產(chǎn)丙谷二肽重組大腸桿菌的構(gòu)建及發(fā)酵優(yōu)化

何艷春， 劉沛沛， 張震宇*， 孫付保， 沈 松

（1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；3.江南大學(xué) 糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫214122）

產(chǎn)丙谷二肽重組大腸桿菌的構(gòu)建及發(fā)酵優(yōu)化

何艷春1，2，3， 劉沛沛1，2，3， 張震宇*1，2，3， 孫付保1，2，3， 沈 松1，2，3

（1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；3.江南大學(xué) 糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫214122）

SAET基因編碼的α-氨基酸酯酰基轉(zhuǎn)移酶能夠以丙氨酸甲酯鹽酸鹽和谷氨酰胺為底物縮合生成L-丙氨酰-L-谷氨酰胺.為了使α-氨基酸酯?；D(zhuǎn)移酶能夠在大腸桿菌中過量表達(dá)，在保證氨基酸序列不變的前提下，優(yōu)化密碼子和mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，共改變了396個(gè)堿基，GC含量由原來的42.15%升高到48.22%；將優(yōu)化后的基因分別與phoC啟動(dòng)子和色氨酸串聯(lián)啟動(dòng)子相連并插入到不同質(zhì)粒中，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌，DH5α/pET21a-phoC-SAET產(chǎn)量最高。通過對(duì)重組大腸桿菌生產(chǎn)L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的條件研究發(fā)現(xiàn)，最佳培養(yǎng)基是：葡萄糖15 g/L，酵母提取物10 g/L，胰蛋白胨10 g/L，NH4AC 5 g/L，KH2PO46.75 g/L，K2HPO42.25 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L。最適轉(zhuǎn)化條件是：將發(fā)酵液加入到含Ala-OMe·HCl 100 mmol/L，Gln 50 mmol/L的pH 9的溶液中，25℃反應(yīng)1.5 h。優(yōu)化后產(chǎn)量達(dá)到383 mg/L，是優(yōu)化前的3.9倍。

重組大腸桿菌；基因優(yōu)化；α-氨基酸酯?；D(zhuǎn)移酶；發(fā)酵條件優(yōu)化

近年來，谷氨酰胺（Gln）作為特殊的免疫營養(yǎng)素成為各學(xué)科領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，尤其在機(jī)體應(yīng)激狀態(tài)下對(duì)維護(hù)腸道結(jié)構(gòu)和免疫功能的完整性具有不可替代的作用[1]，谷氨酰胺被認(rèn)為是應(yīng)激狀態(tài)下的“條件必需氨基酸”，比如在斷奶仔豬、雞和魚類等飼料中添加谷氨酰胺可提高機(jī)體免疫功能和抗病能力。然而谷氨酰胺水溶性差（36 g/L），在加熱條件下易生成有毒的焦谷氨酸和氨，限制了其在臨床上的應(yīng)用。相對(duì)應(yīng)的，含L-谷氨酰胺的小肽，尤其是L-丙氨酰-L-谷氨酰胺（L-alanyl-L-glutamine，丙谷二肽），由于具有高熱穩(wěn)定性和水溶性（586 g/L）[2-3]，在體內(nèi)能夠迅速地分解為L-谷氨酰胺等優(yōu)點(diǎn)引起了國內(nèi)外的廣泛關(guān)注，該小肽能夠彌補(bǔ)谷氨酰胺的不足，擴(kuò)大了其在臨床上作為靜脈營養(yǎng)制劑的應(yīng)用范圍.

目前主要是通過化學(xué)合成的方法來合成L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，通常有以下三種方法：1）N-羰基-丙氨酸酐法[4]，該法雖不需要保護(hù)基團(tuán)，但易產(chǎn)生三肽等副產(chǎn)物，導(dǎo)致產(chǎn)物收率低；2）使用保護(hù)基法[5-6]，該法需要引入和去除保護(hù)基團(tuán)，同時(shí)需要用到有毒試劑，對(duì)環(huán)境有一定的破壞力；3）D-2-鹵-丙酰-L-谷氨酰胺氨解法[7]。然而目前這些化學(xué)合成方法通常合成過程復(fù)雜，中間環(huán)節(jié)多，易生成副產(chǎn)物，目的產(chǎn)物提純困難，合成條件苛刻，常常使用一些有毒有害物質(zhì)。

隨著現(xiàn)代工業(yè)生物技術(shù)發(fā)展，利用微生物酶法進(jìn)行丙谷二肽生物合成引起了研究者們的興趣。Kazuhiko Tabata等[8]人發(fā)現(xiàn)在Bacillus subtilis 168中ywfE基因編碼一種L-氨基酸連接酶，此酶能夠催化游離的L-丙氨酸和L-谷氨酰胺合成L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，副產(chǎn)物較少，通過搖瓶實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵合成L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的質(zhì)量濃度為0.12 g/L。Tabata等[9]利用大腸桿菌過表達(dá)L-氨基酸連接酶，以葡萄糖和銨鹽為底物直接合成丙谷二肽。Yoshinori Hirao等[10]篩選到了一株能表達(dá)α-氨基酸酯酰基轉(zhuǎn)移酶的菌，該酶能以L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽和L-谷氨酰胺為底物合成L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。

中國的丙谷二肽產(chǎn)品主要依靠進(jìn)口，然而國外產(chǎn)品采用的工藝合成成本高，步驟多，因而價(jià)格高。微生物酶法合成丙谷二肽具有反應(yīng)條件溫和、環(huán)境污染少、產(chǎn)率高、成本低等優(yōu)點(diǎn)，利用微生物酶法合成丙谷二肽并將其產(chǎn)業(yè)化具有現(xiàn)實(shí)意義。目前尚未發(fā)現(xiàn)國內(nèi)研究者利用微生物酶法進(jìn)行丙谷二肽合成的相關(guān)報(bào)道，因此，作者嘗試構(gòu)建一株產(chǎn)丙谷二肽的重組大腸桿菌，并對(duì)其生長和反應(yīng)條件進(jìn)行初步優(yōu)化。主要從以下幾個(gè)方面來開展實(shí)驗(yàn)：Sphingobacterium siyangensis密碼子偏好性與大腸桿菌相差較大，作者通過密碼子優(yōu)化，使得α-氨基酸酯?；D(zhuǎn)移酶更加適合在大腸桿菌中表達(dá)；在外源基因的表達(dá)中，質(zhì)粒的種類也是影響蛋白質(zhì)表達(dá)的一個(gè)重要因素。本研究通過優(yōu)化質(zhì)粒，并選擇與其相匹配的宿主菌來提高重組菌產(chǎn)丙谷二肽的能力；發(fā)酵培養(yǎng)基是影響重組菌生長和產(chǎn)酶的重要因素，同時(shí)，催化反應(yīng)條件能影響酶活性，本研究通過優(yōu)化培養(yǎng)基與催化反應(yīng)條件，使其更易積累丙谷二肽。

1 材料與方法

1.1 材料

L-丙氨酰-L-谷氨酰胺 （純度＞98%，HPLC）：TCI公司；L-谷氨酰胺（BR）：國藥集團(tuán)；L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽 （純度＞99%，BR）：薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司；鄰苯二甲醛（純度＞99%，HPLC）：Sigma公司。

1.2 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌 JM109，DH5α，BL21（DE3），質(zhì)粒pES-Ptrp2-Hyp，pUC19，pAMP，pET21a，pET28a：均為作者所在實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.3 氨基酸酯?；D(zhuǎn)移酶的優(yōu)化改造

根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性使用J cat軟件對(duì)Sphingobacterium siyangensis中α-氨基酸酯?；D(zhuǎn)移酶肽段的編碼序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，使GC含量值接近大腸桿菌；為了便于酶切操作，根據(jù)同義密碼子原理消除酶切位點(diǎn)；使用RNA structure軟件優(yōu)化RNA翻譯起始區(qū)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，促進(jìn)翻譯的順利進(jìn)行。優(yōu)化后的序列直接連在phoC啟動(dòng)子[11-13]的下游，由旭冠公司進(jìn)行全基因合成，并與載體pUC19連接。

1.4 表達(dá)載體的構(gòu)建

以pUC19-phoC-SAET為模板，以P上和P下為引物，所用引物見表1。PCR擴(kuò)增：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，52℃退火 30 s，72℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)，72℃終延伸10 min。將PCR產(chǎn)物與pUC19-Ptrp2-Hyp載體一起用BamHⅠ，HindⅢ雙酶切，膠回收SAET與pUC19-Ptrp2片段，過夜連接構(gòu)建pUC19-Ptrp2-SAET，轉(zhuǎn)化E.coli JM109，挑取陽性克隆至LB中過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，單、雙酶切驗(yàn)證，將驗(yàn)證正確的克隆子進(jìn)行DNA測序。

將驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒pUC19-phoC-SAET與pAMP、pET21a、pET28a同時(shí)進(jìn)行EcoRⅠ、HindⅢ雙酶切，膠回收載體與phoC-SAET片段，過夜連接構(gòu)建 pAMP-phoC-SAET、pET21a-phoC-SAET、pET28a-phoC-SAET。

將pES-Ptrp2-SAET與pUC19、pAMP、pET21a、pET28a進(jìn)行EcoRⅠ、BamHⅠ雙酶切，膠回收后，過夜連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pUC19-Ptrp2-SAET、pAMPPtrp2-SAET、pET21a-Ptrp2-SAET、pET28a-Ptrp2-SAET。

表1 實(shí)驗(yàn)所需引物Table 1 Primers used in this study

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)條件

接種一環(huán)重組大腸桿菌于LB培養(yǎng)基中，30℃、220 r/min過夜培養(yǎng)，按2%接種體積分?jǐn)?shù)接種至裝有30 mL LB培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，30℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)8 h，按5%接種體積分?jǐn)?shù)接種至裝有25 mL發(fā)酵培養(yǎng)基SF（20 g/L葡萄糖，10 g/L胰蛋白胨，10 g/L酵母提取物，5 g/L （NH4）2SO4，3 g/L KH2PO4，1 g/L K2HPO4，0.5 g/L MgSO4·7H2O）的250 mL搖瓶中，22℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)36 h。

1.6 完整細(xì)胞生產(chǎn)丙谷二肽的反應(yīng)條件

取0.5 mL發(fā)酵液，加入500 μL含有200 mmol/L Gln，200 mmol/L Ala-OMe·HCl，pH 8.5的底物溶液，混勻后置25℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)2 h，加入等體積的體積分?jǐn)?shù)1.7%H3PO4溶液終止反應(yīng)，12 000 r/min離心5 min，取上清液按1.8所述測定丙谷二肽質(zhì)量濃度。

1.7 酶活的測定

取0.5 mL發(fā)酵液，加入500 μL含有200 mmol/L Gln，200 mmol/L Ala-OMe·HCl，pH 9的 0.1 mol/L硼酸-NaOH緩沖液，混勻后置25℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)5 min，加入等體積的體積分?jǐn)?shù)1.7%H3PO4溶液終止反應(yīng)，12 000 r/min離心5 min，取上清液做柱前衍生。（一個(gè)酶活單位定義為1 mL發(fā)酵液在1 min內(nèi)生成1 μmol產(chǎn)物所需酶量）

1.8 丙谷二肽的檢測

1）OPA衍生：取標(biāo)準(zhǔn)樣品或是反應(yīng)液50 μL，加入200 μL甲醇，200 μL 0.1 mmol/L四硼酸鈉，50 μL衍生試劑（50 mg鄰苯二甲醛，加入4.5 mL甲醇溶解，加入500 μL 0.1 mmol/L四硼酸鈉，50 μL β-巰基乙醇，混勻置4℃，可保存一周）混勻，于37℃恒溫水浴鍋中水浴25 min。加入500 μL流動(dòng)相溶解，0.22 μm有機(jī)系膜過濾，取10 μL做HPLC分析。

2）HPLC檢測：采用高效液相色譜法檢測L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的濃度，色譜條件如下：色譜柱為X-bridge C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫為40℃；流動(dòng)相為12.5 mmol/L磷酸緩沖液（pH 7.2）∶乙腈=83∶17；流速為1 mL/min。

1.9 發(fā)酵優(yōu)化

主要優(yōu)化培養(yǎng)基成分 （碳源種類及濃度的優(yōu)化、氮源種類及質(zhì)量濃度的優(yōu)化、磷酸鹽濃度的優(yōu)化）、種齡的優(yōu)化和酶催化反應(yīng)條件，具體包括pH（8、8.5、9、9.5、10），溫度（10、15、20、25、30、35℃），酶與底物反應(yīng)時(shí)間（0.5、1、1.5、2、2.5 h），兩種底物濃度比 （Ala-OMe·HCl∶Gln=100∶50，100∶100，100∶150，100∶200，100∶250，200∶200）。

2 結(jié)果與討論

2.1 α-氨基酸酯?；D(zhuǎn)移酶基因的優(yōu)化

密碼子的選擇是影響表達(dá)的因素之一，由于遺傳密碼子的簡并性，絕大多數(shù)氨基酸都由幾種密碼子來編碼。然而，E.coli對(duì)編碼同一種氨基酸的各種密碼子的使用頻率并不相同，甚至相差很大[14]。稀有密碼子的存在可大大降低蛋白質(zhì)合成的效率，使蛋白質(zhì)的表達(dá)量降低，甚至使蛋白質(zhì)合成中途停止[15]。因此，用E.coli使用頻率高的密碼子替換稀有密碼子，可提高α-氨基酸酯?；D(zhuǎn)移酶的表達(dá)水平。

α-氨基酸酯?；D(zhuǎn)移酶來源于Sphingobacterium siyangensis，基因序列全長1 860 bp，共編碼619個(gè)氨基酸。通過數(shù)據(jù)庫（http：//www. kazusa.or.jp/codon/） 分 析 大 腸 桿 菌 K12 和Sphingobacterium siyangensis的密碼子使用頻率，結(jié)果表明兩者差異較大。比如在 Sphingobacterium siyangensis中UGG使用頻率為47.8%，而在大腸桿菌 中 僅 為 10.7% ；GGA 在 Sphingobacterium siyangensis的使用頻率為32.6%，而在大腸桿菌中僅為9.2%。因此，首先使用網(wǎng)頁（http：//www.jcat.de/）進(jìn)行密碼子優(yōu)化，CAI值[16]由原來的0.26升高到1.0，表明優(yōu)化后的SAET基因更適于在大腸桿菌中表達(dá)。然后經(jīng)過DNAMAN軟件分析，優(yōu)化后的SAET基因序列中有EcoRⅠ這個(gè)酶切位點(diǎn)，為了便于實(shí)驗(yàn)操作，通過同義轉(zhuǎn)化消除EcoRⅠ這個(gè)位點(diǎn)，最后使用軟件RNA Structure 5.3對(duì)優(yōu)化后的SAET進(jìn)行mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測。預(yù)測結(jié)果表明，優(yōu)化后基因序列5’端處于閉環(huán)狀態(tài)，不利于與核糖體結(jié)合，手動(dòng)調(diào)整5’端核苷酸，使得5’端為開環(huán)狀態(tài)，結(jié)果見圖1。同時(shí)用在大腸桿菌中使用頻率較高的密碼子替換頻率低的，調(diào)整預(yù)測結(jié)果中存在的大莖環(huán)結(jié)構(gòu)，降低核糖體結(jié)合mRNA的勢能，共改變78個(gè)堿基，吉布斯自由能（ΔG）由原來的△G=-525.8 kcal/mol改變?yōu)椤鱃=-507.5 kcal/mol。經(jīng)過以上三步優(yōu)化共改變384個(gè)堿基，改變了350個(gè)密碼子，GC含量由原來的42.15%上升至48.22%，更加接近大腸桿菌中的GC含量（50.18%），最終優(yōu)化結(jié)果見表2。

2.2 重組大腸桿菌的構(gòu)建

2.2.1 質(zhì)粒的優(yōu)化 由于啟動(dòng)子強(qiáng)度的不同，可產(chǎn)生不同強(qiáng)度的基因表達(dá)水平，弱啟動(dòng)子能夠在維持細(xì)胞正常代謝生長的前提下表達(dá)目的產(chǎn)物，而強(qiáng)啟動(dòng)子雖能大量表達(dá)目的蛋白質(zhì)，但往往對(duì)菌體產(chǎn)生代謝負(fù)擔(dān)。合成的pUC19-phoC-SAET由phoC啟動(dòng)子調(diào)控α-氨基酸酯?；D(zhuǎn)移酶表達(dá)，phoC是一個(gè)弱啟動(dòng)子，為了比較不同強(qiáng)度的啟動(dòng)子對(duì)表達(dá)α-氨基酸酯?；D(zhuǎn)移酶的影響，作者在α-氨基酸酯酰基轉(zhuǎn)移酶基因上游引入一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子（色氨酸串聯(lián)啟動(dòng)子）構(gòu)建一個(gè)由色氨酸串聯(lián)啟動(dòng)子調(diào)控目的基因表達(dá)的重組質(zhì)粒。該啟動(dòng)子是一個(gè)由兩個(gè)色氨酸啟動(dòng)子串聯(lián)而成的強(qiáng)啟動(dòng)子，全長237 bp，5′端為EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，3’端為HindⅢ酶切位點(diǎn)。

圖1 優(yōu)化前與優(yōu)化后的α-氨基酸酯?；D(zhuǎn)移酶mRNA 5’端二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.1 α-amino acid ester acyltransferase’s potential mRNA secondary structures of unadjusted and adjusted

表2 α-氨基酸酯?；D(zhuǎn)移酶優(yōu)化結(jié)果Table 2 Results of codon optimization process α-amino acid ester acyltransferase

pUC19-phoC-SAET經(jīng)單、雙酶切，結(jié)果見圖2。3株菌單、雙酶切驗(yàn)證均正確，經(jīng)DNA測序該序列完全正確。以驗(yàn)證正確的pUC19-phoC-SAET為模板，P上和P下為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物與載體pES-Ptrp2-Hyp連接，構(gòu)建由色氨酸串聯(lián)啟動(dòng)子調(diào)控目的基因表達(dá)的重組質(zhì)粒pES-Ptrp2-SAET，轉(zhuǎn)化E.coli JM109，提取質(zhì)粒，單、雙酶切驗(yàn)證結(jié)果見圖3-4，經(jīng)DNA測序該序列完全正確。

影響外源基因表達(dá)水平的因素很多，除啟動(dòng)子外，質(zhì)粒的種類也是影響蛋白質(zhì)表達(dá)的一個(gè)重要因素，接下來通過構(gòu)建不同質(zhì)粒來考察各質(zhì)粒產(chǎn)丙谷二肽的能力。將pUC19-phoC-SAET和pES-Ptrp2-SAET雙酶切，膠回收目的片段，將連有Ptrp2啟動(dòng)子和連有phoC啟動(dòng)子的α-氨基酸酯酰基轉(zhuǎn)移酶基因片段分別連接在 pUC19、pAMP、pET21a、pET28a上，構(gòu)建重組質(zhì)粒 pUC19-Ptrp2-SAET、pAMP-Ptrp2-SAET、pET21a-Ptrp2-SAET、pET28a-Ptrp2-SAET、pUC19-phoC-SAET、pAMP-phoCSAET、pET21a-phoC-SAET、pET28a-phoC-SAET。將構(gòu)建的9個(gè)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coli JM109，經(jīng)搖瓶發(fā)酵測產(chǎn)量，結(jié)果見圖5。當(dāng)載體是pET系列（pET21a，pET28a）時(shí)，含有phoC啟動(dòng)子的實(shí)驗(yàn)組（A、B）丙谷二肽產(chǎn)量高于含Ptrp2啟動(dòng)子的實(shí)驗(yàn)組（F、G）；當(dāng)載體是pUC19系列（pUC19，pAMP）時(shí)，情況則剛好相反，含有phoC啟動(dòng)子的實(shí)驗(yàn)組（C、D）比含Ptrp2啟動(dòng)子的（H，I組）產(chǎn)丙谷二肽能力弱。另外，pES也是由pUC19改造的，它的丙谷二肽產(chǎn)量（E）與pUC19系列（C、D）水平相當(dāng)。A，F(xiàn)和I組產(chǎn)量顯著高于其他組，分別達(dá)到96、92、72 mg/L，因此選擇A組質(zhì)粒。其中A、F組均為pET21a質(zhì)粒，表明pET21a較其他質(zhì)粒而言，可能更加適合α-氨基酸酯?；D(zhuǎn)移酶的表達(dá)。

圖3 PCR產(chǎn)物Fig.3 Products of PCR

圖4 pES-Ptrp2-SAET單、雙酶切電泳結(jié)果Fig.4 Single，double digest of pES-Ptrp2-SAET

圖5 不同重組質(zhì)粒對(duì)丙谷二肽產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of different recombinant expression vectors

2.2.2 宿主菌的優(yōu)化 重組質(zhì)粒在不同宿主菌中的穩(wěn)定性差別較大，宿主菌的細(xì)胞遺傳特性會(huì)影響重組質(zhì)粒的復(fù)制和傳遞，最終影響重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性[17]，因此選擇適合的宿主細(xì)胞顯得非常重要。在上面質(zhì)粒優(yōu)化基礎(chǔ)上，通過考察質(zhì)粒與宿主匹配性來選擇質(zhì)粒相對(duì)應(yīng)的宿主菌，將pET21a-phoC-SAET轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109、DH5α、BL21（DE3）中，搖瓶發(fā)酵結(jié)果見表3。宿主菌DH5α不管是產(chǎn)量還是酶活都是最高的，因此選擇DH5α/pET21a-phoC-SAET為生產(chǎn)菌。

表3 不同重組大腸桿菌的丙谷二肽產(chǎn)量與酶活Table 3 Yield and α-amino acid ester acyltransferase activity of different recombinant strains

2.3 發(fā)酵優(yōu)化

影響發(fā)酵的因素很多，通?？煞譃榘l(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件兩個(gè)方面。通過對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行初步優(yōu)化來考察該重組菌發(fā)酵產(chǎn)丙谷二肽的能力。

2.3.1 培養(yǎng)基優(yōu)化

1）種子生長曲線的繪制：種子培養(yǎng)是為了獲得足夠多生長代謝旺盛的菌體。以重組菌 DH5α/ pET21a-phoC-SAET為出發(fā)菌株，繪制重組菌的生長曲線，結(jié)果見圖6。由圖6可知，菌體接入培養(yǎng)基LB中，4 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，4～12 h為對(duì)數(shù)生長期，14 h后進(jìn)入穩(wěn)定期。一般在對(duì)數(shù)生長中后期，菌體的代謝活性較高，生命力強(qiáng)，種子活力較好。因此選擇最佳種齡為10 h。

圖6 重組菌DH5α/pET21a-phoC-SAET生長曲線Fig.6 Growth curve of recombinant E.coli DH5α/ pET21a-phoC-SAET

2）碳源的優(yōu)化：在基因工程菌發(fā)酵過程中，培養(yǎng)基的組成既要提高工程菌的生長速率，又要保證外源基因能夠有效表達(dá)，碳源種類對(duì)菌體生長和外源基因表達(dá)有較大影響。采用葡萄糖、甘油、乳糖、糊精、可溶性淀粉為碳源，添加量為20 g/L，考察碳源種類對(duì)丙谷二肽積累量的影響，結(jié)果見圖7（a）。由圖7可知，以葡萄糖為碳源時(shí)丙谷二肽產(chǎn)量最高，遠(yuǎn)高于乳糖、糊精等碳源，得出葡萄糖是適合丙谷二肽積累的碳源。進(jìn)一步考察葡萄糖質(zhì)量濃度對(duì)丙谷二肽的影響，結(jié)果見圖7（b）。由圖可知，隨著葡萄糖質(zhì)量濃度的升高，丙谷二肽產(chǎn)量先逐步上升，在葡萄糖質(zhì)量濃度大于15 g/L時(shí)，丙谷二肽產(chǎn)量逐步下降，因此最佳質(zhì)量濃度為15 g/L。

圖7 碳源優(yōu)化Fig.7 Optimization of different carbon source

3）氮源的優(yōu)化：培養(yǎng)基中的氮源能為微生物提供生長所必需的核苷酸、維生素和礦物質(zhì)元素等。氮源的種類對(duì)微生物的生長有著較大的影響，分別采用0.1 mol/L的尿素、硫酸銨、氯化銨、乙酸銨作為培養(yǎng)基的無機(jī)氮源，考察不同種類氮源對(duì)丙谷二肽積累的影響，結(jié)果見圖8（a）。由圖8可知，乙酸銨作為氮源時(shí)，丙谷二肽產(chǎn)量達(dá)到353 mg/L，是硫酸銨的兩倍多，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他種類的氮源。這可能是因?yàn)橐宜徜@不僅提供氮元素，還提供乙酸根離子?？疾煲宜徜@質(zhì)量濃度（0、5、10、15、20、25 g/L）對(duì)產(chǎn)丙谷二肽的影響，結(jié)果見圖8（b）。由圖8可知，乙酸銨質(zhì)量濃度在5 g/L時(shí)，丙谷二肽產(chǎn)量最高，在乙酸銨質(zhì)量濃度大于20 g/L時(shí)能夠抑制大腸桿菌的生長。與無機(jī)氮源相比，有機(jī)氮源除含有豐富的蛋白質(zhì)、肽類、游離的氨基酸以外，還含有少量的糖類、脂肪和生長因子等。因此，分別采用蛋白胨、魚粉蛋白胨、胰蛋白胨、酵母膏、牛肉浸膏、酵母提取物作為重組菌發(fā)酵的有機(jī)氮源，添加量為20 g/L，考察不同有機(jī)氮源對(duì)重組菌產(chǎn)丙谷二肽的影響，結(jié)果見圖8（c）。由圖8可知，以酵母提取物與胰蛋白胨為有機(jī)氮源時(shí)，丙谷二肽產(chǎn)量高于其他氮源，接下來考察不同比例的兩種有機(jī)氮源對(duì)產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明，當(dāng)兩種底物以1∶1的比例添加時(shí)，與單獨(dú)添加一種有機(jī)氮源相比，丙谷二肽產(chǎn)量更高，因此，選擇有機(jī)氮源的添加為：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物10g/L。

圖8 氮源的優(yōu)化Fig.8 Optimization of different inorganic nitrogen source

4）磷酸鹽濃度的優(yōu)化：在微生物生長代謝過程中，少量無機(jī)鹽或其他營養(yǎng)因子起著極其重要的作用。作者所在實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的重組菌中含有一個(gè)phoC啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子由磷酸鹽濃度調(diào)控。因此考察磷酸鹽濃度對(duì)重組菌發(fā)酵產(chǎn)丙谷二肽的影響，結(jié)果見圖9。由圖可知，在磷酸鹽濃度為36、48 mmol/L時(shí)，丙谷二肽產(chǎn)量稍高于其他實(shí)驗(yàn)組。整體來看，磷酸鹽濃度對(duì)丙谷二肽積累量的影響不大。當(dāng)培養(yǎng)基中不添加磷酸鹽時(shí)，丙谷二肽的產(chǎn)量為248.9 mg/L，培養(yǎng)基中只能提供少量磷酸根，不能滿足大量菌體生長的需要，同時(shí)因?yàn)槿狈α姿岣鶈?dòng)目的蛋白質(zhì)的表達(dá)，因此產(chǎn)量僅略低于其他組。隨著磷酸鹽濃度的增大，丙谷二肽產(chǎn)量逐漸上升，當(dāng)磷酸鹽濃度大于48 mmol/L時(shí)，產(chǎn)量有所下降?？赡苁且?yàn)榱姿猁}濃度過高時(shí)，啟動(dòng)子處于“關(guān)閉”狀態(tài)，隨著磷酸鹽被菌體利用，低于一定值時(shí)才啟動(dòng)目的蛋白質(zhì)的表達(dá)。因此選擇磷酸鹽濃度為36 mmol/L。

圖9 磷酸鹽濃度的優(yōu)化Fig.9 Optimization of phosphates concentration

2.3.2 反應(yīng)條件的優(yōu)化 在本實(shí)驗(yàn)中，以發(fā)酵菌體為粗酶源，在一定反應(yīng)體系下進(jìn)行酶催化反應(yīng)。催化反應(yīng)條件是影響酶活性的重要因素，因此通過對(duì)催化反應(yīng)條件初步優(yōu)化，探索產(chǎn)丙谷二肽的最適反應(yīng)條件。作者以發(fā)酵液作為粗酶源，在適合α-氨基酸酯?；D(zhuǎn)移酶催化的條件下催化丙氨酸甲酯鹽酸鹽和谷氨酰胺合成丙谷二肽。這是一個(gè)酶催化反應(yīng)，產(chǎn)物的積累與反應(yīng)時(shí)間有一定的關(guān)系，因此考察反應(yīng)時(shí)間對(duì)丙谷二肽積累量的影響，結(jié)果見圖10（a）。反應(yīng)1.5 h丙谷二肽產(chǎn)量最高，是其他組的兩倍左右。由于丙氨酸甲酯在堿性溶液中不夠穩(wěn)定，反應(yīng)時(shí)間過長會(huì)導(dǎo)致底物被降解，時(shí)間過短則反應(yīng)不充分。

酶具有一定的溫度適應(yīng)范圍，通常溫度較低時(shí)，酶的催化活性也較低，而溫度超過一定值時(shí)，有可能導(dǎo)致酶失活?？疾鞙囟葘?duì)丙谷二肽產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖10（b）。溫度為10、15℃時(shí)，酶活性較低，隨著溫度的增加，丙谷二肽產(chǎn)量增加，高于25℃時(shí)，其產(chǎn)量反而下降，所以25℃為最適反應(yīng)溫度。

酶的穩(wěn)定性與其所處環(huán)境的pH也緊密相關(guān)，環(huán)境中的pH會(huì)影響酶分子中相關(guān)集團(tuán)的解離狀態(tài)，極端pH還會(huì)影響酶活性中心的構(gòu)象甚至使酶失活，考察不同pH值對(duì)丙谷二肽積累量的影響，結(jié)果見圖10（c）。表明pH為9時(shí)，丙谷二肽產(chǎn)量最高，低于或高于9，其產(chǎn)量均有所下降，所以pH 9為最適pH值。

圖10 反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、pH值對(duì)丙谷二肽積累量的影響Fig.10 Optimization of reaction time

在以丙氨酸甲酯鹽酸鹽和谷氨酰胺為底物的催化反應(yīng)中，Ala-OMe·HCl，Gln的Km值分別為21.3、23.3 mmol/L。不同的底物配比能影響到丙谷二肽的生成，考察底物配比對(duì)其影響，結(jié)果見圖11?？芍?，在底物濃度比為200∶200 mmol/L時(shí)，丙谷二肽產(chǎn)量最高，然而，底物濃度分別為50 mmol/L谷氨酰胺、100 mmol/L丙氨酸甲酯鹽酸鹽時(shí)，底物利用率最高，在一定程度上節(jié)約成本，且能夠減少產(chǎn)物的純化步驟。

圖11 底物配比的優(yōu)化Fig.11 Optimization of the ratio of the two substrates，AlaOMe·HCl and Gln

2.4 重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)丙谷二肽

挑取一環(huán)重組大腸桿菌DH5α/pET21a-phoCSAET接種至優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基中，以菌液為粗酶源，添加到優(yōu)化后的反應(yīng)體系中反應(yīng)，測得丙谷二肽產(chǎn)量為383 mg/L。

3 結(jié)語

作者成功構(gòu)建了國內(nèi)第一株產(chǎn)L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的重組大腸桿菌。通過優(yōu)化密碼子、質(zhì)粒、啟動(dòng)子、培養(yǎng)基組分、催化反應(yīng)條件，最高產(chǎn)量達(dá)到383 mg/L，比優(yōu)化前提高3.9倍，是利用L-氨基酸連接酶產(chǎn)丙谷二肽產(chǎn)量（0.12 g/L）的3倍。從構(gòu)建的9種質(zhì)粒中選取產(chǎn)量最高的質(zhì)粒，并考察與該質(zhì)粒相匹配的宿主細(xì)胞，得到DH5α/pET21a-phoC-SAET為最優(yōu)的重組大腸桿菌。雖然其產(chǎn)量、酶活都是最高的，但是在發(fā)酵階段，菌體生長緩慢，培養(yǎng)36 h后OD600才達(dá)到4左右，因此可調(diào)節(jié)培養(yǎng)溫度以及接種體積分?jǐn)?shù)提高菌體濃度，從而提高丙谷二肽產(chǎn)量。并且大腸桿菌基因組中有pepD，pepA，pepB，pepN等編碼的酶能夠降解二肽，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中可以考慮敲除這些蛋白酶以提高目的產(chǎn)物的積累。本研究以發(fā)酵培養(yǎng)得到的重組大腸桿菌作為粗酶源，再把菌體添加到一定的反應(yīng)體系中得到丙谷二肽，此方法工序較長，步驟偏多，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中可以考慮將底物直接添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中，一步法直接生產(chǎn)丙谷二肽。

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Construction of a L-Alanyl-L-Glutamine Producing Recombinant Strain and Optimization of Its Fermentation Conditions

HE Yanchun1，2，3， LIU Peipei1，2，3， ZHANG Zhenyu*1，2，3， SUN Fubao1，2，3， SHEN Song1，2，3
(1.SchoolofBiotechnology，Jiangnan University，Wuxi214122，China，2.Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China，3.Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

α-Amino acid ester acyltransferase，which is encoded by SAET，can synthesize L-alanyl-L-glutamine from L-alanine methyl ester hydrochloride and L-glutamine.To improve the expression level of α-amino acid ester acyltransferase in Escherichia coli，we optimized the codons and the mRNA secondary structure of SAET in the translation initiation region.Total of 396 nucleotides were changed，and the G+C ratio was simultaneously increased from 42.15%to 48.22% after optimization.Codon-optimized SAET gene was cloned into expression vectors with a tryptophan tandem promoter or phosphate promoter.DH5α/pET21a-phoC-SAET is the strain withthe highest yield.The composition of the optimized culture medium for the genetic engineered Escherichia coli to produce L-alanyl-L-glutamine is as follows：glucose 15 g/L，yeast extract 10 g/L，tryptone 10 g/L，NH4AC 5 g/L，KH2PO46.75 g/L，K2HPO42.25 g/L and MgSO4·7H2O 0.5 g/L.The optimal reaction conditions are：AlaOMe·HCl 100mmol/L，Gln 50 mmol/L，pH 9，at 25℃for 90 min.The yield is 383 mg/L，which showed 3.9 fold improvement over that of the initial condition.

recombinant Escherichia coli，codon optimization，α-amino acid ester acyltransferase，fermentation condition optimize

Q 815

A

1673—1689（2017）03—0287—09

2015-02-28

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30800018）；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金項(xiàng)目（200802951036）；工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主任基金項(xiàng)目（KLIB-ZR200801）。

*通信作者：張震宇（1976—），男，江蘇張家港人，理學(xué)博士，教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事分子生物學(xué)和發(fā)酵工程方面的研究。

E-mail：zhangzy@gmail.com

何艷春，劉沛沛，張震宇，等.產(chǎn)丙谷二肽重組大腸桿菌的構(gòu)建及發(fā)酵優(yōu)化[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2017，36（03）：287-295.