單增李斯特菌的快速檢測方法研究進(jìn)展

李波+趙文勝++王國柱++馮冠++吳文浩++王丹丹

摘要 單增李斯特菌是一種重要的人獸共患病病原體，其檢測已成為食源性疾病預(yù)防與控制的重點(diǎn)內(nèi)容。單增李斯特菌快速檢測技術(shù)的研究對我國食品安全工作具有極其重要的意義。本文對國內(nèi)外單增李斯特菌的多種快速檢測方法及其檢出限進(jìn)行對比，探討了快速檢測單增李斯特菌在未來的發(fā)展方向。

關(guān)鍵詞 李斯特菌；快速檢測；分子檢測

中圖分類號 S852.6 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-5739（2016）24-0265-03

Research Progress on Rapid Detection and Identification Methods for Listeria Monocytogenes

LI Bo 1，2 ZHAO Wen-sheng 1 WANG Guo-zhu 1 FENG Guan 1 WU Wen-hao 1 WANG Dan-dan 1，2

（1 Yanjiao Office of Hebei Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Yanjiao Hebei 065201； 2 Yanjiao Branch Center of Hebei Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau Inspection and Quarantine Technical Center）

Abstract Listeria monocytogenes is a kind of facultative pathogens of human and animal，its detection and identification has become the focus of prevention and control of food borne diseases.In this paper，rapid detection methods and detection limit of Listeria monocytogenes at home and abroad were compared，and the future development direction of the rapid detection of Listeria monocytogenes was discussed.

Key words Listeria monocytogenes；rapid detection；molecular detection

單增李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）是一種重要的人獸共患病病原體，也是一種最為常見的食源性病原菌，WHO將其列為20世紀(jì)90年代食品中四大致病菌之一。單增李斯特氏菌廣泛存在于肉制品、乳制品、水產(chǎn)品以及土壤中，4 ℃的環(huán)境中仍可生長繁殖，是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一[1]。隨著生活節(jié)奏的加快，快餐食品逐漸受到我國人們的歡迎，單增李斯特菌的危害也隨之而來，因此對李斯特菌的檢測工作尤為重要。傳統(tǒng)的李斯特菌檢測方法繁瑣，耗時(shí)長，靈敏度低，難以滿足市場需求。發(fā)展快速準(zhǔn)確、操作簡便的檢測與鑒定單增李斯特氏菌的方法對于提高食品衛(wèi)生水平、保證食品安全具有重要的意義。

目前，單增李斯特菌的檢測方法中較常用的還是國標(biāo)法[2]。隨著食品檢測技術(shù)的持續(xù)發(fā)展，高靈敏度的單增李斯特菌的快速檢測方法不斷完善，國內(nèi)外對李斯特菌的快速檢測技術(shù)有了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，主要分為免疫學(xué)檢測、分子生物學(xué)檢測，生物傳感器，自動化檢測及聯(lián)合檢測方法?？焖贆z測方法大大提高了檢測的靈敏度，縮短了檢測時(shí)間，成為未來食品檢測主要的發(fā)展方向。

1 免疫學(xué)檢測

免疫學(xué)檢測法是利用抗體與抗原特異性結(jié)合的原理進(jìn)行檢測的方法，抗體與檢測方法的不同，直接影響了單增李斯特菌的檢測限。主要的檢測方法有酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）、酶聯(lián)熒光分析法（ELFA）和免疫磁性分析（IMS）等[3]。

1.1 ELISA法

ELISA法是抗原或抗體與酶形成的酶結(jié)合物與底物反應(yīng)，催化生成帶色產(chǎn)物，根據(jù)顏色深淺進(jìn)行定性定量的檢測方法。應(yīng)用于食品安全檢測的ELISA試驗(yàn)不斷創(chuàng)新，Bhunia等建立的夾心ELISA法在20～24 h檢出限為8～10 cfu/g（mL）[4]。趙 麗等[5]采用單增李斯特菌液相芯片，利用微球偶聯(lián)結(jié)合雙抗夾心技術(shù)測定偶聯(lián)率，檢測限為103 cfu/mL?，F(xiàn)在已有德國拜發(fā)公司生產(chǎn)的商品化的單增李斯特菌檢測試劑盒可供使用，用ELISA方法操作較簡單，特異性強(qiáng)，反應(yīng)靈敏度高，但由于單克隆抗體制備昂貴，所以用ELISA盒進(jìn)行多種食品樣品的檢測費(fèi)用較高。

1.2 ELFA檢測法

ELFA法將熒光標(biāo)記物添加到抗體上，通過測定熒光強(qiáng)度檢測單增李斯特菌的數(shù)量，大大提高了檢測的靈敏度。Jaakohuhta 等[6]利用時(shí)間分辨熒光免疫分析法進(jìn)行污染食品檢測，用時(shí)16 h，靈敏度為20 cfu/mL。Shi L等[7]運(yùn)用測流免疫層析法20 min內(nèi)檢出限為104 cfu/mL，特異性良好。免疫層析試紙條法方法方便，但存在一定的漏檢率，穩(wěn)定性有待進(jìn)一步提高。

1.3 IMS檢測

IMS依據(jù)抗原抗體原理，通過磁珠的富集縮短增菌時(shí)間，降低單增李斯特菌的檢測限。免疫磁珠檢測方法可快速特異地檢測出食品中單增李斯特菌，具有高靈敏度[8]。免疫磁性分離IMBS與PCR和ICG結(jié)合方法15 h測得檢出限為100 cfu/mL[9]。免疫磁珠-選擇性培養(yǎng)基檢測法9 h牛奶樣品檢測限為0.4 cfu/mL[10]。納米磁珠低場磁共振技術(shù)的線性檢測范圍為 1～103 cfu/mL[11]。超順磁免疫層析技術(shù)現(xiàn)已在臨床診斷、食品檢驗(yàn)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，已有104 cfu/mL的靈敏度[12]。目前Matrix生產(chǎn)的Pathatrix快速檢測系統(tǒng)屬于世界最快的檢測方法之一[13]。磁珠的立體結(jié)構(gòu)擴(kuò)大了反應(yīng)面，促使IMS受到各檢測領(lǐng)域的廣泛關(guān)注，但靈敏度還需進(jìn)一步提高。

免疫學(xué)檢測方法具有良好的特異性和重復(fù)性，可同時(shí)對多個(gè)樣品進(jìn)行檢測，實(shí)現(xiàn)檢測自動化，單一的免疫學(xué)檢測方法穩(wěn)定性較差，與免疫學(xué)相結(jié)合的檢測方法有待進(jìn)一步開發(fā)研究。

2 分子生物學(xué)檢測

由于分子生物學(xué)理論和技術(shù)的不斷發(fā)展與成熟，相關(guān)的分子生物學(xué)檢測方法如PCR技術(shù)、核酸探針雜交技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光PCR（Real time-PCR）、多重PCR（M-PCR）及基因芯片等新型技術(shù)在單增李斯特菌的檢測研究中得到廣泛應(yīng)用。

2.1 PCR技術(shù)

PCR檢測是較為傳統(tǒng)的分子生物學(xué)技術(shù)，通過設(shè)計(jì)特異毒力基因和特異性序列的引物，完成單增李斯特菌的檢測工作。常用的幾種靶基因包括hlyA[14]、iap[15]、inlB[16]、inlA[17]，可對多類食品進(jìn)行單增李斯特菌的檢測工作。

在PCR基礎(chǔ)上運(yùn)用新的檢測技術(shù)，可提高檢測效率，縮短檢測時(shí)間。Uyttendaele等[18]以16s rRNA為靶基因設(shè)計(jì)引物，利用核酸序列擴(kuò)增（NASBA）技術(shù)對李斯特菌屬進(jìn)行檢測，具有較高的特異性。有研究者利用環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增（LAMP）檢測技術(shù)[19]對肉制品進(jìn)行檢測。三重LAMP檢測法可在90 min內(nèi)完成檢測，靈敏度為10 fg/μL[20] 。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，與PCR結(jié)合的新技術(shù)在檢測靈敏度上獲得進(jìn)一步的突破。

2.2 核酸探針雜交技術(shù)

核酸探針雜交技術(shù)最早作為分子生物技術(shù)應(yīng)用于單增李斯特菌檢測[21]，通過設(shè)計(jì)特異性探針，以同位素標(biāo)記的方式，根據(jù)DNA雜交原理，檢測李斯特菌。Volokhov等以李斯特的6種毒力蛋白基因?yàn)榘谢蛟O(shè)計(jì)多重PCR，研制出了基因芯片檢測單增李斯特菌，可達(dá)到種的水平[22]。通過寡核苷酸探針合成[23]、探針標(biāo)記、微孔板雜交技術(shù)[24]等方法，可提高檢測效率，但由于探針制備工作復(fù)雜，檢測靈敏度有待提高，在實(shí)際工作中未得到廣泛運(yùn)用。

2.3 Real time-PCR

Real time-PCR是在PCR擴(kuò)增體系中加入熒光標(biāo)記，根據(jù)熒光強(qiáng)度達(dá)到定量檢測的目的，特異性強(qiáng)，靈敏度高，簡單快捷。Real time-PCR技術(shù)可在3 h內(nèi)完成乳制品中單增李斯特菌的檢測，檢測限為660 cfu/mL[25-26]。Rossmanith 等[27]對人工污染的牛奶和三文魚、鵝肝醬、奶酪樣品中單增李斯特菌（prfA）進(jìn)行Q-PCR檢測，檢測限分別為0.3 cfu/mL和 0.07～0.60 cfu/g。閆 琳等[28]與 Rodriquez-Lazaro 等[29]對肉制品和蔬菜等進(jìn)行熒光定量PCR檢測，結(jié)果相似。許華青等[30]對模擬糞便標(biāo)本進(jìn)行雙重Real-time PCR檢測，結(jié)果特異性良好，單增李斯特菌檢測下限為2.45 ×103 cfu/g。有不少研究者通過建立多重Real time-PCR方法檢測海產(chǎn)品等樣品中單增李斯特菌含量，可達(dá)6.5 cfu/mL靈敏度，穩(wěn)定性強(qiáng)[31-32]。劉二龍等[33]設(shè)計(jì)hlyA、inlA 和plcB探針建立的TaqMan-MGB三重Real time-PCR 檢測方法，可將變異系數(shù)控制到1.5%以內(nèi)，靈敏度可達(dá)100 cfu/mL。SureTect 實(shí)時(shí)PCR檢測方法測得相對檢測限在0.02～0.06 cfu/g的樣品，具有較高穩(wěn)定性和特異性[34]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR對引物和探針有嚴(yán)格的要求，需要特定的儀器進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，在基層實(shí)驗(yàn)的應(yīng)用上存在一定的限制。

2.4 M-PCR檢測

M-PCR可以同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)靶基因，從而檢測出食品中的多種致病菌。胡冰雪等[35]根據(jù)熒光假單胞菌的gyrB基因、沙門氏菌的invA基因和單增李斯特菌的hlyA基因，定量檢測肉制品中3種致病菌情況，M-PCR檢測靈敏度分別為9、5、70 cfu/mL。Germini等[36]使用M-PCR檢測液體狀態(tài)蛋樣品中的單增李斯特菌（prfA基因）、沙門氏菌、大腸桿菌，在經(jīng)過15 h增菌后檢測限為0.4 cfu/g。錢云開等[37]利用單增李斯特菌4個(gè)毒力基因（hly、prfA、inlA、inlB）引物，通過多重PCR 擴(kuò)增，經(jīng)變性高效液相色譜（DHPLC）進(jìn)行快速檢測，具有良好的特異性，靈敏度可達(dá)到280 cfu/mL。多重PCR檢測技術(shù)可同時(shí)實(shí)現(xiàn)多菌的檢測特點(diǎn)，使得在引物設(shè)計(jì)工作中難度增大，退火溫度和產(chǎn)物片段等要求需同時(shí)顧及，需要多次進(jìn)行條件優(yōu)化才能得到實(shí)施。

綜上所述，分子生物學(xué)檢測方法具有高靈敏度、特異性強(qiáng)、速度快的特點(diǎn)，大大提高了食品檢測效率，在單增李斯特菌的檢測工作中占有重要地位（表1）。但分子生物學(xué)檢測技術(shù)無法分辨死菌和活菌，引物要求嚴(yán)格，反應(yīng)條件的優(yōu)化直接影響靈敏度和特異性。

3 全自動微生物檢測

微生物鑒定、酶聯(lián)免疫學(xué)、分子生物學(xué)檢測已出現(xiàn)自動化分析系統(tǒng)，如法國的VITEK系列全自動微生物分析系統(tǒng)、杜邦的BAX系統(tǒng)、美國的GDS系統(tǒng)[38]。陳 敏等[39]通過mini VIDAS 及 VITEK-AMS全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)檢測單增李斯特菌，4 d檢測限達(dá)10 cfu/mL。杜邦的Ribo Printer系統(tǒng)是現(xiàn)在唯一可以對所有微生物種類進(jìn)行快速鑒定和分型溯源的全自動微生物基因指紋鑒定系統(tǒng)，檢測工作僅需8 h。隨著食品檢測市場需求的不斷發(fā)展，全自動化檢測系統(tǒng)必然成為全球的研究熱點(diǎn)。

4 聯(lián)合方法檢測

多種檢測方法聯(lián)合檢測致病菌，可彌補(bǔ)單一檢測方法的不足，提高檢測的靈敏度和特異性。IMS與RT-PCR聯(lián)用3.5 h測魚中單增李斯特菌檢出限為10～40 cfu/g[40]。張 賽等[41]通過免疫磁珠與熒光免疫層析相結(jié)合的方法，檢測人工污染樣品和純培養(yǎng)的單增李斯特菌，檢測限為1～4×104 cfu/mL，相對于熒光免疫層析試紙條靈敏度提高了10倍。聯(lián)合檢測體系具有較高穩(wěn)定性和特異性，免疫磁珠與PCR技術(shù)相結(jié)合，為菌體富集和致病菌檢測提供新思路。

5 生物傳感器

生物傳感器是通過待測物與分子識別元件結(jié)合后產(chǎn)生的復(fù)合物輸出的電和光信號進(jìn)行分析檢測。信號轉(zhuǎn)換器的不同，可將生物傳感器分為電化學(xué)式生物傳感器、光學(xué)式生物傳感器等。Radhakrishnan 等[42]用交流阻抗法結(jié)合單抗檢出番茄樣品中單增李斯特菌檢測限為4 cfu/mL。BIAcore-3000 生物傳感器[43] 可在30 min 內(nèi)完成單增李斯特菌檢測工作。Davis 等[44]用絲網(wǎng)印刷碳電極條作一次性安培傳感器，1 h 內(nèi)檢測出藍(lán)莓樣品中的單增李斯特菌，檢測限為 102 cfu/g。石英晶體微天平[45]快速檢測李斯特菌檢測限為107 cells/mL，可多次重復(fù)使用。懸臂梁壓電生物傳感器結(jié)合單增李斯特菌多克隆抗體[46]進(jìn)行牛奶樣品檢測，1 h內(nèi)可測得樣品檢測限為102 cells/mL。劉金華等[47]應(yīng)用光纖倏逝波生物傳感器檢測單增李斯特菌，靈敏度達(dá)30 cfu/mL。Paul 等制備的表面等離子體免疫傳感器，檢測食品中的單增李斯特菌檢測限為 105 cfu/mL[48]。生物傳感器檢測方法可將檢測時(shí)間縮短到24 h 以內(nèi)，但是測得的樣品檢測限較高，具有高靈敏度的生物傳感器有待開發(fā)研究。

6 結(jié)語

食品工業(yè)的快速發(fā)展要求食品檢測技術(shù)與時(shí)俱進(jìn)，但目前應(yīng)用于食品工業(yè)檢測的方法并不多，且存在很多不足，無法滿足市場需求。致病菌的檢測技術(shù)主要圍繞檢測時(shí)間、檢出限、特異性進(jìn)行評價(jià)，目前免疫學(xué)方法和分子生物學(xué)方法是李斯特菌檢測的重要發(fā)展方向，但不同的檢測方法存在一定的缺陷，如何在保證特異性和穩(wěn)定性的基礎(chǔ)上加快檢測時(shí)間，提高靈敏度，降低檢測限應(yīng)成為所有研究人員重點(diǎn)考慮的問題。在免疫檢測或PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用其他檢測技術(shù)，可明顯提高檢測靈敏度，降低檢測限，縮短檢測時(shí)間，增強(qiáng)特異性。因此，聯(lián)合檢測技術(shù)將成為單增李斯特菌的重要發(fā)展方向?；谑称沸袠I(yè)發(fā)展現(xiàn)狀，快速檢測技術(shù)還需標(biāo)準(zhǔn)化之后進(jìn)行廣泛推廣應(yīng)用，才能促進(jìn)食品檢測行業(yè)的平穩(wěn)發(fā)展[49-54]。

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