新疆和田地區(qū)維吾爾族與漢族慢性乙型肝炎患者病毒耐藥性比較研究*

張 劍，買買提江·吾布力艾山，李俊紅

·病毒性肝炎·

新疆和田地區(qū)維吾爾族與漢族慢性乙型肝炎患者病毒耐藥性比較研究*

張 劍，買買提江·吾布力艾山，李俊紅

目的 探討新疆和田地區(qū)維吾爾族和漢族慢性乙型肝炎（CHB）患者耐藥性差異。方法隨機選取2015年3月～2016年1月收治的接受拉米夫定（LAM）和/或阿德福偉（ADV）治療的CHB患者1288例，其中維吾爾族1218例，漢族70例。采用DNA微陣列芯片技術(shù)檢測血清HBV rt L180M、rtM204I/V、rtA181T/V和rtN236T四個耐藥突變位點。結(jié)果漢族CHB患者HBV基因型耐藥比例為25.7%，顯著高于維吾爾族患者的18.3%（P=0.014）；維吾爾族CHB患者男女比例為1019/199，漢族為57/13，兩組性別比無顯著性差異（P=0.087），但在耐藥基因陽性者中，維吾爾族男性比例顯著高于漢族（P=0.039）；在基因型耐藥患者中，維吾爾族CHB患者血清HBV DNA水平為（5.3±0.9）lg copies/ml，顯著低于漢族患者的（6.1±0.7）lg copies/ml，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.012）；維吾爾族基因耐藥患者血清ALT水平為（157.6±25.9）U/L、AST為（67.1±13.2）U/L、TBIL為（41.8±11.6）μmol/L，均顯著低于漢族 [分別為（203.7±45.1）U/L、（85.9±22.7）u/L、（57.4±13.5）μmol/L，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）]；維吾爾族患者和漢族患者年齡分別為（37.9±10.8）歲和（38.8±12.1）歲，無明顯差異（P＞0.05）；維吾爾族和漢族患者血清HBeAg陽性率分別為14.3%和18.6%，無明顯差異（P=0.061）；在241例維吾爾族和漢族基因型耐藥患者中，均檢測出LAM和DAV的4個耐藥變異位點的6種突變，分別為rtL180M、rtM204I、rtM204V、rtA180T、rtA180V和rtN236T；維吾爾族和漢族患者rtA1181T/V點位陽性率分別為18.4%和16.7%（P＞0.05），而維吾爾族患者rtA1181T/V點位陽性率顯著高于漢族患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；維吾爾族和漢族患者rtL180M、rtM204I/V、rtN236T點位陽性率分別為38.6%和38.9%、27.4%和27.8%、15.7%和16.7%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論漢族患者存在HBV基因耐藥比例更高，維吾爾族男性變異比例顯著高于漢族，漢族患者出現(xiàn)變異時血清HBV DNA、ALT、AST、TBIL水平更高，兩組患者在rtA181T/V位點存在顯著性差異，其他位點未見明顯差異。

慢性乙型肝炎；維吾爾族；漢族；核苷（酸）類似物；耐藥

多年來，核苷和核苷酸類藥物（NAs）已成功用于慢性乙型肝炎（CHB）的治療[1]。目前，常用的有拉米夫定（LAM）、阿德福韋酯（ADV）、替比夫定（LDT）和恩替卡韋（ETV）。在新疆地區(qū)，LAM和ADV的應(yīng)用仍較為廣泛。長期應(yīng)用核苷和核苷酸類藥物有較好的療效[2]，但長期應(yīng)用也出現(xiàn)了耐藥性問題[3-5]。LMV和ADV主要的耐藥變異位點有rt L180M、rtM204I/V、rtA181T/V和rtN236T等[6-9]。隨著HBV耐藥毒株的增多，以及先進的檢測方法和技術(shù)的成熟和應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)了rtM204I/V位點以外的與拉米夫定耐藥性發(fā)生有關(guān)的變異位點，并受到了越來越多的重視,如rtV173L、rtL180M、rtA181T、rtV207M、rtQ215S等位點的突變也可引起 HBV對拉米夫定產(chǎn)生耐藥性。目前已證實，rtA181V/T和rtN236T的單獨突變或聯(lián)合突變是導(dǎo)致阿德福韋耐藥的主要變異，同時還可伴有諸 如 rtL80V/I、rtV84M、rtV214A、rtQ215S、rtP237H等變異，這些位點的突變與乙型肝炎病毒對阿德福韋耐藥的關(guān)系還不明確，可能只是一種代償形式的突變。本研究主要對新疆和田地區(qū)維吾爾族和漢族CHB患者在病毒耐藥性和耐藥基因型方面的差異進行對比分析，以為有效的抗病毒治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2013年3月～2016年1月新疆和田地區(qū)傳染病醫(yī)院肝病科收治的CHB患者1288例，其中維吾爾族1218例（男1019例，女199例，平均年齡39.2±12.5歲），漢族70例（男57例，女13例，平均年齡36.5±10.4歲）。診斷符合慢性乙型肝炎防治指南的診斷標(biāo)準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：CHB患者在接受LAM或ADV治療超過6個月出現(xiàn)病毒學(xué)突破[10，11]或生物化學(xué)突破[12]，臨床考慮患者存在HBV耐藥可能。排除標(biāo)準(zhǔn)：半年內(nèi)使用過干擾素及其他免疫調(diào)節(jié)制劑、同時或合并感染有其他肝炎病毒、妊娠或合并其他系統(tǒng)疾病。所有患者均簽署知情同意書。

1.2 定義 （1）病毒學(xué)突破（virological breakthrough）[10]：在未更改治療方案的情況下，獲得部分或完全病毒學(xué)應(yīng)答患者血清HBV DNA水平較治療過程中最低點上升1 lg IU/ml，并經(jīng)間隔1個月以上的第 2次檢測所證實；（2）生物化學(xué)突破（biochemical breakthrough）[12]：在未更改治療方案的情況下，在治療過程中基線升高的ALT已降至正常的患者血清 ALT再次升高；（3）基因型耐藥（genotypic resistance）[13]：在抗病毒治療過程中，檢測到與HBV耐藥相關(guān)的位點突變。

1.3 檢測方法 采用實時熒光定量PCR法檢測HBV DNA（達(dá)安基因生物有限公司）；采用HBV耐藥檢測試劑盒（博奧生物科技有限公司）提取血清DNA,采用DNA芯片檢測4個HBV變異位點中的6種突變（博奧生物科技有限公司）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 15.0軟件行統(tǒng)計學(xué)分析。對符合正態(tài)分布的計量資料以（±s）表示，組間比較采用t檢驗；對非正態(tài)分布的計量資料以M（IQR）表示，采用秩和檢驗。對計數(shù)資料以%表示,采用Pearson x2檢驗或Fisher確切概率計算，以P＜0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 維吾爾族與漢族CHB患者一般資料比較 漢族CHB患者HBV基因型耐藥比例顯著高于維吾爾族患者（P=0.014）；兩組性別比未見顯著性差異（P=0.087），但在耐藥基因陽性者中，維吾爾族男性比例顯著高于漢族（P=0.039）；在基因型耐藥患者中，維吾爾族血清HBV DNA水平顯著低于漢族，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.012）；發(fā)現(xiàn)HBV DNA基因耐藥時，維吾爾族患者血清ALT、AST、TBIL水平顯著低于漢族，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜ 0.01）；維吾爾族與漢族患者年齡無顯著性差異（P＞0.05）；維吾爾族與漢族患者血清HBeAg陽性率比較，無明顯差異（P=0.061，表1）。

2.2 HBV耐藥基因突變情況 在241例基因型耐藥患者中，分別檢測出LAM和ADV的4個耐藥變異位點的 6種突變，分別為 rtL180M、rtM204I、rtM204V、rtA180T、rtA180V和rtN236T。

表1 維吾爾族與漢族CHB患者一般資料（n±s）比較

表1 維吾爾族與漢族CHB患者一般資料（n±s）比較

維吾爾族（n=1218） 漢族（n=70） t/x2 P性別（男/女） 1019/199 57/13 4.579 0.087年齡（歲） 37.9±10.8 38.8±12.1 2.588 0.851基因型耐藥 223（18.3） 18（25.7） 11.923 0.014血清HBV DNA（lgcopie/ml） 5.3±0.9 6.1±0.7 9.983 0.012耐藥HBV基因型（B/C/D） 1/4/225 7/12/2 - -ALT（U/L） 157.6±25.9 203.7.6±45.1 12.852 0.001 AST（U/L) 67.1±13.2 85.9±22.7 9.516 0.029 TBIL（μmol/L) 41.8±11.6 57.4±13.5 11.577 0.010 HBeAg陽性 174（14.3） 13（18.6) 5.810 0.061

2.3 維吾爾族與漢族CHB患者常見耐藥基因突變比較 維吾爾族和漢族患者都檢測出4個耐藥變異位點的6種變異。維吾爾族患者rtA1181T/V點位陽性率顯著高于漢族患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）；維吾爾族和漢族患者rtL180M、rtM204I/V、rtN 236T點位陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，表2）。2.4維吾爾族與漢族CHB患者HBV耐藥變異模式比較 見表3。

表2 維族與漢族CHB患者常見HBV耐藥變異位點陽性率（%）比較

表3 維吾爾族與漢族CHB患者HBV耐藥變異模式（%）比較

3 討論

隨著拉米夫定和阿德福韋作為臨床上治療乙型肝炎病毒感染的核苷（酸）類似物，HBV對這兩種藥物耐藥的報道也越來越多[13-16]。如果乙型肝炎新發(fā)病例就存在對這兩種常規(guī)藥物耐藥，即天然耐藥，那么臨床再使用這兩種藥物不僅不會對患者體內(nèi)的HBV進行有效的抑制，延緩肝功能損傷，反而還會延誤患者的病情，提早進入肝硬化或肝癌期。因此，對還沒有使用拉米夫定和阿德福韋治療之前就對兩種藥物的常見耐藥變異進行檢測是有必要的[17，18]。對于乙型肝炎耐藥基因變異的實驗室檢測，目前還沒有金標(biāo)準(zhǔn)。臨床上常用的大約有以下幾種方法：即PCR產(chǎn)物直接測序、聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RF LP）、反向雜交法、實時PCR（real-time PCR）、基因芯片（gene chip）、限制性片段質(zhì)譜多態(tài)性技術(shù)（RFMP）等?；蛐酒喾QDNA芯片或 DNA微陣列芯片，具有快速、高效、敏感、平行化和自動化等諸多優(yōu)點，可檢測已知變異位點。隨著基因芯片高通量測序技術(shù)的發(fā)展，它還可能用于檢測未知變異位點。目前，國內(nèi)用于核苷（酸）類似物耐藥臨床檢測的基因芯片，在經(jīng)過長期的研發(fā)和大量的臨床試驗研究后，已用于臨床診斷[18，20]。

我國HBV基因型以B、C、D型為主，存在南北和民族差異。南方以B型為主，北方以C型多見。我國東北的黑龍江省就以C型為主要的基因型。漢族人群中以B、C型為主，D型少見。在少數(shù)民族，可見一定比例的A、D基因型。新疆主要以漢族和維吾爾族為主，由于漢族和維吾爾族在生活習(xí)慣、飲食習(xí)慣等有很大的差異，而在HBV感染率及基因型等方面也存在很大的差異。庫熱西江.托乎提等對和田地區(qū)維吾爾族、漢族人群HBsAg攜帶率的流行病學(xué)調(diào)查分析表明，和田地區(qū)漢族與維吾爾族人群HBsAg攜帶率存在差異，與內(nèi)陸地區(qū)相比，維吾爾族人群HBsAg攜帶率與我國低感染區(qū)相同，而漢族人群感染率與內(nèi)陸地區(qū)中度流行區(qū)一致。乙型肝炎病毒可分為A～H共8個基因型。乙型肝炎病毒基因型分布呈地域性差異且與肝臟病變程度以及藥物治療效果存在一定的相關(guān)性。已有研究報道，新疆維吾爾族乙型肝炎病毒以D基因型占優(yōu)勢。

國內(nèi)相關(guān)研究報道，漢族人中發(fā)生乙型肝炎病毒耐藥性變異的毒株以B、C型多見，而D型耐藥變異發(fā)生率較低。本研究顯示維吾爾族與漢族HBV基因型耐藥比例為18.31% 對25.71%（P=0.014），漢族患者存在HBV基因耐藥比例更高。入選時，兩組患者性別比例未見顯著性差異（P=0.087），但在耐藥基因陽性者中，維吾爾族男性比例顯著高于漢族（P=0.039）。在基因型耐藥患者中，維吾爾族與漢族血清HBV DNA水平也存在差異（P=0.012）。兩組發(fā)生基因耐藥時，血清肝功能指標(biāo)也存在差異，漢族患者血清HBV DNA、ALT、AST、TBIL水平更高。維吾爾族和漢族患者都檢測出4個耐藥變異位點的6種變異，兩組患者在rtA181T/V位點存在顯著性差異，其他位點未見明顯差異。

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（收稿：2016-07-05）

（本文編輯：陳從新）

Differences of drug resistance between Uygur and Han patients with chronic hepatitis B in Hetian prefecture，Xinjiang

Zhang Jian，Maimaiti Jiang.Wubuliaishan，Li Junhong.Department of Emergency，You’an Hospital，Capital Medical University，Beijing，100069，China

ObjectiveTo investigate the differences of drug resistance between Uygur and Han patients with chronic hepatitis B in Hetian prefecture，Xinjiang Uygur autonomous region. Methods 1218 Uygur and 70 Han patients with chronic hepatitis B（CHB）receiving lamivudine（LAM）and/or adefovir（ADV）between March 2015 and January 2016 were admitted to Infectious Disease Hospital，Hetian prefecture，Xinjiang Uygur autonomous region.The rt L180M，rtM204I/V，rtA181T/V and rtN236T mutation of HBV were detected by DNA microarray. Results The proportion of drug-resistant HBV infection in Han patients with CHB was 25.7%，much higher than 18.3%in Uygur patients（P=0.014）；the proportion of men and women in Uygur patients with CHB was 1019/ 199，while the proportion in Han patients with CHB was 57/13（P=0.087）；the ratio of Uygur men with resistance-positive HBV infection was significantly higher than in Han（P=0.039）；serum HBV DNA levels in Uygur patients with HBV mutation was [（5.3±0.9）lg copies/ml]，much lower than in Han[（6.1±0.7）lg copies/ml，P=0.012]；in Uygur patients with genotypic resistance，serum ALT level was（157.6±25.9）u/L，AST was（67.1±13.2）U/L and bilurubin was（41.8±11.6）μmol/L，much lower than in Han patients[（203.7±45.1）U/L，（85.9±22.7） U/L，（57.4±13.5） μmol/L，respectively，P＜0.05 or P＜0.01]；the average age in Uygur and Han patients were（37.9±10.8）yr and（38.8±12.1）yr，without significant difference（P>0.05）；serum HBeAg positive rates in Uygur and Han patients were 18.6%and 14.3%，without significant difference（P=0.061）；rtL180M，rtM204I，rtM204V，rtA180T，rtA180V and rtN236T mutation of LAM and/or ADV were detected positive in 241 Uygur and Han patients.The rtA1181T/V in positive rates in Uygur and Han patients were 18.4%and 16.7%，respectively，（P>0.05），while the rtA1181T/V in Uygur patients was higher than in Han patients（P<0.05）；the rtL180M，rtM204I/V，and rtN236T positive rates in Uygur and Han patientswere38.6% and 38.9%，27.4% and 27.8%，and 15.7% and 16.7%，respectively，withoutsignificant differences（P>0.05）.Conclusion Han patients with CHB have a higher proportion of drug-resistant，and Uygur male proportion is relatively higher in patients with viral mutation.Serum HBV DNA，ALT AST and bilirubin levels are higher in Han patients with CHB.There is a significant difference in rtA181T/V mutation between the two groups.

Chronic hepatitis B；Uygur；Han；Viral resistance

10.3969/j.issn.1672-5069.2017.01.008

中國初級衛(wèi)生保健基金會資助項目【京佑基金（2015）第310號】

100069北京市 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院急診科（張劍，李俊紅）；新疆和田地區(qū)傳染病醫(yī)院肝病科（買買提江·吾布力艾山）

張劍，男，38歲，醫(yī)學(xué)碩士，副主任醫(yī)師。主要從事病毒性肝炎、脂肪性肝病和酒精性肝病診治研究。E-mail：3299448125@qq.com