MCP-1對(duì)LPS致炎小鼠子宮巨噬細(xì)胞遷移和功能活性的調(diào)節(jié)①

丁慧芳 張玉玲 盧 浩 張瑞平 錢志英 張順利

(河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 省部共建細(xì)胞分化調(diào)控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新鄉(xiāng)453007)

MCP-1對(duì)LPS致炎小鼠子宮巨噬細(xì)胞遷移和功能活性的調(diào)節(jié)①

丁慧芳 張玉玲 盧 浩 張瑞平 錢志英 張順利②

(河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 省部共建細(xì)胞分化調(diào)控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新鄉(xiāng)453007)

目的：探討LPS誘導(dǎo)的炎癥小鼠子宮巨噬細(xì)胞遷移和功能活性的調(diào)節(jié)因素。方法：將150只雌性昆明種小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(A組)、LPS模型組(B組)、MCP-1阻斷組(C組)，于末次注射后的1、3、6、12、24 h取子宮。運(yùn)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)CD14+巨噬細(xì)胞數(shù)量與CD14表達(dá)的變化，ELISA方法檢測(cè)TNF-α、MCP-1的表達(dá)量。結(jié)果：①與 A 組相比,B 組內(nèi)膜、肌層、外膜的CD14+巨噬細(xì)胞數(shù)目及CD14表達(dá)量在各時(shí)間點(diǎn)均極顯著增加(P<0.01),C 組內(nèi)膜和肌層在1、3、6 h時(shí)恢復(fù)至正常水平；與B組相比，C組外膜在1、3、6 h時(shí)以及C組的內(nèi)膜和肌層在各時(shí)間點(diǎn)時(shí)CD14+巨噬細(xì)胞數(shù)目及CD14表達(dá)量均極顯著減少(P<0.01)。②與A組相比，B組在各時(shí)間點(diǎn)以及C組在12、24 h時(shí)TNF-α和MCP-1的含量極顯著增多(P<0.01)；與B組相比,C組各時(shí)間點(diǎn)的TNF-α和MCP-1的含量極顯著減少(P<0.01)。結(jié)論：LPS誘導(dǎo)的小鼠子宮炎癥反應(yīng)中巨噬細(xì)胞的遷移及CD14、TNF-α等關(guān)鍵分子的表達(dá)均受MCP-1的調(diào)節(jié)。

MCP-1；LPS；巨噬細(xì)胞；CD14；TNF-α；子宮；小鼠

在胚泡著床前后子宮組織巨噬細(xì)胞會(huì)由內(nèi)向外遷移，蛻膜內(nèi)幾乎未發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞的分布[1]。在細(xì)菌性感染引起的流產(chǎn)中，細(xì)菌脂多糖(Lipopoly-saccharides,LPS)可激活小鼠子宮巨噬細(xì)胞，產(chǎn)生TNF-α等炎性因子，進(jìn)而引發(fā)炎癥反應(yīng)，同時(shí)伴隨著子宮巨噬細(xì)胞向內(nèi)膜的大量遷移，不利于胚胎的形成[2，3]。其機(jī)制與巨噬細(xì)胞模式識(shí)別受體CD14表達(dá)變化關(guān)系密切，但受哪些因素調(diào)控尚不清楚。有研究表明巨噬細(xì)胞參與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展過程，MCP-1可能與巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)有關(guān)[4]，還有研究證明MCP-1在體外對(duì)巨噬細(xì)胞遷移和侵襲具有促進(jìn)作用[5]，以上說明MCP-1可能是某些病理過程中巨噬細(xì)胞趨化募集的調(diào)節(jié)因素之一。本實(shí)驗(yàn)通過建立LPS致炎動(dòng)物模型，觀察阻斷MCP-1后小鼠子宮巨噬細(xì)胞的遷移變化和相繼引發(fā)的CD14、TNF-α表達(dá)變化，探討巨噬細(xì)胞在子宮組織遷移、活化的調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)藥品和器材 兔抗鼠MCP-1單克隆抗體、DAB酶底物顯色試劑(均購(gòu)自北京中杉金橋生物有限公司)；兔抗鼠CD14多克隆抗體、SABC二抗試劑盒、ELISA試劑盒(均購(gòu)自武漢博士德生物有限公司)；熒光顯微照相系統(tǒng)(蔡司光學(xué)儀器國(guó)際貿(mào)易有限公司)，CIS圖像分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6～8周齡的昆明種雌性小鼠，購(gòu)自新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育中心，體重(20±2)g，在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下穩(wěn)定一周，自由飲水取食。以陰道涂片法確定動(dòng)情期小鼠，備用。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及處理 150只小鼠隨機(jī)分三組，對(duì)照組(A組)：D1和D2 9:00分別尾靜脈注射PBS 0.2 ml，PBS 50 μl；LPS模型組(B組)：D1和D2 9:00分別尾靜脈注射LPS 0.2 ml，PBS 50 μl；阻斷MCP-1實(shí)驗(yàn)組(C組)：D1和D2 9:00分別尾靜脈注射LPS 0.2 ml，MCP-1單克隆抗體50 μl。分別于末次注射后1、3、6、12、24 h取雙側(cè)子宮，左側(cè)做免疫組化，右側(cè)做ELISA檢測(cè)。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色 將切片脫蠟；復(fù)水；置于0.3%H2O2中封閉內(nèi)源性過氧化物酶；置于10%正常山羊血清中封閉非特異性吸附位點(diǎn)；隨后滴加1∶100兔抗鼠CD14一抗，于37℃孵育30 min；然后依次滴加1∶100山羊抗兔IgG工作液和 1∶100辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，于37℃孵育 30 min；DAB顯色，鏡檢，照相。

1.2.3 子宮組織勻漿液制備和ELISA方法 在含有0.75 μg/ml PMSF的PBS中冰浴勻漿，12 000 r/min、4℃離心15 min，分裝上清液于-80℃凍存。TNF-α和MCP-1檢測(cè)按 ELISA 試劑盒說明書操作，反應(yīng)后即刻在酶標(biāo)儀 450 nm 處讀取 OD值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組樣品中TNF-α和MCP-1含量(pg/ml)。

2 結(jié)果

2.1 阻斷MCP-1對(duì)小鼠子宮CD14+巨噬細(xì)胞數(shù)量和分布的影響 與A組相比，B組各時(shí)間點(diǎn)三層組織CD14+巨噬細(xì)胞數(shù)目均極顯著增加 (P<0.01),而C組內(nèi)膜和肌層在1、3、6 h時(shí)無顯著差異；C組除外膜在12、24 h外，其余均較B組極顯著減少(P<0.01)。詳見圖1,表1。

2.2 阻斷MCP-1對(duì)小鼠子宮CD14蛋白表達(dá)的影響 由表2可見，與A組相比，B組各時(shí)間點(diǎn)三層組織CD14蛋白表達(dá)量均極顯著增加(P<0.01)，而C組內(nèi)膜和肌層在1、3、6 h時(shí)恢復(fù)至A組水平；C組外膜在1、3、6 h時(shí)以及C組內(nèi)膜、肌層在各時(shí)間點(diǎn)時(shí)CD14表達(dá)量均極顯著減少(P<0.01)。

圖1 小鼠子宮內(nèi)膜CD14+巨噬細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色Fig.1 Immunohistochemistry of CD14+ macrophages in uterine of miceNote：A.Small amount of macrophages in mice uterus in group A(×200)；B.The number of CD14+ macrophages of group B significantly increased in mice uterus compared with A at 6 h(×200)；C.The number of CD14+ macrophages of group C significantly decreased in mice uterus compared with B at 6 h(×200)；The arrows in the figue mean the CD14+ macrophages.

Time/hEndometriumABCMyometriumABCPerimetriumABC114 16±1 5824 62±2 621)15 24±1 372)3 84±0 6518 33±4 051)4 36±0 132)10 82±0 3420 47±3 261)14 42±1 482)3)313 92±1 2624 04±2 141)14 28±2 072)4 25±0 4318 63±2 951)3 66±0 132)10 42±0 5420 77±2 651)13 43±2 062)3)615 04±0 8422 58±2 431)15 53±2 122)4 18±0 9216 03±3 151)4 46±1 212)10 23±1 0220 65±3 851)14 15±1 462)3)1214 98±0 6726 28±3 321)20 34±1 551)2)3 92±0 5920 23±3 451)9 36±2 041)2)9 53±0 8418 41±2 831)16 42±2 161)2414 26±0 7428 35±3 821)20 02±1 451)2)4 45±0 1220 43±4 321)10 14±2 681)2)10 02±1 1517 67±3 421)17 03±2 851)

Note：1)Compared with group A，P<0.01，2)compared with group B，P<0.01;3)compared with group A,P<0.05.

Time/(h)EndometriumABCMyometriumABCPerimetriumABC1105 05±5 4866 26±4 351)116 28±5 252)132 45±6 9890 62±4 721)130 46±7 182)116 63±5 2480 43±6 121)100 29±5 752)3)3107 85±6 4866 45±4 651)116 38±5 562)130 45±6 2489 52±4 821)131 24±4 182)116 23±5 2381 52±6 521)105 79±4 292)3)6102 67±3 6280 36±4 061)109 82±4 952)130 35±6 42105 24±4 781)130 23±4 562)114 62±4 1480 38±8 721)103 23±4 452)3)12105 25±5 3760 46±5 251)85 28±4 381)2)131 12±8 3272 72±5 151)105 42±6 431)2)116 95±6 5288 53±7 921)93 32±6 711)24104 45±5 3254 36±4 471)83 28±3 961)2)130 23±5 1470 52±4 371)108 16±6 851)2)116 23±7 2390 32±5 621)94 46±3 521)

Note：1)Compared with group A，P<0.01，2)compared with group B，P<0.01;3)compared with group A,P<0.05.

Time/(h)ContentofTNF?αABCContentofMCP?1ABC129 18±2 3366 25±5 191)30 32±2 062)26 43±2 9350 79±4 671)28 54±2 742)330 25±2 1268 89±4 331)31 45±3 402)27 26±2 4652 57±4 431)26 53±3 072)629 42±3 8056 44±4 211)31 63±3 222)26 63±3 3450 68±4 111)29 28±4 862)1228 34±3 6266 52±5 581)40 22±4 491)2)28 18±2 1262 56±5 281)40 97±4 651)2)2428 61±2 2468 73±6 431)42 57±4 171)2)26 47±2 4560 36±5 221)41 62±4 121)2)

Note：1)Compared with group A，P<0.01，2)compared with group B，P<0.01.

2.3 阻斷MCP-1對(duì)小鼠子宮內(nèi)TNF-α和MCP-1含量的影響 由表3可見，B組子宮組織TNF-α、MCP-1含量在各時(shí)間點(diǎn)較A組極顯著增多(P<0.01)，而C組在1、3、6 h時(shí)接近A組；C組子宮組織TNF-α、MCP-1含量在各時(shí)間點(diǎn)均較B組極顯著減少(P<0.01)。

3 討論

巨噬細(xì)胞是機(jī)體炎癥反應(yīng)中的主要效應(yīng)細(xì)胞，當(dāng)機(jī)體接觸到LPS時(shí)，通過LPS-LBP-CD14-TLR4激活巨噬細(xì)胞。已有研究發(fā)現(xiàn)，小鼠生殖周期中子宮巨噬細(xì)胞的分布呈現(xiàn)規(guī)律性變化[6]，其中，正常小鼠間情期子宮內(nèi)膜中有大量巨噬細(xì)胞，動(dòng)情前期數(shù)量略有減少，動(dòng)情期有少量，動(dòng)情后期顯著減少；而孕鼠妊娠D1天時(shí)明顯減少，D7天的蛻膜中則消失，D18天明顯增加，這個(gè)周期中巨噬細(xì)胞的變化提示子宮局部細(xì)胞免疫水平的改變，可能是胚胎不被母體排斥，維持機(jī)體正常的免疫學(xué)機(jī)制之一。為避免間情期小鼠子宮內(nèi)膜存在的大量巨噬細(xì)胞對(duì)實(shí)現(xiàn)結(jié)果的影響，本文采用動(dòng)情期小鼠為研究對(duì)象。我們也曾發(fā)現(xiàn)，LPS可誘發(fā)孕小鼠子宮內(nèi)膜CD14+巨噬細(xì)胞數(shù)量和CD14表達(dá)量增多，中藥水紅花子可通過減少孕鼠子宮內(nèi)膜巨噬細(xì)胞的數(shù)量和CD14的表達(dá)，提高胚胎的成活率[7]。以上表明子宮內(nèi)膜巨噬細(xì)胞的募集與胚胎的著床、發(fā)育密切相關(guān)。趨化因子是巨噬細(xì)胞定向移動(dòng)的重要驅(qū)動(dòng)分子，可引起巨噬細(xì)胞的局部富集，研究發(fā)現(xiàn)，在局部發(fā)炎的腦組織中MCP-1與CCR-2通路是巨噬細(xì)胞募集的重要途徑[8]。為更進(jìn)一步研究MCP-1對(duì)巨噬細(xì)胞募集遷移的影響，本實(shí)驗(yàn)首先制備LPS致炎小鼠模型，著重觀察阻斷MCP-1前后巨噬細(xì)胞分布和功能活性的變化。結(jié)果顯示，B組小鼠在LPS刺激下子宮內(nèi)膜CD14+巨噬細(xì)胞數(shù)量、CD14表達(dá)量與正常對(duì)照組相比均極顯著增多(P<0.01)，在阻斷MCP-1的C組子宮組織內(nèi)CD14+巨噬細(xì)胞數(shù)量、CD14表達(dá)量雖較正常對(duì)照多，但已明顯少于B組。阻斷子宮內(nèi)MCP-1的作用，可以抑制巨噬細(xì)胞向子宮內(nèi)膜侵襲，且在6 h達(dá)到最大效應(yīng)，減少內(nèi)膜來源的巨噬細(xì)胞，降低CD14受體的表達(dá)，間接抑制LPS-CD14炎癥信號(hào)通路，阻斷抗原呈遞過程，減弱子宮內(nèi)炎癥反應(yīng)。亦有作者發(fā)現(xiàn)，在兔后肢生長(zhǎng)的側(cè)枝血管中隨著MCP-1表達(dá)顯著上調(diào),伴有大量巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)[9]。這些發(fā)現(xiàn)均明顯提示MCP-1是在炎癥及某些疾病過程趨化巨噬細(xì)胞進(jìn)入病理組織的關(guān)鍵信號(hào)分子之一。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤[10]和宮頸癌[11]組織中都觀察到MCP-1的高水平表達(dá)，與之相對(duì)應(yīng)的是，這些組織中均有大量的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)。本實(shí)驗(yàn)提示隨著阻斷劑作用的衰減，在12、24 h時(shí)，C組外膜CD14+巨噬細(xì)胞數(shù)量、CD14表達(dá)量又接近B組水平，特別是內(nèi)膜與肌層中更顯著高于正常對(duì)照組。與此同時(shí)，經(jīng)LPS處理后，子宮組織內(nèi)TNF-α、MCP-1含量都極顯著增多，而阻斷MCP-1后，TNF-α、MCP-1又都極顯著減少，提示MCP-1可調(diào)節(jié)致炎小鼠子宮巨噬細(xì)胞功能活性。當(dāng)蛻膜中的TNF-α含量增加時(shí)，孕鼠流產(chǎn)率升高[12]，而TNF-α能誘發(fā)MCP-1的表達(dá)，被MCP-1激活的單核巨噬細(xì)胞反過來又可以分泌更多的TNF-α，構(gòu)成一個(gè)正反饋放大環(huán)路，可能是最終導(dǎo)致胚胎死亡的機(jī)制[12，13]。此外，在患有乳腺癌的小鼠中MCP-1抑制劑能減少巨噬細(xì)胞數(shù)量、TNF-α的表達(dá)量[14]，變異的MCP-1能抑制小鼠腫瘤血管生成及黑色素瘤的發(fā)生[15]。因此，通過MCP-1來調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的功能活性將成為控制感染、流產(chǎn)、腫瘤等疾病的一種重要方式和手段。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在LPS誘導(dǎo)的小鼠子宮炎癥反應(yīng)中，MCP-1可趨化巨噬細(xì)胞在內(nèi)膜和外膜之間的遷移，阻斷MCP-1有助于減弱LPS引發(fā)的炎癥反應(yīng)。這些結(jié)果將有助于闡明疾病、炎癥過程中巨噬細(xì)胞募集作用的調(diào)節(jié)機(jī)制，并可能利用趨化巨噬細(xì)胞的遷移和控制其功能活性，尋找治療感染及炎癥性疾病、腫瘤的新靶點(diǎn)。

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[收稿2016-06-06 修回2016-08-11]

(編輯 倪 鵬)

Adjustment of MCP-1 to migration and functional activity on macrophages in uterine of inflammatory mice induced by LPS

DINGHui-Fang,ZHANGYu-Ling,LUHao,ZHANGRui-Ping,QIANZhi-Ying,ZHANGShun-Li.

CollegeofLifeScience,HenanNormalUniversity,KeyLaboratoryofCellDifferentiationRegulation,Xinxiang453007,China

Objective:To explore the adjustment factors to the migration and functional activity on macrophages in the uterine of inflammatory mice induced by LPS.Methods：150 Kunming female mouse were divided into control group (group A)，LPS model group (group B)，MCP-1 blocking-up group (group C),the mice uterines were extracted separately at hour 1，3，6，12，24.The number of CD14+macrophages and the expression of CD14 macrophages were detected by Immunohistochemistry,ELISA detects the expression of TNF-α and MCP-1.Results：①Compared with group A,the number of CD14+macrophages and the expression of CD14 in endometrium,myometrium,perimrtrium of group B were highly significantly increased (P<0.01) at every time points,the endometrium,myometrium of group C were closely to normal level at 1,3,6 h;compared with group B,the number of CD14+macrophages and the expression of CD14 were highly significantly decreased(P<0.01)at 1,3,6 h of perimrtrium of group C and every time points of endometrium,myometrium of group C.②Compared with group A,the content of TNF-α and MCP-1 were highly significantly increased (P<0.01) at every time points of group B and 12,24 h of group C;compared with group B,the content of TNF-α and MCP-1 of group C were highly significantly decreased(P<0.01) at every time points.Conclusion：The migration of macrophages and the expression of CD14 and TNF-α in the uterine of inflammatory mice induced by LPS were regulated by MCP-1.

MCP-1;LPS;Macrophage;CD14;TNF-α;Uterus;Mice

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.04.006

①本文受河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目(No.0524420040)和河南省動(dòng)物學(xué)省級(jí)重點(diǎn)學(xué)科基金資助。

丁慧芳(1992年-)，女，在讀碩士，主要從事免疫調(diào)控方面的研究，E-mail：852624945@qq.com。

R967

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②通訊作者，E-mail：ZSL369@sina.com。