黎藥海南野扇花的藥效學(xué)研究

張一云+李天一+唐菲+楊麗娜

【摘要】目的：探討海南野扇花對免疫功能，止血功能的影響。方法：將小鼠分為海南野扇花給藥高（13g/kg）、中（65g/kg）、低（33g/kg）劑量組及陰性（生理鹽水）、陽性（云南白藥）對照組，采用半數(shù)溶血試驗(yàn)（HC50）；雞紅細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)；凝血試驗(yàn)考察藥物的藥效學(xué)作用。結(jié)果：海南野扇花高，中劑量均能顯著提升（P<001，P<005）小鼠血清溶血素含量；顯著增加（P<001）小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能；凝血試驗(yàn)的高、中劑量均顯著縮短（P<001）小鼠凝血時間。結(jié)論：海南野扇花作為一種活血化瘀，消炎止血的藥物，具有良好的生物學(xué)活性。

【關(guān)鍵詞】黎藥；海南野扇花；免疫功能；止血

【中圖分類號】R29【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號】1007-8517（2017）05-0046-03

黎族在海南具有3000多年的生活史[1]，為了生存和繁衍，黎族人依托海南獨(dú)特的熱帶資源氣候，逐漸探索和實(shí)踐出了豐富的具有民族特色醫(yī)藥知識[2]。海南野扇花（Sarcococca vagans Stapf）為黃楊科野扇花屬植物，主要分布于我國海南、云南、廣西等地區(qū)[3]。報道集中于海南野扇花的化學(xué)成分研究，未見藥理藥效方面研究。海南民間用以活血化瘀，消炎止痛，常用于跌打損傷后的止血及瘀血祛除，以及咽喉腫痛、風(fēng)熱感冒的消炎止痛。研究參考黎族民間常用用法，考慮其具有止血、提升巨噬細(xì)胞吞噬血塊的能力，同時可能具有提高免疫力，增強(qiáng)抵抗力的作用。故設(shè)計免疫力功能試驗(yàn)及止血試驗(yàn)，為今后開發(fā)新藥提供一定的研究數(shù)據(jù)。

1儀器與材料

11實(shí)驗(yàn)動物KM小鼠，體重18～22g，雌雄各半，由海南省實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證號SCXK（瓊）2015-0007；動物飼養(yǎng)于海南省藥物研究所SPF動物房，使用許可證號：SYXK（瓊）2014-0025。

12藥物海南野扇花由五指山海南黎族民間醫(yī)藥研究協(xié)會提供，經(jīng)海南省藥物研究所鑒定；云南白藥（批號：ZBA1505，云南白藥集團(tuán)股份有限公司）。

13儀器二氧化碳培養(yǎng)箱、十萬分之一天平、離心機(jī)、紫外分光光度計、顯微鏡、手術(shù)器械。

14試劑Hank′s液（20150604，Biohao Biotechnology CoLtd）；PBS緩沖液（批號：20150629，Biohao）；SRBC（批號：20150806，鴻泉生物）；SA緩沖液（批號：20150811，Biohao）；瑞姬氏染液（批號：上海源葉生物科技）；都氏試劑（批號：D5941-6VL，SIGMA）。

2方法

21分組與給藥海南野扇花的推薦劑量為成人（體重70kg）每日50g生藥量，依據(jù)體重?fù)Q算系數(shù)[4]，20g標(biāo)準(zhǔn)小鼠等效劑量為170×00026=013g，即等效小鼠劑量65g/kg，設(shè)置為給藥中劑量組，高低劑量組分別為等效劑量2倍和05倍，即高、中、低劑量組分別為每日13、65、33g/kg。

將海南野扇花干品粉碎，取130g藥材粉加8倍量純化水浸泡2h，大火煎煮30min，過濾收集濾液，剩余藥材再加8倍量水重復(fù)煎煮，合并濾液，濃縮至100mL（含生藥13g/mL）用于高劑量組。中劑量及低劑量給藥組分別為高劑量給藥組稀釋2倍及4倍。小鼠按每10g體重給藥01mL給藥，每日一次。

陽性對照組：云南白藥膠囊，用純化水配置為00026g/mL溶液，小鼠按每10g體重給藥01mL，1次/d。陰性對照組：等量純化水，每日按10g體重給藥01mL。

22血清溶血素測定試驗(yàn)[5]隨機(jī)取KM小鼠40只，分為給藥高、中、低劑量組及陰性對照組，每組10只，雌雄各半。每日按每10g體重給藥01mL，連續(xù)給藥30d，采用半數(shù)溶血值（HC50）的測定方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)束前4d以2%（v/v）濃度的綿羊血紅細(xì)胞（SRBC）免疫小鼠，4d后，小鼠采血分離血清，用SA緩沖溶液稀釋200倍，取稀釋后血清1mL放入試管內(nèi)，加入10% SRBC 05mL和1∶8稀釋的豚鼠血清補(bǔ)體1mL。另設(shè)置不加血清的對照管。置于37℃恒溫水浴箱內(nèi)水浴30min，立即冰浴終止反應(yīng)，離心，取上清液1mL，加入3mL都氏試劑，同時取10%SRBC 025mL，加都氏試劑至4mL，充分混勻，作為SRBC半數(shù)溶血管。靜置約10min，分光光度計于540nm處測OD值。HC50依下式計算。

HC50=樣品光密度值SBBC半數(shù)溶血時的光密度值×100%

23巨噬細(xì)胞吞噬功能測定試驗(yàn)[5]隨機(jī)取KM小鼠40只，分為給藥高、中、低劑量組及陰性對照組，每組10只，雌雄各半。每日按每10g體重給藥01mL，連續(xù)給藥30d，采用小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞血紅細(xì)胞（半體內(nèi)法）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，鼠腹腔注射20%雞紅細(xì)胞懸濁液1mL，放置30min，脫頸處死小鼠，剪開腹壁皮膚，腹腔注射生理鹽水2mL揉搓腹腔1min，吸出腹腔洗液，滴于載玻片上，放入墊有紗布的鐵質(zhì)飯盒內(nèi)，移至37℃二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱孵育30min。孵畢，用生理鹽水洗去未貼壁細(xì)胞。以4%（v/v）Giemsa-磷酸緩沖液染色30s，蒸餾水洗凈。油鏡下計數(shù)巨噬細(xì)胞，分別記錄吞噬的巨噬細(xì)胞數(shù)，被吞噬的雞紅細(xì)胞數(shù)及巨噬細(xì)胞總數(shù)。依下式計算吞噬百分率及吞噬指數(shù)。

吞噬百分率（%）=

吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)計數(shù)的巨噬細(xì)胞數(shù)×100%

吞噬指數(shù)=被吞噬的雞紅細(xì)胞總數(shù)計數(shù)的巨噬細(xì)胞數(shù)

24止血試驗(yàn)隨機(jī)取KM小鼠50只，分為給藥高、中、低劑量組及陽性、陰性對照組，每組10只，雌雄各半。每日按每10g體重給藥01mL，連續(xù)給藥7d，末次給藥30min后，小白鼠眼后靜脈叢取血，立即滴于載玻片，同時以秒表計時。每隔10s用清潔大頭針自血滴邊緣向里輕輕挑動一次，并觀察有無血絲挑起。從采血開始至挑起血絲止，為凝血時間。

25統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 220軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示；多組間比較采用單因素方差分析，方差齊行Dunnett-t檢驗(yàn)，方差不齊行Dunnett-T3檢驗(yàn)，P<005表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3結(jié)果

31血清溶血素測定與陰性對照組相比，高劑量組血清溶血素非常顯著增加（P<001），中劑量組也顯著升高（P<005）。表明海南野扇花對小鼠體液免疫具有增加作用，能增加機(jī)體抗體的產(chǎn)生能力。詳見表1。

32巨噬細(xì)胞吞噬功能測定與陰性對照組相比，高，中劑量組小鼠巨噬細(xì)胞吞噬率及吞噬指數(shù)均非常顯著高于陰性對照組（P<001），表明海南野扇花對小鼠巨噬細(xì)胞具有正向刺激作用，詳見表2。

33止血試驗(yàn)給藥高中劑量組均能非常顯著的縮短小鼠凝血時間（P<001），且凝血效果與陽性對照組云南白藥無明顯差異。表明海南野扇花具有不錯的止血藥效。詳見表3。

4討論

海南野扇花是黎族民間處方的常用藥之一，多用于活血化瘀，主治跌打損傷、消炎止痛等。活血化瘀的活性通常與機(jī)體吞噬細(xì)胞功能有關(guān)，皮下毛細(xì)血管破裂，內(nèi)出血的血瘀塊通常由巨噬細(xì)胞進(jìn)行清除，因此活血化瘀的藥材往往有活化巨噬細(xì)胞的功效[6]。血清溶血素的測定主要考察抗體生成數(shù)量，試驗(yàn)結(jié)果表明海南野扇花能夠提升抗體生成數(shù)，說明海南野扇花具有抗感染的功效，止血試驗(yàn)說明海南野扇花具有良好的止血能力，與云南白藥相仿。

海南野扇花的主要化學(xué)成分為帕其沙明A、矮陀陀堿F、海南野扇花堿A～D、富貴草堿A、H等[7-8]，其中矮坨坨堿、富貴草堿、海南野扇花堿等化合物在同屬植物清香桂中可見，富貴草、金絲矮陀陀中則同時含有矮陀陀堿及富貴草堿。而矮陀陀本身是壯藥中的重要藥材，被形容為“千藥萬藥，不如矮陀陀”[9]。可見清香桂、富貴草、矮陀陀的共有成分是它們藥理藥效作用的主要化學(xué)成分。由于黃楊屬、富貴草屬及野扇花屬植物基本具有相似的功效，推測主要的活性成分是矮陀陀堿及富貴草堿，海南野扇花堿是否具有類似的活性成分還需要更進(jìn)一步與富貴草、金絲矮陀陀進(jìn)行比對研究才可知。

研究表明了海南野扇花的抗炎止血、活血化瘀功效可能通過提升體液免疫，巨噬細(xì)胞活性和激活凝血因子實(shí)現(xiàn)，是一種有潛力的治療跌打扭傷藥材。

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