一種制作骨髓染色體G帶的改良方法

唐永華，程建兵

(1、深圳市光明新區(qū)人民醫(yī)院，廣東深圳518106；2、杭州艾迪康醫(yī)學檢驗中心有限公司，浙江杭州310023)

一種制作骨髓染色體G帶的改良方法

唐永華1，程建兵2

(1、深圳市光明新區(qū)人民醫(yī)院，廣東深圳518106；2、杭州艾迪康醫(yī)學檢驗中心有限公司，浙江杭州310023)

目的建立一種具有分裂相多、分散度好、帶紋清晰、長度適中等特征的骨髓染色體G帶制作方法。方法在含9. 6%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中加入一定量的人淋巴瘤細胞系培養(yǎng)物，接種骨髓細胞后培養(yǎng)24h，然后加入終濃度為30μg/ml的溴化乙錠和0.06μg/ml的秋水仙胺作用1h。結(jié)果通過方法改良，骨髓標本培養(yǎng)成功率約為傳統(tǒng)方法的1.59倍，異常染色體檢出率比傳統(tǒng)方法提高了51%。結(jié)論改良后的方法可以制作出個數(shù)更多、分散度更加良好、帶紋更加清晰、染色體更長的中期分裂相，因而異常染色體檢出率更高，診斷結(jié)果更加可靠。

骨髓染色體；G帶；溴化乙錠

近年來，隨著分子生物學與細胞遺傳學的發(fā)展，骨髓染色體核型分析在血液系統(tǒng)疾病的診斷、治療和預后中發(fā)揮了越來越重要的作用。由于骨髓中含有大量的脂肪顆粒，且各種細胞系的細胞周期不固定，不統(tǒng)一，因而傳統(tǒng)培養(yǎng)骨髓的方法（在含一定量胎牛血清的RPMI1640中接種骨髓細胞培養(yǎng)24h，終止培養(yǎng)前加入一定量的秋水仙素）制備出的染色體G帶往往出現(xiàn)染色體分裂指數(shù)低，染色體短粗，分散度差等缺點，從而導致可分析的分裂相少，異常檢出率低，診斷結(jié)果不可靠。因此，建立一種具有分裂相多、分散度好、帶紋清晰、長度適中等特征的骨髓G帶制作方法尤為重要。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本來源隨機選取2000例來自全國各地多加醫(yī)院(溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院400例、臺州醫(yī)學院300例、德陽市人民醫(yī)院300例、三明市第一醫(yī)院200例、武漢市第一醫(yī)院400例、安徽省第二人民醫(yī)院400例)的骨髓標本進行實驗。骨髓標本要求使用專用肝素鈉抗凝管，無溶血、無凝血、未經(jīng)過高溫和冷凍且無污染的合格標本。

1.1.2 主要試劑RPMI1640培養(yǎng)基、溴化乙錠、秋水仙胺、胰酶、Giemsa染液均購自Sigma公司，胎牛血清(FBS)購自Gibco公司，青霉素和鏈霉素的混合物購自Hyclone公司。

1.2 方法

1.2.1 改良骨髓培養(yǎng)基配制

1.2.1.1 人淋巴瘤細胞培養(yǎng)物的制取利用含9.6% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，37℃，5%CO2培養(yǎng)人淋巴瘤細胞。當細胞密度達到大約50%融合率時，更換培養(yǎng)基，至終濃度40ml左右。當培養(yǎng)基顏色變?yōu)辄S色時準備收集。用血清移液管將培養(yǎng)好的細胞轉(zhuǎn)入50ml圓底聚丙乙烯離心管中，2000r/min離心10min。收集上清液，并經(jīng)0.22μm無菌濾器過濾，即為人淋巴瘤細胞培養(yǎng)物[1]。

1.2.1.2 骨髓培養(yǎng)基配方見表1。

表1 骨髓培養(yǎng)基配方

表2 超過20個良好分裂相的病例數(shù)比較結(jié)果

1.2.2 培養(yǎng)、收獲及染色標本接種后37℃，5%CO2培養(yǎng)24h，終止培養(yǎng)前1h加入50μl濃度為3mg/ml的溴化乙錠和25μl濃度為12μg/ml的秋水仙胺。離心后收集細胞，加入8ml 0.075M KCl 37℃水浴箱低滲15min。預固定后，吸取上清液，將沉淀渦旋混勻后加入8ml新鮮固定液（甲醇：冰醋酸=3：1），室溫靜置30min。重復固定3次后將懸液調(diào)整為適宜濃度，滴片后放入80℃烤箱1h，室溫放置一段時間后進行常規(guī)Giemsa染色[2～6]。

1.2.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，用t檢驗對計量資料進行統(tǒng)計學分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

圖1 實驗組與對照組在染色體分裂相個數(shù)和分散度方面的比較

圖2 實驗組與對照組在染色體長度方面的比較

2 結(jié)果

2.1 骨髓培養(yǎng)成功率對比實驗實驗組與對照組各做兩張G帶片，同一樣本由同一人觀察計數(shù)良好分裂相個數(shù)（即帶紋清晰可辨、染色體個數(shù)齊全且比較分散而不影響診斷）。良好分裂相個數(shù)≥20個，認為此骨髓標本培養(yǎng)成功[7，8]。如表2和圖1所示結(jié)果：實驗組鏡下（采用OLYMPUS顯微鏡，型號BX43，JVC彩色攝像機型號TK-C9201EC）觀察能達到20個以上良好分裂相的樣本數(shù)均高于對照組，約為對照組的1.59倍，且無論在何種疾病檢測中骨髓培養(yǎng)成功率均好于對照組。采用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，用t檢驗對計量資料進行統(tǒng)計學分析。P=0.026，差異有統(tǒng)計學意義。

2.2 帶紋及染色體長度對比實驗由于8號染色體變異較小，長度適中，因而利用Leica自動掃描顯微鏡和圖像分析系統(tǒng)分別對同一標本兩種不同方法所得的8號染色體進行相對長度的測量。常規(guī)方法8號染色體平均長度為34.12mm，改良方法8號染色體平均長度為46.33mm，兩者存在明顯差異[9]。如圖2所示鏡檢結(jié)果：實驗組中染色體帶紋更加清晰可辨，且染色體更長，更有利于異常染色體的檢出。

2.3 異常染色體檢出對比實驗應用G顯帶技術進行常規(guī)細胞遺傳學（CC）核型分析，核型異常按《人類細胞遺傳學國際命名體制（ISCN2009）》進行描述。至少2個細胞有同樣的染色體增加或結(jié)構(gòu)重排，或者3個細胞有同樣的染色體丟失，方可確認為一個異?？寺10-16]。將以上病人的染色體核型分析結(jié)果進行統(tǒng)計，實驗組異常染色體例數(shù)為1741，對照組異常染色體例數(shù)為1154例，如表3所示結(jié)果，實驗組異常核型檢出率約為對照組的1.51倍，且無論在何種疾病的檢測中，均高于對照組。采用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，用t檢驗對計量資料進行統(tǒng)計學分析。P=0.004，差異有統(tǒng)計學意義。

表3 染色體異常檢出率的比較

3 討論

骨髓染色體核型分析在惡性血液病的診斷、治療及預后方面發(fā)揮著重要的作用。據(jù)統(tǒng)計，約有80%～85%的白血病患者存在染色體核型異常。染色體異常的檢出不僅靠檢驗技術人員的豐富經(jīng)驗，而且與骨髓染色體標本制備技術有著直接的關系。標本制備得好可以獲得數(shù)量多和質(zhì)量好的染色體中期分裂相，有利于技術人員分析并提高染色體異常檢出率。

傳統(tǒng)的骨髓染色體培養(yǎng)無非是在含一定量胎牛血清的RPMI1640中接入一定量的骨髓細胞培養(yǎng)24h，然后通過秋水仙素濃度、作用時間、低滲時間等因素的優(yōu)化以達到獲得較多良好分裂相的目的。而本實驗室在長期實驗的基礎上，為了獲得良好的中期分裂相，主要做了以下改進：⑴在常規(guī)骨髓培養(yǎng)基中加入了人淋巴瘤細胞培養(yǎng)物。由于人淋巴瘤細胞培養(yǎng)物能分泌促增殖作用的生長因子并提供了其它營養(yǎng)物質(zhì)，因而骨髓細胞培養(yǎng)后分裂相形態(tài)更加良好，數(shù)量也有所增加[1]。⑵終止培養(yǎng)時使用了溴化乙錠和秋水仙胺。溴化乙錠是一種菲錠類染料，可以無選擇地嵌入DNA和RNA中，使染色體帶紋更為清淅。另一方面，它是一種染色體收縮抑制劑，可阻止染色體的完全螺旋化和收縮變短而使染色體伸長。此外，秋水仙胺是秋水仙素的衍生物，毒性比秋水仙素更小，減少了對骨髓細胞的損害。因而，獲得的中期分裂相更多、分散度更好、長度更長且?guī)Ъy更加清晰。由于制取的G帶穩(wěn)定性更好，因而使用不同的顯微鏡均能觀查到良好的分裂相，異常染色體檢出率更高，診斷結(jié)果更加可靠。對各種不同的疾病患者的骨髓染色體進行染色，效果均優(yōu)于現(xiàn)有方法。利于預后危險程度劃分，在白血病診斷、治療及預后判斷中具有重要的臨床意義。與此同時，實驗過程中我們也發(fā)現(xiàn)改進后的方法在培養(yǎng)淋巴瘤疾病的骨髓細胞方面效果并不明顯，培養(yǎng)成功率及染色體異常檢出率仍然較低。在后續(xù)檢測過程中，需要進一步的研究總結(jié)。

[1]Ohno H，F(xiàn)ukuhara S，Arita Y，et al.Establishment of a peripheral T-cell lymphoma cell line showing amplification of the c-myc oncogene[J].Cancer Res，1988，48：4959-4963.

[2]王冬梅，徐衛(wèi)，董華潔，等.CpG寡脫氧核苷酸聯(lián)合IL-2刺激慢性淋巴細胞白血病細胞的細胞遺傳學研究[J].中國實驗血液學雜志，2010，18(5)：1114-1118.

[3]潘梅，張小瓊，胡正，等.白血病患兒的骨髓染色體核型分析[J].江蘇醫(yī)藥，2013，39（18）：2140-2142.

[4]毛建平，趙利東，汪海清.惡性血液病患者313例染色體核型分析及臨床意義[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2014，30(24)：3697-3699.

[5]韓樂樂，吳春梅.骨髓增生異常綜合征142例染色體核型分析[J].青島大學醫(yī)學院學報，2014，50(3)：227-229.

[6]張秀秀.基于骨髓細胞染色體核型分析在惡性血液病中的應用研究[J].中外醫(yī)學研究，2015，13(11)：79-80.

[7]Bi W，Borgan C，Pursley AN，et al.Comparison of chromosome analysis and chromosomal microarray analysis：what is the value of chromosome analysis in today’s genomic array era[J].Genet Med，2013，15(6)：450-457.

[8]Shekhar S，Sahoo AK，Dalai N，et al.Chromosome analysis of arsenic affected cattle[J].Veterinary World，2014，7(10)：859-862.

[9]林俊生，涂向東，張寶珍.用溴化乙錠改良臍帶血染色體制備方法[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志，2006，14(8)：46-47.

[10]郭曉紅，翟曉文，錢曉文，等.163例兒童急性淋巴細胞白血病細胞遺傳學特征[J].中國實驗血液學雜志，2015，23(2)：312-317.

[11]Beheshti B，Braude I，Marrano P，et al.Chromosomal Localization of DNA Amplifications in Neuroblastoma Tumors Using cDNA Microarray Comparative Genomic Hybridization[J].Neoplasia，2003，5 (1)：53-62.

[12]Rondón-Lagos M，Rangel N，Di Cantogno LV，et al.Effect of low doses of estradiol and tamoxifen on breast cancer cell karyotypes [J].Endocrine-Related Cancer，2016，23，635-650.

[13]Niederwieser C，Nicolet D，Carroll AJ，et al.Chromosome abnormalities at onset of complete remission are associated with worse outcome in patients with acute myeloid leukemia and an abnormal karyotype at diagnosis：CALGB 8461(Alliance r)[J].Haematologica，2016，101：1-20.

[14]張鵬宇，張龍進，羅靜，等.染色體短期培養(yǎng)法的改良及在白血病患者染色體核型分析中的應用[J].西安交通大學學報(醫(yī)學版)，2016，37(6)：288-291.

[15]吳敏華，容伯芬，陳妙嬋.慢性粒細胞白血病骨髓染色體核型異常的結(jié)果分析[J].實驗與檢驗醫(yī)學，2011，29(1)：87.

[16]劉小寧，李元媛，甘宜敏，等.急性早幼粒細胞白血病PML/ RARA融合基因檢測的臨床意義[J].實驗與檢驗醫(yī)學，2016，34（2）：140-142.

The improved technique of bone marrow chromosome G-banding

TANG Yonghua1，CHENG Jianbing2.1.Shenzhen Guangming New District People’s Hospital，Shenzhen Guangdong 518106，China；Hangzhou Adicon Clinical Laboratories，INC，Hangzhou Zhejiang 310023，China.

Objective To build a method for bone marrow chromosome G-banding with more and better metaphase chromosomes.Methods Some culture from human lymphocyte carcinoma cell line was added into the traditional bone marrow medium，then the marrow cells were cultured about 24h.At the second day，30μg/ml ethidium bromide and 0.06μg/ml colcemid at the final concentration were added into the above medium and incubated about 1h prior to cell harvest.Results The rate of successful chromosome preparation were about 1.59 times the rate of control and the detection rate of chromosome aberrations were improved 51%.Conclusion By the improved methods，better metaphase chromosomes could be obtained to be analyzed easily，so the diagnosis would be more exactly.

Bone marrow chromosome；G-banding；Ethidium bromide

R446.8

A

1674-1129(2017)02-0193-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.02.017

2016-07-05；

2017-02-15)

唐永華，男，1977年生，主管檢驗師，主要從事醫(yī)學基礎研究，Email：tyh1024@sina.com

程建兵，男，1982年生，碩士學位，檢驗技師，主要從事惡性血液病的研究，Email：chengjianbing2979@163.com