the optimal prescription was determined using the central composite design and response surface method.The optimal prescription of NAR-β-CD inclusion complex self-microemulsifying drug delivery system was composed of Ethyloleate（oil），Polysorbate 80 （surfactant），and PEG 400（co-surfactant），with oil ratio of 14.39%，and the Kmat 2.05.The drug loading of naringenin was 159.435 mg/g，and particle size was 28.35 nm.

NAR-β-CD inclusion complex，self-microemulsifying；centralcompositedesign，response surface

TS 23

A

1673—1689（2017）03—0310—05

2015-03-18

國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201312216024）；安徽高校自然科學(xué)研究項(xiàng)目（KJ2016A312）；安徽新華學(xué)院校級(jí)質(zhì)量工程項(xiàng)目（2013jgkcx02）；安徽新華學(xué)院校級(jí)科研項(xiàng)目（2013zr008）。

王章姐（1982—），女，安徽樅陽(yáng)人，醫(yī)學(xué)碩士，副教授，主要從事藥物新劑型方面的研究。E-mail：40462634@qq.com

王章姐，施伶俐，華芳，等.星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化柚皮素包合物自微乳給藥系統(tǒng)[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2017，36（03）：310-314.