人用疫苗規(guī)?；a(chǎn)工藝與技術(shù)

于曉輝，李啟明，李秀玲，沈榮，張愛華，張云濤

1.中國生物技術(shù)股份有限公司，北京 100029 2.北京生物制品研究所有限責任公司，北京 101111 3.蘭州生物制品研究所有限責任公司，蘭州 730046

人用疫苗規(guī)?；a(chǎn)工藝與技術(shù)

于曉輝1，李啟明2，李秀玲2，沈榮3，張愛華1，張云濤1

1.中國生物技術(shù)股份有限公司，北京 100029 2.北京生物制品研究所有限責任公司，北京 101111 3.蘭州生物制品研究所有限責任公司，蘭州 730046

張云濤，中國生物技術(shù)股份有限公司研究員，博士，總裁助理。主要從事新型病毒性疫苗研發(fā)及產(chǎn)業(yè)化、生物技術(shù)藥物（單抗等）的開發(fā)、免疫診斷試劑的開發(fā)及產(chǎn)業(yè)化。擔任“十二五”傳染病重大專項“新型乙肝疫苗研制”項目組組長和“鼻腔噴霧型乙肝疫苗的研究”課題組組長。作為課題負責人承擔“十二五”重大新藥創(chuàng)制項目課題“原創(chuàng)性全人源單克隆抗體藥物研發(fā)技術(shù)平臺的建立及應(yīng)用”。作為主要執(zhí)行人承擔“863”課題“甲型H1N1流感病毒裂解疫苗上市后效果和安全性評價”和“國藥集團技術(shù)創(chuàng)新產(chǎn)學(xué)研聯(lián)盟建設(shè)”。作為課題負責人完成北京市科技計劃專項課題“生物藥（疫苗類）中試放大服務(wù)平臺標準體系的建設(shè)”。發(fā)表SCI文章5篇。 主持“抗生素系列檢測試劑”的研制工作，已完成8種抗生素食品安全檢測試劑的研制。2013年“肝炎診斷試劑的研制”獲得省科技進步二等獎。E-mail:zhangyuntao@sinopharm.com

隨著社會進步和人類健康需求的提高，人用疫苗研發(fā)及生產(chǎn)技術(shù)發(fā)展迅速，我國在疫苗研發(fā)技術(shù)和生產(chǎn)工藝的改進取得了長足的發(fā)展。分別闡述了滅活病毒性疫苗、多糖蛋白結(jié)合疫苗、基因工程疫苗規(guī)模化生產(chǎn)工藝和技術(shù)的國內(nèi)外現(xiàn)狀和未來發(fā)展趨勢。

疫苗；規(guī)?；a(chǎn)；工藝；技術(shù)

疫苗在保障國民健康和國家生物安全方面發(fā)揮了巨大作用。我國自實施計劃免疫以來，傳染病的發(fā)病率和死亡率得到有效控制，成功消滅了天花、脊髓灰質(zhì)炎和孕婦新生兒破傷風，常見兒童傳染病如麻疹、腮腺炎、風疹、百日咳、白喉、破傷風、乙型性腦炎、流行性腦脊髓膜炎等疾病的發(fā)病率和死亡率下降幅度在95%以上，乙肝感染降到1%以下，具有巨大的社會效益和經(jīng)濟效益。我國疫苗產(chǎn)業(yè)雖已取得了長足的進展，但疫苗產(chǎn)業(yè)的自主創(chuàng)新能力、新產(chǎn)品轉(zhuǎn)化、關(guān)鍵核心技術(shù)應(yīng)用、規(guī)模化生產(chǎn)工藝和技術(shù)水平，同發(fā)達國家相比仍有一定差距。而且隨著全球經(jīng)濟一體化和社會的迅速發(fā)展，抗生素濫用、大氣污染等多種因素影響，傳染病的多發(fā)和高發(fā)態(tài)勢仍然沒有得到根本改變，生物恐怖的危害也不斷加劇，一些重大疾病及新發(fā)、突發(fā)傳染病，如艾滋病、流感、登革熱、手足口病、埃博拉等仍嚴重威脅著人類生命健康。

1 國內(nèi)外滅活病毒性疫苗的生產(chǎn)工藝與技術(shù)

滅活病毒性疫苗為通過化學(xué)、熱處理或輻射處理經(jīng)培養(yǎng)純化的病毒性疫苗，其主要優(yōu)點是：與活病毒疫苗相比更穩(wěn)定和安全，不會發(fā)生因疫苗接種而導(dǎo)致的感染；被滅活但仍可被機體的免疫系統(tǒng)識別，并產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答；可用于免疫系統(tǒng)相對較弱的個體；穩(wěn)定性較好，無需冷凍，方便運輸。其缺點主要為免疫原性相對較弱，一般需進行多次接種。

目前已經(jīng)上市的滅活病毒性疫苗主要有脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗、甲型肝炎滅活疫苗、流感病毒滅活疫苗、人用狂犬滅活疫苗、乙型腦炎滅活疫苗、雙價腎出血熱滅活疫苗（表1）[1]。

1.1 細胞基質(zhì)和培養(yǎng)方式

目前國內(nèi)外滅活病毒性疫苗的細胞基質(zhì)主要為人二倍體細胞、原代細胞、雞胚細胞和Vero細胞。其中人二倍體細胞主要有2BS株、KMB-17株、WI-38株和MRC-5株。各種細胞的特性不一樣，培養(yǎng)方式也不一樣。人二倍體細胞傳代比例和傳代代次比較受限，不利于大規(guī)模細胞培養(yǎng)，且對培養(yǎng)基和牛血清質(zhì)量要求較高。原代細胞主要有地鼠腎細胞、沙鼠腎細胞，操作繁瑣，存在外源因子污染風險。人二倍體細胞和原代細胞的培養(yǎng)方式主要為轉(zhuǎn)瓶、細胞工廠，這兩種培養(yǎng)方式較為傳統(tǒng)，每批培養(yǎng)體積較小，較為費時費力，其生產(chǎn)規(guī)模僅僅是轉(zhuǎn)瓶或細胞工廠數(shù)量上的增加，難以規(guī)?；糯?。

Vero細胞是第一個可連續(xù)傳代的哺乳動物細胞，來源于非洲綠猴腎細胞，目前廣泛用于疫苗的生產(chǎn)，為滅活病毒性疫苗常用的細胞基質(zhì)。國內(nèi)外主要采用微載體生物反應(yīng)器進行Vero細胞培養(yǎng)。與細胞工廠培養(yǎng)方式相比，微載體生物反應(yīng)器培養(yǎng)具有明顯的優(yōu)點：可進行高密度培養(yǎng)；可保證細胞在規(guī)定細胞傳代限定代次內(nèi)進行分級放大，易于進行規(guī)?；糯蟆庖延衅髽I(yè)建立了在8周內(nèi)從1mL安瓶到6000L生物反應(yīng)器的Vero細胞放大生產(chǎn)工藝，在整個規(guī)?；糯筮^程中Vero細胞的產(chǎn)量和活性并不降低[2]。表2顯示了不同反應(yīng)器規(guī)模細胞培養(yǎng)的生長狀態(tài)。從中可以看出，在反應(yīng)器內(nèi)進行15～6000L規(guī)?；糯笈囵B(yǎng)時，Vero細胞密度體現(xiàn)較好的一致性[2]。

正是由于Vero細胞在病毒性疫苗生產(chǎn)中的應(yīng)用，使得現(xiàn)代病毒性疫苗的生產(chǎn)進入工業(yè)化、規(guī)?；瘯r代，生產(chǎn)過程更加可控，批間一致性更好。目前國內(nèi)外主流的以Vero細胞為基質(zhì)的疫苗生產(chǎn)均采用微載體生物反應(yīng)器培養(yǎng)工藝。

以Vero細胞為基質(zhì)生產(chǎn)的滅活病毒性疫苗主要有脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗、狂犬病滅活疫苗、日本乙型腦炎滅活疫苗，目前Vero細胞還被用于小兒輪狀病毒活疫苗Rotateq1（Merck）和Rotarix1（葛蘭素史克）[3]、H5N1大流感疫苗Preflucel1（Baxter）[4]、日本腦炎疫苗Ixiaro1（Intercell）的生產(chǎn)[2]。此外，還被批準用于天花活疫苗ACAM20001（Sanofi Pasteur）的生產(chǎn)[2]。

表1 已上市滅活病毒性疫苗

表2 不同規(guī)格生物反應(yīng)器培養(yǎng)Vero細胞

Vero細胞等傳代細胞培養(yǎng)均采用含血清培養(yǎng)，但含血清培養(yǎng)對于病毒性疫苗的下游純化也有較高的要求，需要嚴格控制血清中BSA的含量、純化的回收率等一些關(guān)鍵的指標，所以無血清細胞培養(yǎng)技術(shù)成為國內(nèi)外細胞培養(yǎng)研究熱點之一。Vero細胞的研究的另一個熱點是進行細胞懸浮化高密度培養(yǎng)。與使用微載體不同，細胞進行懸浮化培養(yǎng)后，細胞的貼壁特性發(fā)生了改變，細胞不需要消化可直接傳代，并且可以提高細胞的發(fā)酵密度。

1.2 生產(chǎn)工藝

國內(nèi)外的滅活病毒性疫苗均需要經(jīng)過收獲、澄清、濃縮、純化、滅活等生產(chǎn)工藝。其中純化主要采用柱層析或蔗糖密度梯度離心法。這兩種方式各有優(yōu)缺點：層析法便于線性放大，批間一致性較好，但是試劑成本較高；蔗糖密度梯度離心法純化的抗原成分單一，可有效區(qū)分空心和實心病毒顆粒，但每批處理量較小，后期需要除糖處理。國內(nèi)外上市的滅活病毒性疫苗多采用層析純化工藝。

目前病毒滅活主要采用β-丙內(nèi)酯和甲醛兩種滅活劑。β-丙內(nèi)酯常溫下是無色黏稠狀液體，主要通過作用于病毒RNA從而達到滅活病毒的效果。目前上市的疫苗中采用β-丙內(nèi)酯滅活的主要有狂犬疫苗和雙價腎出血熱滅活疫苗。

在疫苗研究初期人們就已使用甲醛進行細菌和病毒性疫苗的滅活。甲醛對于病毒核酸和蛋白質(zhì)都具有破壞作用。甲醛對單鏈核酸的破壞最為有效，因此常被用于RNA病毒的滅活。脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗、甲型肝炎滅活疫苗、流感病毒滅活疫苗、乙型腦炎滅活疫苗等均采用甲醛滅活工藝。

1.3 質(zhì)量控制

滅活病毒性疫苗的主要控制指標為病毒抗原活性成分、純度以及宿主細胞DNA、宿主細胞蛋白（HCP）、滅活劑等的殘留成分控制。純度的檢測方法主要有HPLC、SDS-PAGE或比活等指標。其中不同疫苗對Vero細胞殘余DNA含量要求不太統(tǒng)一，WHO生物學(xué)標準化專業(yè)委員會評估殘留DNA引起的轉(zhuǎn)化事件的風險后認為注射產(chǎn)品的DNA含量每劑小于10ng均可以接受[5]。目前，國內(nèi)的狂犬疫苗等中的Vero細胞殘余DNA含量標準為每劑不高于100pg。但美國上市的IPV（IPOL?，Sanof Pasteur）Vero細胞殘余DNA含量每劑低于10pg。國內(nèi)上市的sIPV DNA含量為每劑不高于50pg。Vero細胞HCP含量一般為每劑不高于50ng。

2 多糖蛋白結(jié)合疫苗規(guī)?；a(chǎn)工藝與技術(shù)

2.1 國外行業(yè)現(xiàn)狀

2.1.1 肺炎球菌結(jié)合疫苗

目前，全球已上市的肺炎球菌結(jié)合疫苗有3種，分別是惠氏（Wyeth）公司生產(chǎn)的7價肺炎球菌結(jié)合疫苗Prevnar7（2000年上市）和13價肺炎球菌結(jié)合疫苗Prevnar13（2010年上市），以及葛蘭素史克公司生產(chǎn)的11價肺炎球菌結(jié)合疫苗Synf orix（2009年上市）[6-8]。

（1）Prevnar

Prevnar7配方中包括了4、6B、9V、14、18C、19F、23F共7個血清型的結(jié)合物，Prevnar13包括了1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F共13個血清型的結(jié)合物，比Prevnar7多6個型別的結(jié)合物（1、3、5、6A、7F、19A），兩者均以CRM197為載體蛋白，均為磷酸鋁佐劑吸附劑型。惠氏公司結(jié)合物制備采用的工藝路線為：將天然多糖進行酸水解降低分子量至適宜范圍（有些型多糖在氧化反應(yīng)中自行降解，不需要預(yù)先進行水解），用高碘酸鈉氧化多糖鄰羥基使多糖重復(fù)單位產(chǎn)生醛基，醛基與CRM197分子上的氨基，在還原劑（如NaBH4）存在的條件下發(fā)生還原胺化反應(yīng)生成酰胺鍵，該方法被稱為還原胺化法。這種方法的優(yōu)點是對多糖重復(fù)單位上的鄰羥基進行可控的修飾，不破壞多糖分子的其他結(jié)構(gòu)，易于質(zhì)控。缺點是還原胺化反應(yīng)需要的時間較長，有的型結(jié)合反應(yīng)需要5d。在0.5mL Prevnar13中，有12種血清型多糖各2μg，4μg 6B型多糖，0.125mg磷酸鋁佐劑。Prevnar13的劑型為不含膠乳的單劑預(yù)充式注射器灌裝注射液[9-10]。

（2）Synf orix

Synf orix配方包括1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F、23F共10個血清型結(jié)合物。該產(chǎn)品使用了3種不同的載體蛋白，其中1、4、5、6B、7F、9V、14、23F載體蛋白為不可分型流感嗜血桿菌表面蛋白D（PD），19F載體蛋白為白喉類毒素（DT），18C載體蛋白為破傷風類毒素（TT）。劑型同樣為磷酸鋁佐劑吸附劑型（0.5mg磷酸鋁佐劑/劑）。每劑疫苗含1、5、6B、7F、9V、14、23F這7個血清型多糖各1μg，4、18C、19F各3μg。所采用的技術(shù)路線為對除5、6B、23F這3個型外的其他天然多糖分子進行微流化（microf uidization）處理以降低分子量，在不同條件下用1-氰基-4-（二甲氨基）吡啶四氟硼酸鹽［1-cyano-4-（dimethylamino）pyridinium tetraf uo-roborate，CDAP］將多糖的羥基活化為氰酸酯，活化后的多糖的氰酸酯通過與載體蛋白或己二酸二酰肼（adipicdihydazide，ADH）衍生的載體蛋白的氨基或肼基形成異脲衍生物而實現(xiàn)結(jié)合。其原理與傳統(tǒng)的溴化氰活化法相同，但活化條件更加溫和，活化物副反應(yīng)發(fā)生率低，對多糖的結(jié)構(gòu)改變較少。與還原胺化法相比，耗時少。此方法的缺點是活化時間僅幾十秒，要在這幾十秒內(nèi)對溶液迅速變化的pH進行控制并不容易，由于多糖活化和結(jié)合是連續(xù)完成的，難以對多糖活化進行有效質(zhì)控，反應(yīng)條件偏堿性，對多糖上堿性條件敏感的基團難免會造成破壞，結(jié)合載體蛋白利用率不高[11]。

2.1.2 腦膜炎球菌多價結(jié)合疫苗

當前國際上腦膜炎球菌結(jié)合疫苗的發(fā)展趨勢為包含A、C、Y、W135等4個血清群的多價結(jié)合疫苗，目前全球已上市的有3家產(chǎn)品，分別為賽諾菲巴斯德的Menactra、諾華的Menveo（2014年被葛蘭素史克收購）、葛蘭素史克的Nimenrix。

此外，還有一種聯(lián)合疫苗，葛蘭素史克的C、Y群腦膜炎球菌與b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗，其產(chǎn)品名為Menhibrix。

（1）Menactra

液體劑型，2005年獲得批準上市，規(guī)格為0.5mL，其中含A、C、Y、W135群腦膜炎球菌多糖各4μg，含載體蛋白白喉類毒素DT約48μg。

其基本工藝路線為：①用弱酸和雙氧水水解多糖，制備多糖水解物；②各群多糖水解物分別按照不同工藝進行衍生（A群衍生物為多糖溶液中加入EDAC和ADH，在A群多糖的磷酸基團上連接肼基。C群、Y群、W135群衍生物為利用氰基硼氫化鈉將ADH與多糖的末端醛基結(jié)合，衍生出肼基。然后多糖衍生物溶液加入EDAC，直接與DT結(jié)合）。

（2）Menveo

2010年獲得批準上市。A群為凍干劑型，C、Y、W135群為液體劑型，規(guī)格為0.5mL。每劑含A群多糖10μg，C、Y、W135群多糖各5μg，載體蛋白為CRM197蛋白。

其基本工藝路線為：首先多糖用弱酸水解為分子量約為12～16個重復(fù)單位的片段；在還原劑作用下，將多糖的末端醛基還原成氨基；然后經(jīng)酯化產(chǎn)生末端活性酯基團；最后與CRM197結(jié)合[12]。

（3）Nimenrix

2012年獲得批準上市，為凍干劑型，蔗糖作為賦形劑。每劑含A、C、Y、W135群多糖各5μg，載體蛋白為破傷風類毒素。

其基本工藝路線如下。①將莢膜多糖進行降解。②采用氰基活化法活化多糖。③A群和C群結(jié)合：多糖用CDAP活化后與ADH進行衍生，然后與TT結(jié)合；④Y群和W135群結(jié)合：用CDAP活化后直接與TT結(jié)合。

（4）Menhibrix

2012年獲得批準上市。為凍干劑型，賦形劑為蔗糖。每劑含b型流感嗜血桿菌莢膜多糖2.5μg，C、Y群多糖各5μg。載體蛋白為破傷風類毒素。每劑含12.6mg蔗糖。

2.2 國內(nèi)行業(yè)現(xiàn)狀

2.2.1 13價肺炎球菌結(jié)合疫苗

國內(nèi)企業(yè)尚無上市的產(chǎn)品，當前進度領(lǐng)先的為玉溪沃森，已經(jīng)完成Ⅲ期臨床疫苗的接種工作，蘭州生物正在進行Ⅱ期臨床研究，民海生物也已進入了臨床研究。

2.2.2 AC群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗

我國在20世紀80年代已開始研發(fā)A群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗（TT為載體），上海生物制品研究所采用的先將蛋白質(zhì)衍生后與多糖偶聯(lián)的工藝，動物實驗表明該法可增強結(jié)合物中多糖的免疫原性[13]，但研究未能進一步持續(xù)下去。后來國內(nèi)多使用先將多糖衍生，再與蛋白質(zhì)載體偶聯(lián)的方法研制腦膜炎球菌結(jié)合疫苗。

2006年以來我國先后有4家企業(yè)的AC群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗獲準生產(chǎn)（表3）。這些產(chǎn)品都以TT為載體，每劑每群多糖含量為10μg，以乳糖為保護劑；均采用氰基活化法進行多糖的衍生；結(jié)合物都采用柱層析純化工藝。

2.2.3 ACYW135群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗

ACYW135群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗在國內(nèi)尚未形成上市產(chǎn)品，據(jù)統(tǒng)計，國內(nèi)已有6家企業(yè)獲得臨床研究批件并進入臨床階段。進度最快的已經(jīng)完成Ⅲ期臨床研究，正在進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。

3 基因工程疫苗規(guī)?；a(chǎn)工藝和技術(shù)

基因工程疫苗是指使用DNA重組技術(shù)，改造病原微生物的基因組，以降低其致病性，提高其免疫原性；或者將病原微生物基因組中的一個或多個保護性抗原編碼的基因片段克隆到表達載體，通過原核或真核表達系統(tǒng)誘導(dǎo)表達外源蛋白，經(jīng)純化等工藝步驟制成疫苗，接種動物產(chǎn)生保護性抗體，達到防治傳染病的目的。近年來，隨著分子生物學(xué)、反相遺傳學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)等理論研究和技術(shù)方法的不斷突破，以及專業(yè)儀器的不斷升級，基因工程疫苗的進展也日新月異。目前利用基因工程技術(shù)已經(jīng)使用和正在研制開發(fā)的新型疫苗主要有基因工程亞單位疫苗、基因工程活載體疫苗、核酸疫苗、合成肽疫苗、轉(zhuǎn)基因植物疫苗等，這些疫苗統(tǒng)稱為基因工程疫苗。與傳統(tǒng)疫苗相比，基因工程疫苗具有如下諸多優(yōu)勢：①抗原成分明確，表達通路清楚可控，安全性高；②生產(chǎn)成本低，工藝步驟穩(wěn)定，易于規(guī)模化放大；③質(zhì)量控制的方法和標準具有一定通用性，從而提高安全性；④通過載體或抗原蛋白的上游設(shè)計，可構(gòu)建能夠?qū)Χ喾N疾病產(chǎn)生保護的多價疫苗?，F(xiàn)在基因工程疫苗已成為生物制品產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一種趨勢，在各種疾病的防控方面發(fā)揮重要作用。

表3 我國已上市的AC群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗

基因工程疫苗的生產(chǎn)技術(shù)流程包括四個步驟：上游保護性抗原/表位和表達載體設(shè)計，基因工程菌/細胞構(gòu)建，大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)，目的蛋白純化。基因工程蛋白的研發(fā)和規(guī)?；a(chǎn)進入門檻高，尤其是建立工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)平臺，需要技術(shù)、人才和資本的多年積累。其中，高表達工程菌株/細胞株的構(gòu)建和下游生產(chǎn)純化工藝是關(guān)鍵技術(shù)[14]。以提高單位制品產(chǎn)量、細胞高密度培養(yǎng)及表達[15]、簡化生產(chǎn)工藝、降低生產(chǎn)成本、保證大規(guī)模生產(chǎn)制品質(zhì)量為目的的核心工藝開發(fā)已成為各大生物公司競相開展的前沿課題。

3.1 國外基因工程疫苗規(guī)?；a(chǎn)工藝與技術(shù)

國際上一些知名疫苗制造企業(yè)在基因工程疫苗的制備方面已開始逐漸走向工藝規(guī)模化、自動化和一次性化制備階段。工藝的規(guī)?；闆r在一定程度上反映了制造工藝的先進性和穩(wěn)定性。在大幅降低了疫苗產(chǎn)品成本的同時也降低了疫苗批間質(zhì)量差異帶來的風險。規(guī)?；囵B(yǎng)是常規(guī)疫苗生產(chǎn)領(lǐng)域的主要技術(shù)，目前國際主流的培養(yǎng)規(guī)模為3000～8000L，多采用批式或批式加量培養(yǎng)，進行計算機二級控制，實現(xiàn)完全自動化[16]。近幾年，針對不同宿主細胞特點和疫苗制品生產(chǎn)工藝，用于疫苗生產(chǎn)的個性化細胞培養(yǎng)基的需求不斷增加，市場供求已趨于正規(guī)化。自動化是規(guī)?；a(chǎn)的目標和趨勢，即采用自動化的分離純化體系，包括細胞破碎、微濾、超濾和層析等技術(shù)，同時，整體柱、移動模擬床色譜、膜色譜等新興技術(shù)也逐漸應(yīng)用于規(guī)模化生產(chǎn)中。自動化的優(yōu)點在于生產(chǎn)過程中減少人力成本，提高效率，降低人為操作誤差及污染風險。一次性產(chǎn)品包括規(guī)?；a(chǎn)過程中接觸制品的裝置、器具和耗材，其應(yīng)用可使制品質(zhì)量可控、便于驗證。一次性細胞培養(yǎng)反應(yīng)器已發(fā)展為生物醫(yī)藥（包括疫苗）產(chǎn)品生產(chǎn)的主要形式，其發(fā)展對于降低疫苗生產(chǎn)成本、提高經(jīng)濟效益、確保制品的安全具有重要意義。國外疫苗生產(chǎn)企業(yè)多采用“個性化”服務(wù)的方式與某些企業(yè)合作建立一種“協(xié)議服務(wù)”的商業(yè)關(guān)系。通過模塊化、平臺化操作研制最適合自身產(chǎn)品特點的個性化技術(shù)應(yīng)用于生產(chǎn)實踐，廠家為客戶提供最優(yōu)化的技術(shù)服務(wù)以及相關(guān)的技術(shù)支持，例如定制培養(yǎng)基、定制層析介質(zhì)等，幫助其提高產(chǎn)能，實現(xiàn)生產(chǎn)效率的大幅度提升[16]。規(guī)模性自動化、多參數(shù)系統(tǒng)化的疫苗生產(chǎn)技術(shù)平臺為疫苗生產(chǎn)效率提高、生產(chǎn)工藝的一致性以及疫苗質(zhì)量的穩(wěn)定提供了保障。

3.2 國內(nèi)基因工程疫苗規(guī)?；a(chǎn)工藝與技術(shù)

中國生物醫(yī)藥企業(yè)起步于20世紀80年代初期，經(jīng)過30年的努力，生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)取得一定發(fā)展，生物產(chǎn)業(yè)已初具規(guī)模，在發(fā)展中國家屬于較高水準。但我國疫苗的規(guī)?；a(chǎn)工藝研究起步較晚，大多處于半自動化階段，其根本原因在于，研發(fā)人員在“研究和生產(chǎn)的關(guān)聯(lián)意識”和“質(zhì)量源于設(shè)計”等理念上認識的差距，致使初期的研發(fā)設(shè)計與規(guī)?；a(chǎn)制備脫節(jié)。臨床前期的研究很少考慮到工藝的可放大性和終產(chǎn)品質(zhì)量的可控性。制備工藝往往僅限于實驗室規(guī)模，不適合規(guī)模化生產(chǎn)。如純化工藝中，實驗室研究階段廣泛的采用超速離心和親和層析法，均為間斷性操作且費用較高，很難應(yīng)用于生產(chǎn)。隨著國外疫苗研發(fā)和生產(chǎn)企業(yè)在國內(nèi)廣泛設(shè)廠投產(chǎn)及國內(nèi)疫苗質(zhì)量控制監(jiān)察體系的不斷完善，這方面差距在逐漸縮小。此外，疫苗生產(chǎn)用表達系統(tǒng)和宿主細胞方面，國外的研發(fā)機構(gòu)通常擁有專利技術(shù)保護，具有相對成熟的技術(shù)儲備；規(guī)?；a(chǎn)的儀器設(shè)備方面，無論是高密度發(fā)酵的生物反應(yīng)器還是規(guī)?；蛛x純化的層析介質(zhì)、膜分離技術(shù)[17]，幾乎所有的關(guān)鍵儀器設(shè)備都依賴進口，這極大地限制了我國疫苗規(guī)?；l(fā)展的進程。

基因工程疫苗領(lǐng)域重點在于上游設(shè)計，在疫苗研發(fā)初期綜合考慮工藝放大可行性、質(zhì)量可控性甚至廠房和設(shè)備需求，可迅速實現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)占領(lǐng)市場，同時降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率，確保安全。因此，相比傳統(tǒng)疫苗，我國的基因工程疫苗更容易在產(chǎn)業(yè)化能力方面與國際接軌。

4 未來發(fā)展趨勢與展望

4.1 滅活病毒性疫苗技術(shù)和工藝的發(fā)展趨勢

滅活病毒性疫苗技術(shù)和工藝的發(fā)展趨勢主要體現(xiàn)在以下幾點。產(chǎn)業(yè)化與規(guī)模化程度進一步提高，微載體生物反應(yīng)器規(guī)模更大、高密度發(fā)酵技術(shù)參數(shù)的優(yōu)化等；新型細胞基質(zhì)研究，進一步提高細胞基質(zhì)的安全性和培養(yǎng)濃度；細胞和病毒培養(yǎng)基的優(yōu)化，包括無動物來源的培養(yǎng)基配方研究等；純化技術(shù)的進一步提高，最大限度提高目標抗原純度和比活；利用反向遺傳學(xué)等技術(shù)進行疫苗生產(chǎn)用毒株的改造。

4.2 多糖蛋白結(jié)合疫苗技術(shù)和工藝的發(fā)展趨勢

使用符合歐盟標準的原料多糖,并在此基礎(chǔ)上把原料多糖的C多糖、殘余蛋白和核酸含量控制在1%以內(nèi)。載體蛋白質(zhì)使用精制后進一步純化的TT，TT單體含量達到90%，并使用基質(zhì)輔助激光解吸-飛行時間（MALDI-TOF）質(zhì)譜技術(shù)檢測蛋白質(zhì)準確的分子量和單體含量。通過這些技術(shù)研發(fā)，使結(jié)合效率提高至30%～40%，建立新的過程質(zhì)量控制方法和臨床效果評價方法，與國際接軌。

4.3 基因工程疫苗技術(shù)和工藝的發(fā)展趨勢

目前以基因工程制品為主導(dǎo)的基因工程應(yīng)用產(chǎn)業(yè)已成為全球發(fā)展最快的產(chǎn)業(yè)之一，發(fā)展前景廣闊。基因工程制品主要包括細胞因子、抗體、疫苗、激素和寡核苷酸藥物等。它們對預(yù)防人類的腫瘤、心血管疾病、遺傳病、糖尿病、包括艾滋病在內(nèi)的各種傳染病、類風濕疾病等有重要作用。在很多領(lǐng)域特別是疑難病癥上，基因工程制品起到了傳統(tǒng)化學(xué)藥物難以達到的作用。中國生物醫(yī)藥市場將成為僅次于美國的全球第二大生物醫(yī)藥市場，預(yù)計在10年創(chuàng)新發(fā)展的基礎(chǔ)上，基因工程疫苗行業(yè)將迎來最佳時期。同時，基因工程疫苗的產(chǎn)業(yè)化也面臨不小的挑戰(zhàn)。由于在規(guī)?；矫嬷袊L期以來以仿制為主，沒有形成具有技術(shù)優(yōu)勢的領(lǐng)域，不能發(fā)揮技術(shù)的累積效應(yīng)，制約了具有自主知識產(chǎn)權(quán)的產(chǎn)品的研發(fā)。因此，面對國際新藥研發(fā)的過程細化精準，擁有自主知識產(chǎn)權(quán)，并依托研發(fā)產(chǎn)品的創(chuàng)新性平臺技術(shù)是基因工程疫苗規(guī)模化生產(chǎn)的重中之重。平臺技術(shù)的延續(xù)性和創(chuàng)新性將為更多基因工程疫苗的開發(fā)提供更廣闊的發(fā)展空間。

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Large-scale production processes and technologies of human vaccines

YU Xiaohui1，LI Qiming2，LI Xiuling2，SHEN Rong3，ZHANG Aihua1，ZHANG Yuntao1
1. China National Biological Group, Co., Ltd., Beijing 100029, China 2. Beijing Institute of Biological Products Co., Ltd., Beijing 101111, China 3. Lanzhou Institute of Biological Products Co., Ltd., Lanzhou 730046, China

With the social progress and human health improvement, the production technologies of human vaccines make great progress. China achieved important improvement on the vaccine research and development technologies. This paper expounds currently domestic and abroad situations and future development trend of the production process and technologies of the inactivated viral vaccines, polysaccharide protein conjugate vaccines and large-scale genetic engineering vaccines.

vaccine; large-scale production; process; technology

10.3969/j.issn.1674-0319.2017.02.007

于曉輝，哲學(xué)博士，講師。研究方向：生物醫(yī)學(xué)工程。E-mail：yuxiaohui@sinopharm.com

重大新藥創(chuàng)制科技重大專項（2014ZX09304316）