細(xì)胞和基因生物治療領(lǐng)域展望

王瑩，陳緒虹，于俊濤，陳博

康諾亞生物醫(yī)藥科技（成都）有限公司，成都 610041

細(xì)胞和基因生物治療領(lǐng)域展望

王瑩，陳緒虹，于俊濤，陳博

康諾亞生物醫(yī)藥科技（成都）有限公司，成都 610041

陳博，博士，國(guó)家千人計(jì)劃特聘專(zhuān)家?？抵Z亞生物醫(yī)藥科技（成都）有限公司董事長(zhǎng)。上海君實(shí)生物醫(yī)藥科技有限公司創(chuàng)始人和董事。1996年畢業(yè)于武漢大學(xué)生物系；同年赴美留學(xué)并在紐約愛(ài)因斯坦醫(yī)學(xué)院獲得分子生物學(xué)博士學(xué)位。先后歷任美國(guó)Experimed Biosciences 研究員，Trellis Bioscience高級(jí)研究員和Stemcentrx公司資深研究員和抗體發(fā)現(xiàn)部主管，從事大分子和抗體藥物的研發(fā)工作，在抗體基因工程、人源化改造、各種抗體篩選平臺(tái)和抗體偶聯(lián)藥物的應(yīng)用方面有著豐富經(jīng)驗(yàn)。其開(kāi)發(fā)的全新人源化抗PD-1抗體、抗BLyS和抗PCSK9藥物獲得國(guó)家“十二五”重大專(zhuān)項(xiàng)支持并申報(bào)臨床。E-mail：bochen@conmedbio.com

最近的科研進(jìn)展使細(xì)胞和基因療法可以提供新興的持久療法，特別是在基因靶向改造細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs）方面的發(fā)展，為以往不可治療或只有應(yīng)急和緩解治療方案的疾病帶來(lái)了希望。細(xì)胞療法所涉及內(nèi)容豐富，具有跨細(xì)胞類(lèi)型和可用于治療多種適應(yīng)證的特點(diǎn)。作為一個(gè)活躍多年的研究領(lǐng)域，細(xì)胞和基因治療現(xiàn)在達(dá)到成功商業(yè)化和臨床受益的爆發(fā)點(diǎn)。基于各種技術(shù)而不是細(xì)胞類(lèi)型來(lái)分類(lèi)細(xì)胞和基因治療，介紹了臨床轉(zhuǎn)化方面細(xì)胞和基因治療的最新進(jìn)展，闡述了這些技術(shù)如何解決臨床、制造和社會(huì)保險(xiǎn)方面的要求，并描述了未來(lái)國(guó)內(nèi)外關(guān)鍵挑戰(zhàn)和發(fā)展展望。

細(xì)胞治療；基因治療；免疫治療

1 生物治療背景

進(jìn)入21世紀(jì)以后，醫(yī)學(xué)和制藥界經(jīng)歷了新一輪的技術(shù)革命，其中包括高通量基因測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展。高新技術(shù)的發(fā)展使我們從基因?qū)用嫔细由钊氲卣J(rèn)識(shí)到遺傳疾病的發(fā)病機(jī)理，并有助于探究在致病原因中相關(guān)基因與環(huán)境因素相互作用。此外，隨著基因轉(zhuǎn)入和細(xì)胞培養(yǎng)操作技術(shù)的更迭和發(fā)展，再結(jié)合基因治療和細(xì)胞治療技術(shù)，哺乳動(dòng)物的干細(xì)胞和分化細(xì)胞已經(jīng)可用于研究，并已開(kāi)發(fā)針對(duì)多種先天性遺傳疾病和獲得性疾病治療的藥物。目前，全世界已經(jīng)有6種細(xì)胞和基因治療藥物進(jìn)入市場(chǎng)，包括4種細(xì)胞治療藥物：①Provenge——基因改造的樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）用以治療惡性黑色素瘤；②ChondroCelect——治療軟骨損傷關(guān)節(jié)的軟骨細(xì)胞藥物；③MACI——基質(zhì)誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞藥物；④Holoclar——治療角膜損傷的角膜源干細(xì)胞藥物。還包括2種基因治療藥物：Glybera和“今又生”。盡管其他治療方法和藥物還處于實(shí)驗(yàn)室研究或者臨床階段，但是如同20世紀(jì)70年代重組DNA技術(shù)出現(xiàn)而產(chǎn)生的生物大分子藥那樣，這些治療方法正在改變傳統(tǒng)的醫(yī)藥定義，并在今后10年使醫(yī)藥界迎來(lái)新紀(jì)元。

2 細(xì)胞治療定義

在美國(guó)細(xì)胞和基因治療藥物的開(kāi)發(fā)應(yīng)用并最終上市需要遵循生物制品法規(guī)，在歐洲則要遵循高級(jí)治療性醫(yī)療制品（advanced therapy medicinal products，ATMPs）法規(guī)。以細(xì)胞來(lái)源分類(lèi)，此類(lèi)治療方案包括體細(xì)胞治療和干細(xì)胞治療兩種。其中干細(xì)胞治療是指利用自體或者異體骨髓或臍帶造血干細(xì)胞移植治療血液病和惡性腫瘤，或利用骨髓和臍帶等來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)移植后轉(zhuǎn)化為成骨細(xì)胞、心肌細(xì)胞等用于治療。根據(jù)是否存在基因改造應(yīng)用進(jìn)行分類(lèi)，又可以分類(lèi)為非基因改造治療和基因改造細(xì)胞治療，后者還可以進(jìn)一步分為體外基因改造細(xì)胞治療和體內(nèi)基因改造細(xì)胞治療。

3 細(xì)胞治療關(guān)鍵技術(shù)

細(xì)胞治療的發(fā)展與技術(shù)的進(jìn)步息息相關(guān)，尤其是與基因治療結(jié)合后取得了突飛猛進(jìn)的進(jìn)展。在此列出細(xì)胞治療的關(guān)鍵技術(shù)和應(yīng)用。

3.1 新型體細(xì)胞和干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

盡管在50年前就可以從人體中提取、培養(yǎng)各種細(xì)胞，但是提取組織特異性干細(xì)胞卻在過(guò)去10年間取得飛躍發(fā)展，并有可能在解決體外大量繁殖并保持細(xì)胞特性條件下，成為新的治療方案。目前我國(guó)已經(jīng)在肝臟干細(xì)胞和心臟干細(xì)胞方面取得了突破性進(jìn)展。此外，各種免疫細(xì)胞，包括腫瘤浸潤(rùn)T細(xì)胞、DC、γδT細(xì)胞、調(diào)節(jié)T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞均有特異性的表征和細(xì)胞功能，并已經(jīng)研制出處于不同臨床階段的相應(yīng)產(chǎn)品[1-2]。

3.1.1 角膜和視網(wǎng)膜修復(fù)

從囊胚獲取的胚胎干細(xì)胞在被誘導(dǎo)為視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞后可以用于移植治療Stargardt’s氏癥和干性老年黃斑退行性病變，該技術(shù)在美國(guó)被賦予孤兒藥資格，目前處于臨床Ⅱ期階段?；瘜W(xué)和其他方式的燒傷會(huì)導(dǎo)致角膜損傷，此病理?xiàng)l件與角膜緣的干細(xì)胞缺乏相關(guān)，歐洲（英國(guó)和意大利）正在利用自體體外培養(yǎng)增生的角膜緣干細(xì)胞開(kāi)展臨床Ⅱ期試驗(yàn)以修復(fù)損傷角膜。

3.1.2 肌肉修復(fù)

自體和異體移植正在被開(kāi)發(fā)以應(yīng)用在心臟梗死、尿道/肛門(mén)失禁和肌肉萎縮等疾病中。臨床試驗(yàn)表明，提取的CD34+或者CD133+自體干細(xì)胞可以用以改善杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥患者的肌肉組織功能。此外，異體移植臍帶血干細(xì)胞也在臨床I/II期用于治療遺傳性運(yùn)動(dòng)失調(diào)。

3.1.3 造血干細(xì)胞相關(guān)治療

傳統(tǒng)造血干細(xì)胞移植中，如果患者和供應(yīng)者的組織相關(guān)性只是部分符合，往往會(huì)導(dǎo)致移植體抗宿主反應(yīng)。此外，免疫抑制的宿主體還容易被包括CMV病毒在內(nèi)的多種病毒感染?，F(xiàn)在已經(jīng)開(kāi)發(fā)出多種降低移植體抗宿主反應(yīng)的方法，以此來(lái)提高此類(lèi)細(xì)胞治療效果，包括：①去除造血干細(xì)胞中的CD3+T細(xì)胞，經(jīng)過(guò)處理后，移植體抗病毒能力增加；②移植造血干細(xì)胞時(shí)，加入抑制性調(diào)節(jié)T細(xì)胞；③去除造血干細(xì)胞中的CD3+T細(xì)胞后，加入針對(duì)特定病毒（CMV，EBV和腺病毒）殺傷T細(xì)胞，這不僅可以降低移植體抗宿主反應(yīng)，還保持對(duì)特定病毒的免疫殺傷。

3.2 基因改造細(xì)胞技術(shù)

由于病毒載體技術(shù)的進(jìn)步，不僅可以在逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒和腺病毒內(nèi)裝載大片段目的基因，還可以將其大量地轉(zhuǎn)染到哺乳細(xì)胞。該技術(shù)可以用于體內(nèi)和體外基因改造細(xì)胞。

3.2.1 體外基因改造細(xì)胞

體外改造是在人體外將提取的細(xì)胞導(dǎo)入外源遺傳物質(zhì)后，回輸改造后的細(xì)胞到人體。此技術(shù)已經(jīng)廣泛用于T細(xì)胞、造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞。其中，最有代表性的治療包括嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫療法（chimeric antigen receptor T-cellimmunotherapy， CAR-T）和嵌合抗原受體工程化的自然殺傷細(xì)胞免疫療法（chimeric antigen receptor natural killer cell immunotherapy， CAR-NK）。這些經(jīng)過(guò)基因改造的免疫細(xì)胞可以特異性靶向腫瘤細(xì)胞和外源病毒，并具有激活自身殺傷癌癥細(xì)胞和病毒的能力，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)的手術(shù)、放療和化療的弊端，被認(rèn)為是21世紀(jì)腫瘤綜合治療模式中最活躍和最具發(fā)展?jié)摿Φ囊环N治療手段。2013年年底，《科學(xué)》將“腫瘤的免疫治療”列為2013年十大科學(xué)突破之首。

基因改造的腫瘤免疫治療主要分為腫瘤非特異性免疫和特異性免疫兩類(lèi)。前者主要包括LAK、CIK、DC及其類(lèi)似細(xì)胞和溶瘤病毒；后者主要包括TIL和CAR-T/TCR-T和CAR-NK細(xì)胞。

（1）DC腫瘤免疫治療

DC在人體內(nèi)專(zhuān)職抗原遞呈細(xì)胞，啟動(dòng)集體的特異性免疫反應(yīng)。目前，300多項(xiàng)DC治療性疫苗的臨床研究正在進(jìn)行。該技術(shù)是將患者的DC前體細(xì)胞從體內(nèi)分離，在體外誘導(dǎo)分化或基因改造，再用腫瘤抗原誘導(dǎo)后回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，從而指引靜息期T細(xì)胞分化成可特異性識(shí)別殺傷腫瘤的細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL）并擴(kuò)增。美國(guó)FDA于2010年批準(zhǔn)了世界上首個(gè)治療前列腺癌癥的治療性DC疫苗Provenge。

（2）CAR-T腫瘤免疫治療

CAR-T已出現(xiàn)多年，近幾年才被改良并應(yīng)用到臨床上的新型細(xì)胞療法，在急性白血病和非霍奇金淋巴瘤的治療上有顯著的療效。目前，美國(guó)FDA及歐洲EMA已經(jīng)批準(zhǔn)多個(gè)CAR-T治療進(jìn)入藥品審批快速通道[3]。

與所有技術(shù)一樣，CAR-T技術(shù)也經(jīng)歷了一個(gè)漫長(zhǎng)的演化過(guò)程，而當(dāng)前該技術(shù)已逐漸走向成熟。第一代CAR-T介導(dǎo)的T細(xì)胞激活是通過(guò)CD3z鏈或FceRIg上的酪氨酸激活基序完成的。CD3z鏈能夠提供T細(xì)胞激活、裂解靶細(xì)胞、調(diào)節(jié)IL-2分泌以及體內(nèi)發(fā)揮抗腫瘤活性所需的信號(hào)。由于第一代CAR改造T細(xì)胞的抗腫瘤活性在體內(nèi)受到了限制，T細(xì)胞增殖減少最終導(dǎo)致T細(xì)胞的凋亡。所以第二代CAR-T在胞內(nèi)增加了一個(gè)新的共刺激信號(hào)——“信號(hào)2”，這使得原有的源自TCR/CD3復(fù)合體的“信號(hào)1”擴(kuò)大。更多研究表明，搭載了“信號(hào)2”的第二代CAR-T與第一代CAR-T相比，抗原特異性不變，不同的是T細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子分泌增加、抗細(xì)胞凋亡蛋白分泌增加、細(xì)胞死亡延遲。常用的共刺激分子為CD28， 但有研究用4-1BB（CD137）進(jìn)行替換。第二代CAR孰優(yōu)孰劣，尚未定論。但與第一代CAR相比，這種設(shè)計(jì)能夠增加對(duì)腫瘤細(xì)胞裂解的記憶效應(yīng)以及CAR介導(dǎo)的殺傷效應(yīng)。為了進(jìn)一步改良CAR的設(shè)計(jì)，許多研究團(tuán)隊(duì)著眼于研發(fā)第三代CAR，其特點(diǎn)是在第二代CAR-T共刺激信號(hào)CD28后，又加入了共刺激分子蛋白OX40（CD134）或4-1BB（CD137）。這兩種共刺激分子蛋白可進(jìn)一步活化T細(xì)胞，延長(zhǎng)生存期。

CAR-T細(xì)胞的基因改造主要使用逆轉(zhuǎn)錄和慢病毒這兩種病毒載體。但是由于改造后的CAR-T細(xì)胞可以存活16周后表達(dá)CAR，很有可能導(dǎo)致不必要的副作用。目前，電轉(zhuǎn)染以及陽(yáng)離子多聚體轉(zhuǎn)染方法也已用于外源基因?qū)?，以使CAR表達(dá)縮短至幾天之內(nèi)。

典型的CAR-T治療流程持續(xù)3周左右，其中細(xì)胞“提取-修飾-擴(kuò)增”約需要2周，花費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)。主要分為以下5個(gè)步驟：從癌癥患者身上分離免疫T細(xì)胞（分離）；用基因工程技術(shù)為T(mén)細(xì)胞加入一個(gè)能識(shí)別腫瘤細(xì)胞并且同時(shí)激活T細(xì)胞的嵌合抗體，即制備CAR-T細(xì)胞（修飾）；體外培養(yǎng)，大量擴(kuò)增CAR-T細(xì)胞。一般一個(gè)患者需要幾十億至上百億個(gè)CAR-T細(xì)胞（擴(kuò)增）；把擴(kuò)增好的CAR-T細(xì)胞回輸?shù)交颊唧w內(nèi)（回輸）；嚴(yán)密監(jiān)護(hù)患者，尤其是控制回輸后幾天身體的劇烈反應(yīng)（監(jiān)控）。

CAR-T最早是用于包括HIV病毒在內(nèi)的傳染病治療，目前在臨床上大量用于治療淋巴癌為代表的血液癌癥治療。隨著新靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)，CAR-T的應(yīng)用也擴(kuò)展到了實(shí)體瘤、自身免疫疾?。ǘ喟l(fā)性硬化?。┖驼婢腥?。截至2016年6月，已報(bào)道的CAR-T細(xì)胞治療的靶點(diǎn)有20多個(gè)（表1），開(kāi)展的臨床試驗(yàn)有80多個(gè)（表2）。

由表2可以看出，絕大多數(shù)的CAR-T臨床試驗(yàn)在美國(guó)開(kāi)展，我國(guó)在此領(lǐng)域也已經(jīng)展開(kāi)了超過(guò)20項(xiàng)臨床試驗(yàn)。CD19是被廣泛使用和關(guān)注的CAR-T靶點(diǎn)，預(yù)計(jì)2017年此靶點(diǎn)的CAR-T治療會(huì)被批準(zhǔn)上

市用于治療血液癌癥。

表1 CAR-T靶點(diǎn)和臨床試驗(yàn)所對(duì)應(yīng)適應(yīng)證

表2 處于不同臨床試驗(yàn)階段的CAR-T

表2 處于不同臨床試驗(yàn)階段的CAR-T （續(xù)表）

表2 處于不同臨床試驗(yàn)階段的CAR-T （續(xù)表）

（3）溶瘤病毒免疫治療

溶瘤病毒是一種癌癥免疫治療方法，由利用天然的或者是經(jīng)過(guò)基因修飾的病毒制成，這類(lèi)病毒可以在腫瘤細(xì)胞內(nèi)選擇性地復(fù)制，并殺死癌癥細(xì)胞。與疫苗不同，溶瘤病毒可以直接感染并裂解腫瘤細(xì)胞，不需要特定的抗原，并能發(fā)出促進(jìn)抗腫瘤免疫應(yīng)答的信號(hào)。其抗腫瘤活性是通過(guò)兩個(gè)機(jī)制來(lái)完成：一是在腫瘤細(xì)胞內(nèi)選擇性復(fù)制，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞直接裂解，另一個(gè)是誘導(dǎo)全身的抗腫瘤免疫反應(yīng)。

溶瘤病毒的發(fā)展大致經(jīng)歷了3個(gè)階段。第一階段是在20世紀(jì)之前，臨床上觀察到偶然地病毒感染使得腫瘤消失的現(xiàn)象；隨后，到20世紀(jì)中期，一些臨床試驗(yàn)用各種野生的病毒感染來(lái)治療腫瘤，并觀察到一定的療效。但是這類(lèi)早期的溶瘤病毒通常只能產(chǎn)生短期的溶瘤效應(yīng)，而且不可避免地具有野生病毒感染造成的毒副反應(yīng)?？赡芟抻谝吧《镜亩拘裕R床使用的病毒滴度比較低；除此之外，病毒還沒(méi)有有效地溶瘤就被患者的免疫系統(tǒng)清除，致使殘余的腫瘤很快復(fù)發(fā)。

溶瘤病毒開(kāi)發(fā)的第二個(gè)階段始于20世紀(jì)90年代；受益于分子病毒學(xué)的發(fā)展，開(kāi)始能夠選擇性地改造野生病毒的基因組，使之特異性地在腫瘤內(nèi)復(fù)制。隨著重組溶瘤病毒的研發(fā)熱潮到頭，一些其他原本非致病的野生病毒也陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)不需要經(jīng)過(guò)基因改造也具有腫瘤特異性。在過(guò)去20年里，有許多類(lèi)似的溶瘤病毒進(jìn)入了臨床試驗(yàn)，但是絕大部分都由于缺乏顯著療效而在臨床Ⅰ/Ⅱ期失敗。值得一提的是，在近百個(gè)溶瘤病毒的臨床研究中，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)一例因病毒而引起的嚴(yán)重毒副反應(yīng)。因此，盡管在這個(gè)階段未能有真正的溶瘤病毒新藥，溶瘤病毒的安全性卻得到了充分的承認(rèn)。

溶瘤病毒開(kāi)發(fā)的第三個(gè)階段主要從21世紀(jì)開(kāi)始，其特點(diǎn)是讓溶瘤病毒攜帶各種外源性基因以增強(qiáng)其療效。目前看來(lái)，最有效的外源性基因就是免疫刺激基因，如GM-CSF。具有劃時(shí)代的意義的第一個(gè)被美國(guó)FDA批準(zhǔn)的該類(lèi)溶瘤病毒（T-VEC）于2015年在北美和歐洲上市。

溶瘤病毒包括單皰病毒（HSV-1）、水皰性口炎病毒（VSV）、腺病毒相關(guān)病毒（AAV）和慢病毒（Lentivirus）等。目前，臨床階段使用最多的溶瘤病毒是腺病毒和皰疹病毒[4]。其主要臨床試驗(yàn)見(jiàn)表3。

已經(jīng)上市的T-Vec是基于HSV-1的溶瘤病毒。T-Vec刪除了2個(gè)ICP34.5基因以提高癌癥細(xì)胞的選擇性，并防止其感染神經(jīng)元。該病毒還刪除了ICP47，誘導(dǎo)US11啟動(dòng)子的早期激活，從而阻止PKR磷酸化，防止癌癥細(xì)胞感染時(shí)發(fā)生凋亡。此外，該病毒還將編碼的GM-CSF插入基因組替代ICP34.5基因來(lái)提高抗腫瘤免疫的誘導(dǎo)性。III期臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，436名晚期不能手術(shù)的黑色素瘤患者接受藥物瘤內(nèi)注射后，12個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)客觀緩解并持續(xù)至少6個(gè)月的比例為16.3%，而使用GM-CSF的對(duì)照組僅為2.1%。另外，使用T-Vec的患者客觀緩解率為26.4%，其中10.9%達(dá)到完全緩解，總體生存時(shí)間的中位值為23.3個(gè)月。2015年10月，美國(guó)FDA和歐洲EMA先后批準(zhǔn)了T-Vec（Imlygic）用于晚期不能手術(shù)的黑色素瘤的二線治療。當(dāng)前，安進(jìn)公司正在開(kāi)展T-Vec與免疫療法藥物ipilimumab以及pembrolizumab聯(lián)用，治療黑色素瘤的研究。Ib期的初步結(jié)果顯示，T-Vec和CTLA-4抑制劑ipilimumab聯(lián)用，緩解率50%，完全緩解率22%。

腺病毒是無(wú)包膜、雙鏈DNA病毒，相對(duì)來(lái)說(shuō)其基因組比較容易修飾，可插入多至10kb的轉(zhuǎn)基因而不會(huì)破壞病毒感染。研究人員開(kāi)發(fā)了一些利用腺病毒在癌癥細(xì)胞中異常信號(hào)通路的溶瘤病毒。比如，Onyx-015和 H101均缺失E1B，該基因可使p53失活。

Onyx-015開(kāi)展了一些臨床試驗(yàn)，但對(duì)其結(jié)果的報(bào)道非常有限，且2003年臨床開(kāi)發(fā)被暫停。和Onyx-015相同，H101也是缺失E1B的腺病毒溶瘤病毒。在我國(guó)開(kāi)展的隨機(jī)Ⅲ期臨床試驗(yàn)中，160名晚期頭頸部鱗狀細(xì)胞癌和食道癌的患者參加了研究，最終123名完成治療。研究結(jié)果顯示，順鉑/5-FU化療和H101聯(lián)用的患者緩解率為78.8%，而單用順鉑/5-FU的緩解率為39.6%?；谠摻Y(jié)果，我國(guó)CFDA于2005年批準(zhǔn)H101與化療聯(lián)合，用于鼻咽癌的治療。

表3 溶瘤病毒的主要臨床試驗(yàn)

3.2.2 體內(nèi)細(xì)胞基因改造

體內(nèi)細(xì)胞基因改造直接將外源遺傳物質(zhì)導(dǎo)入到人體，通常被簡(jiǎn)稱為基因治療，并被廣泛用于先天性遺傳的血液?。ㄑ巡　⒌刂泻Ｘ氀?，神經(jīng)系統(tǒng)疾?。I上腺白質(zhì)退行病變，ALD；氨基酸脫羧酵素缺乏癥，AADC），視覺(jué)系統(tǒng)疾病（先天黑內(nèi)障第二類(lèi)型疾病，LCA2）[5]。

（1）B型血友病治療

B型血友病是由于先天缺失凝血因子Ⅸ而產(chǎn)生，在世界范圍內(nèi)發(fā)病率達(dá)1/30 000～1/5000。通過(guò)優(yōu)化AAV8載體的生產(chǎn)工藝，降低空白病毒衣殼以降低免疫原性和優(yōu)化表達(dá)序列，體內(nèi)肝臟細(xì)胞在轉(zhuǎn)染AAV8載體后不僅可以長(zhǎng)期高效表達(dá)IX因子，而且在臨床Ⅱ期表現(xiàn)可以緩解血友病患者癥狀。據(jù)報(bào)道，臨床患者在使用此療法后，無(wú)需用替代療法即外源輸入凝血因子IX制品來(lái)阻止流血，極大改善了生活質(zhì)量。

（2）遺傳性神經(jīng)退性病變治療

ALD是X連鎖隱性遺傳病，只有兩種常規(guī)方法治療兒童期腦型ALD。第一種是飲食療法，即進(jìn)食羅倫佐油，這種油是由兩種食用油調(diào)和而成，用于減少ALD引起的極長(zhǎng)鏈脂肪酸（VLCFA）積聚；第二種是同種異體造血干細(xì)胞移植，即將基因匹配的干細(xì)胞捐贈(zèng)者的造血干細(xì)胞植入患者體內(nèi)。該同種異體造血干細(xì)胞移植使患者面臨著多重風(fēng)險(xiǎn)，如治療相關(guān)死亡率、移植失敗、移植物抗宿主?。℅VHD）以及用免疫抑制劑治療GVHD引起的機(jī)會(huì)性感染。另外，只有找到高度匹配的干細(xì)胞捐贈(zèng)者的患者才能使用這種療法。

利用慢病毒介導(dǎo)，增加的ABCD1基因就會(huì)開(kāi)始編碼功能性ALD蛋白，以取代缺失的ALD蛋白。臨床Ⅱ期結(jié)果顯示，參加該試驗(yàn)的17名患者均沒(méi)有出現(xiàn)嚴(yán)重的功能障礙，如失明、無(wú)法交流和依靠輪椅。

（3）遺傳性視網(wǎng)膜病變治療

遺傳性視網(wǎng)膜變性疾病是一類(lèi)由基因異常所導(dǎo)致的視網(wǎng)膜疾病的總稱，視網(wǎng)膜功能呈進(jìn)行性下降，視力亦隨之逐步下降，其中相當(dāng)一部分患者視力最終喪失至盲人水平，在過(guò)去十年，基因治療已經(jīng)證明可以給這些患者的復(fù)明帶來(lái)希望。

（4）LCA2及視網(wǎng)膜色素變性

最早開(kāi)始的基因治療是針對(duì)由RPE65基因突變所致的LCA2。在動(dòng)物模型中，用含有RPE65 cDNA的重組腺相關(guān)病毒載體（AAV2）進(jìn)行基因治療都非常成功，治療后視功能明顯提高，顯示了應(yīng)用基因療法治療遺傳性視網(wǎng)膜變性疾病的巨大潛力。2012年，Spark Therapeutics公司開(kāi)始了一項(xiàng)針對(duì)LCA2基因治療的Ⅲ期臨床試驗(yàn)，24位患者已被招募并接受了AAV2-hRPE65v2視網(wǎng)膜下注射治療，對(duì)其安全性和有效性的評(píng)估已經(jīng)在2015年完成，但結(jié)論尚未發(fā)表。這是第一個(gè)針對(duì)遺傳性視網(wǎng)膜變性疾病的Ⅲ期臨床試驗(yàn)，也標(biāo)志著基因療法距離普通患者不再遙不可及。

（5）無(wú)脈絡(luò)膜癥

無(wú)脈絡(luò)膜癥是一種X連鎖隱性遺傳病，與REP-1基因突變相關(guān)。2016年發(fā)表于《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》的結(jié)果表明，接受AAV2-REP1全劑量治療的5例患者的被治療眼在治療后的長(zhǎng)達(dá)3.5年觀察期間視力維持或得到改善，其中2例患者視力顯著改善，視力提高大于3行并持續(xù)到最后的時(shí)間點(diǎn)。相比于未治療眼，6位患者中的5位在3年內(nèi)視力下降。這不僅驗(yàn)證了基因治療的安全性和有效性，且在一定程度上證明療效較為持久。

（6）自身代謝疾病治療

脂蛋白脂酶缺乏遺傳?。↙PLD）是一種罕見(jiàn)的嚴(yán)重遺傳性疾病，目前無(wú)法治愈。利用腺病毒載體，荷蘭公司uniQure在肌肉中表達(dá)LPL基因。在兩項(xiàng)II/III期臨床試驗(yàn)中，LPLD患者的大腿肌肉接受了一系列的注射，隨后數(shù)周給予免疫抑制藥物減弱對(duì)病毒衣殼的免疫反應(yīng)。在注射12周后，成功地降低了血液中甘油三酯水平，在之后長(zhǎng)達(dá)2年的時(shí)間大大減低了胰腺炎發(fā)病率。

（7）呼吸系統(tǒng)疾病

囊性纖維化（cystic f brosis，CF）是一種罕見(jiàn)遺傳病，由CFTR基因（囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)因子）變異導(dǎo)致，使患者肺內(nèi)膜分泌出異常黏稠的黏液，反復(fù)感染導(dǎo)致致命肺病。CF患者平均死亡年齡為29歲，死亡率高達(dá)90%。

美國(guó)Copernicus公司使用非病毒基因?qū)爰夹g(shù)，開(kāi)發(fā)出了一種壓縮DNA技術(shù)，可使DNA鏈緊密結(jié)合以使其體積大幅變小，可以直接穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞以表達(dá)CFTR。這樣可以利用這些外來(lái)的DNA產(chǎn)生CF患者細(xì)胞所缺陷的蛋白，從而治療這種疾病。2015年，英國(guó)結(jié)束的臨床Ⅱ期試驗(yàn)顯示，與使用安慰劑相比，此基因療法在穩(wěn)定患者肺功能方面首次顯出明顯效果，且基因治療耐受性很好，治療組和安慰劑組的副作用發(fā)生率相當(dāng)。

4 國(guó)內(nèi)細(xì)胞和基因治療現(xiàn)狀

我國(guó)細(xì)胞治療主要可以分為兩類(lèi)：干細(xì)胞治療和免疫細(xì)胞治療。

4.1 干細(xì)胞治療現(xiàn)狀

我國(guó)早在20世紀(jì)60年代就開(kāi)始了骨髓干細(xì)胞移植方面的研究，1992年我國(guó)第一個(gè)骨髓移植非親屬供者登記組在北京成立，“中華骨髓庫(kù)”正式接受捐贈(zèng)，迄今為止研究和應(yīng)用最多的也仍然是造血干細(xì)胞：2002年，北京即建立了臍帶血干細(xì)胞庫(kù)。自20世紀(jì)90 年代后期以來(lái)，干細(xì)胞研究更一直受到政府和科技界的高度關(guān)注。

干細(xì)胞發(fā)展領(lǐng)域初期的寬松監(jiān)管致使國(guó)內(nèi)部分醫(yī)療機(jī)構(gòu)在缺少足夠研究基礎(chǔ)時(shí)倉(cāng)促進(jìn)入干細(xì)胞臨床應(yīng)用領(lǐng)域，引來(lái)部分國(guó)內(nèi)外批評(píng)的聲音。鑒于此，2012年，衛(wèi)生部叫停了在治療和臨床試驗(yàn)中使用任何未經(jīng)批準(zhǔn)使用的干細(xì)胞，并停止接受新的干細(xì)胞項(xiàng)目申請(qǐng)，中國(guó)的干細(xì)胞臨床應(yīng)用研究就此趨緩。

經(jīng)過(guò)多年發(fā)展，我國(guó)干細(xì)胞研究已經(jīng)在細(xì)胞重編程、多能性調(diào)控、遺傳篩選和修飾、特色動(dòng)物資源平臺(tái)等方面處于國(guó)際領(lǐng)先水平，干細(xì)胞領(lǐng)域論文與專(zhuān)利數(shù)量大幅增長(zhǎng)，部分研究機(jī)構(gòu)和科研人員的國(guó)際影響顯著提升。我國(guó)正在加快腳步積極開(kāi)展一批干細(xì)胞臨床試驗(yàn)，利用干細(xì)胞或結(jié)合生物材料治療重癥肝病、臟器缺損、視網(wǎng)膜色素變性、塵肺、脊髓損傷等，已在干細(xì)胞結(jié)合智能生物材料修復(fù)子宮壁治療不孕不育癥、干細(xì)胞改善重癥肝病的肝功能等方面取得良好進(jìn)展。市場(chǎng)上已經(jīng)涌現(xiàn)出一批特色干細(xì)胞存儲(chǔ)及產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)企業(yè)，一批基于成體干細(xì)胞的產(chǎn)品已經(jīng)開(kāi)展了臨床試驗(yàn)。

干細(xì)胞在我國(guó)未來(lái)產(chǎn)業(yè)化的方向是基因診斷試劑、基因藥物、干細(xì)胞產(chǎn)品以及干細(xì)胞移植等等，相關(guān)的公司有中源協(xié)和、博雅干細(xì)胞、北科生物和北大未名等。

4.2 免疫細(xì)胞治療

我國(guó)免疫細(xì)胞治療主要用于腫瘤治療方面。也可分為非特異性和特異性，前者包括NK、CIK，DC-CIK、CTL、后者包括前文提及的CAR-T。主要優(yōu)缺點(diǎn)見(jiàn)表4。

表4 國(guó)內(nèi)主要腫瘤免疫治療的優(yōu)缺點(diǎn)

表4 國(guó)內(nèi)主要腫瘤免疫治療的優(yōu)缺點(diǎn) （續(xù)表）

大部分國(guó)內(nèi)公司研究集中在非特異性免疫細(xì)胞療法，普遍門(mén)檻低、規(guī)模小，全國(guó)性的公司很少，大多是區(qū)域性的覆蓋為主。主要包括兩種類(lèi)型：一類(lèi)是偏市場(chǎng)拓展的綜合性公司，主要通過(guò)渠道資源+管理運(yùn)維+技術(shù)更新；另一類(lèi)是技術(shù)研發(fā)型公司，免疫學(xué)或臨床專(zhuān)家的課題項(xiàng)目，吸引高新技術(shù)企業(yè)跨界投資，整合資源。有研發(fā)實(shí)力的公司業(yè)務(wù)模式基本是通過(guò)上游產(chǎn)品銷(xiāo)售（培養(yǎng)基、試劑盒、細(xì)胞培養(yǎng)儀等）和細(xì)胞治療技術(shù)服務(wù)（非特異性治療技術(shù)）/細(xì)胞存儲(chǔ)來(lái)保證現(xiàn)金流，用以支持新技術(shù)的臨床試驗(yàn)（特異性治療技術(shù)）。管理運(yùn)營(yíng)能力和渠道資源將對(duì)技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化起到重要作用，仍然是短期內(nèi)公司保持及復(fù)制成功運(yùn)營(yíng)模式的關(guān)鍵，而如果想要擴(kuò)大應(yīng)用規(guī)模并獲得長(zhǎng)久的發(fā)展，具有臨床療效的產(chǎn)品和技術(shù)才是真正的核心。

可喜的是，在我國(guó)發(fā)展最快的是以CAR-T技術(shù)為代表的特異性腫瘤免疫細(xì)胞治療。它同樣也以CD19治療血液腫瘤為主，大多數(shù)都是采用自體移植方法和第二代CAR-T技術(shù)。其中斯丹賽公司已完成了26例患者的CAR-T治療和初步數(shù)據(jù)收集，其中23名患者達(dá)到了完全緩解，完全緩解率達(dá)88.5%，試驗(yàn)數(shù)據(jù)接近美國(guó)同行的研究成果，技術(shù)與美國(guó)同步，并已經(jīng)領(lǐng)先于歐洲和日本等其他國(guó)家和地區(qū)。西比曼生物科技（上海）有限公司的CAR-T臨床研究主要與解放軍301醫(yī)院韓為東教授合作，其在血液腫瘤和多種類(lèi)型實(shí)體瘤上取得了應(yīng)答，研發(fā)進(jìn)度處于國(guó)際領(lǐng)先。博生吉公司也針對(duì)實(shí)體瘤MUC1靶點(diǎn)，對(duì)肝細(xì)胞癌、非小細(xì)胞肺癌、胰腺癌和三陰性乳腺癌等適應(yīng)證進(jìn)行臨床研究。

在溶瘤病毒的研發(fā)方面，我國(guó)于2006年就批準(zhǔn)了世界上第一個(gè)溶瘤病毒（重組人5型腺病毒H101）上市，用于治療晚期鼻咽癌。中山大學(xué)顏光美教授團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)了一種20世紀(jì)60年代在海南島發(fā)現(xiàn)的M1病毒具有溶瘤的特性；在體外試驗(yàn)中，M1病毒能抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)，而不影響正常細(xì)胞[6]。

但是，目前我國(guó)在腫瘤免疫治療領(lǐng)域也面臨一大困境：很多腫瘤免疫治療在醫(yī)院中處于事實(shí)上的收費(fèi)臨床應(yīng)用，沒(méi)有任何臨床有效性和安全性數(shù)據(jù)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞免疫治療在技術(shù)含量、信譽(yù)度、臨床效果和規(guī)范程度仍然同國(guó)際有不小差距。

5 產(chǎn)業(yè)發(fā)展重點(diǎn)方向與關(guān)鍵技術(shù)

5.1 產(chǎn)業(yè)發(fā)展重點(diǎn)方向

在今后的五年，將有更多的細(xì)胞治療從實(shí)驗(yàn)室走向市場(chǎng)，其覆蓋領(lǐng)域?qū)ò┌Y、退行性老年疾病以及先天性遺傳病。需要加大對(duì)CAR-T為主導(dǎo)的腫瘤免疫治療在各種腫瘤尤其是實(shí)體瘤的應(yīng)用、干細(xì)胞介導(dǎo)的治療老年退行性疾病治療方法開(kāi)發(fā)，并加快對(duì)細(xì)胞基因治療產(chǎn)業(yè)化平臺(tái)的搭建。

5.2 產(chǎn)業(yè)發(fā)展關(guān)鍵技術(shù)

細(xì)胞治療和基因治療在過(guò)去五年間已經(jīng)有機(jī)融合，并在癌癥、退行性疾病和代謝類(lèi)疾病以及先天遺傳性疾病治療方面取得了突破性成果。今后，應(yīng)該重點(diǎn)關(guān)注的技術(shù)將包括利用 CRISPR為代表的基因組編輯用于細(xì)胞治療，但是在臨床試驗(yàn)時(shí)需要注意脫靶效應(yīng)出現(xiàn)的可能性；新一代CAR-T技術(shù)，以提高其藥效和特異性并降低毒性，或者減少不同個(gè)體間CAR-T細(xì)胞傳輸導(dǎo)致的免疫原性；尋找適合腫瘤細(xì)胞免疫治療的聯(lián)合治療新方案和對(duì)不同腫瘤的新型溶瘤病毒并降低其免疫原性。

6 “十三五”產(chǎn)業(yè)發(fā)展重大行動(dòng)及實(shí)現(xiàn)路徑建議

6.1 改變監(jiān)管亂象

生物治療是一種非常個(gè)性化的療法，不同產(chǎn)品治療手段區(qū)別較大，產(chǎn)品的供應(yīng)方式和傳統(tǒng)藥物有著根本性的區(qū)別。因此，實(shí)現(xiàn)生物治療產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)化，做到藥效和風(fēng)險(xiǎn)可控是首要任務(wù)。衛(wèi)生部門(mén)強(qiáng)調(diào)創(chuàng)新細(xì)胞治療技術(shù)不僅要有技術(shù)屬性，也有產(chǎn)品屬性，可能需要藥監(jiān)部門(mén)管理和審批。藥監(jiān)部門(mén)需要建立新理念、新機(jī)制和新方法。

干細(xì)胞在疾病治療、再生修復(fù)等方面都展現(xiàn)了不可估量的價(jià)值和潛能，這也是全球包括美國(guó)和中國(guó)眾多醫(yī)療機(jī)構(gòu)、醫(yī)藥企業(yè)競(jìng)相推出“干細(xì)胞治療”口號(hào)的主要原因。一些實(shí)驗(yàn)室正在進(jìn)行相關(guān)的基礎(chǔ)研究，但是美國(guó)FDA和我國(guó)的CFDA并沒(méi)有批準(zhǔn)任何針對(duì)肌肉萎縮癥、自閉癥及腦癱的干細(xì)胞治療項(xiàng)目。在臨床試驗(yàn)方面，我國(guó)注冊(cè)的干細(xì)胞相關(guān)臨床試驗(yàn)也多以較成熟的成體干細(xì)胞為主，在代表干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)發(fā)展趨勢(shì)的多能干細(xì)胞轉(zhuǎn)化應(yīng)用方面較為欠缺。此外，我國(guó)干細(xì)胞治療相關(guān)的技術(shù)規(guī)范、標(biāo)準(zhǔn)、倫理等研究相對(duì)滯后，特別是缺乏專(zhuān)門(mén)從事干細(xì)胞質(zhì)控和標(biāo)準(zhǔn)研究的隊(duì)伍和學(xué)術(shù)機(jī)構(gòu)。這些都影響了我國(guó)干細(xì)胞及轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的健康發(fā)展。我國(guó)與基因治療相關(guān)的政策法規(guī)較少，涉及內(nèi)容較簡(jiǎn)單，對(duì)在基因治療相關(guān)研究的過(guò)程中所涉及的法律法規(guī)問(wèn)題沒(méi)有詳細(xì)的說(shuō)明和規(guī)定。各種政策法規(guī)的頒布時(shí)間年代較為久遠(yuǎn)，滯后于國(guó)內(nèi)基因治療臨床研究的發(fā)展，也滯后于國(guó)際先進(jìn)國(guó)家。從政策法規(guī)頒布的部門(mén)而言，管理機(jī)構(gòu)較多，缺乏相對(duì)統(tǒng)一的部門(mén)，這樣并不利于在管理上的統(tǒng)籌協(xié)調(diào)。

在免疫細(xì)胞治療方面，需建立規(guī)范的治療方案，進(jìn)一步提高生物治療的臨床療效。腫瘤免疫治療目前是第三類(lèi)醫(yī)療技術(shù)監(jiān)管，但是生物治療要求極高，藥品和醫(yī)療技術(shù)只有在嚴(yán)格監(jiān)管下才能作為標(biāo)準(zhǔn)療法。需要在細(xì)胞治療一些關(guān)鍵環(huán)節(jié)加入嚴(yán)格的質(zhì)量監(jiān)測(cè)。首先要加強(qiáng)對(duì)臨床研究組織結(jié)構(gòu)、場(chǎng)地人員和實(shí)驗(yàn)室規(guī)范的質(zhì)量管理，比如提供自體免疫細(xì)胞制劑制備的實(shí)驗(yàn)室就要求省級(jí)以上藥品監(jiān)督管理部門(mén)和疾病預(yù)防控制中心檢測(cè)合格，符合GMP要求的自體免疫細(xì)胞制備室無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)的潔凈度要達(dá)到百級(jí)的水平。其次，我們還要強(qiáng)化細(xì)胞治療臨床研究中的質(zhì)量管理，包括臨床試驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)、倫理監(jiān)管、療效和安全性評(píng)價(jià)與監(jiān)測(cè)等。

6.2 增加經(jīng)濟(jì)費(fèi)效

由于目前基因治療研發(fā)與給藥方式成本較高，導(dǎo)致其治療定價(jià)昂貴，隨著細(xì)胞基因治療技術(shù)等方面的發(fā)展，其價(jià)格會(huì)相應(yīng)降低。目前認(rèn)為，主要有3種潛在的支付方式：①一次性付費(fèi)模式，這是藥企最期望的支付方式，但是對(duì)于患者來(lái)說(shuō)費(fèi)用過(guò)高；②分期付款模式，類(lèi)似目前的貸款消費(fèi)，分期還貸；③依療效付費(fèi)模式，對(duì)于患者也許是最合理的支付模式?？紤]到一些細(xì)胞基因治療“一勞永逸”的特效，據(jù)治療后每年的確切療效為當(dāng)初的治療分期付費(fèi)，即分?jǐn)偭酥委熧M(fèi)用，減輕了患者當(dāng)前的支付負(fù)擔(dān)，也讓患者在確切治療效果面前愿意付費(fèi)，但讓藥企擔(dān)心的是如何有效保障支付者按期合理付款。因此，細(xì)胞基因治療定價(jià)與支付制度的改革與完善是一大挑戰(zhàn)，也是基因治療全面走向市場(chǎng)的必經(jīng)之路。

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Advances and perspectives in cell and gene therapy

WANG Ying，CHEN Xuhong，YU Juntao，CHEN Bo
Chengdu Conmed Biosciences, Inc, Chengdu 610041, China

With the recent progress especially in gene targeting and induced pluripotent stem cells（iPSCs）, cell therapies offer the promise of providing lasting therapies and even cures for diseases that were previously untreatable or for which only temporary or suboptimal treatments were available. Cell therapies are a diverse group across cell types and therapeutic indications. They have been an active area of research for many years and now reach to the point of successful commercial development and patient access. In this article, we classify the cell therapy based on underlying technologies rather than cell types. We also present the recent progress of cell therapies toward clinical translation, examine how they are addressing the clinical, manufacturing and reimbursement requirements, describe the critical challenges and provide the perspectives of the future.

cell therapy; gene therapy; immunotherapy

10.3969/j.issn.1674-0319.2017.02.010