豬苓菌核2種熱激蛋白基因的克隆及其表達分析

劉蒙蒙+邢詠梅+郭順星

[摘要] 該研究采用 RT-PCR技術(shù)從中國野生豬苓菌核Polyporus umbellatus中克隆得到 2種熱激蛋白基因，其中PuHsp90基因的開放閱讀框2 091 bp，編碼696個氨基酸，推導的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量約78.9 kDa；PuHsp70基因的開放閱讀框 1 944 bp，編碼647個氨基酸，推導的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量約70.5 kDa；蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測及同源比對分析表明，這2個基因編碼的核苷酸序分別具有Hsp90，Hsp70蛋白的保守結(jié)構(gòu)域。進化樹分析表明，PuHsp90與變色栓菌Hsp90 聚為一類，PuHsp70與肝色牛排菌Hsp70聚為一類。qRT-PCR 分析表明，蜜環(huán)菌侵染的情況下，這2個基因在豬苓菌核中均上調(diào)表達。這2個基因在蜜環(huán)菌侵染豬苓菌核的狀態(tài)下有相同的表達模式，預(yù)示這2個基因其可能在抗生物脅迫中起重要作用。

[關(guān)鍵詞] 豬苓；熱休克蛋白；基因克?。槐磉_分析

[Abstract] With RT-PCR approaches，the full-length cDNA of two heat shock protein genes were cloned from total RNA of the Polyporus umbellatus sclerotium. The full open reading frame cDNA sequence of the Hsp90 was 2 091 bp，encoding 696 amino acid residues with a predicted molecular mass of 78.9 kDa. The full open reading frame cDNA sequence of the Hsp70 was 1 944 bp，encoding 647 amino acid residues with a predicted molecular mass of 70.5 kDa. The Hsp90 and Hsp70 protein contained the conservative structure domain，respectively. Phylogenetic analysis showed that Hsp90 and Hsp90 from Trametes versicolor were clustered into one group，Hsp70 and Hsp70 from Fistulina hepatica were clustered into one group. Real-time PCR analysis showed that，the expression of Hsp90 and Hsp70 in the infected part by Amillariella mellea was upregulated. The expression profiling of Hsp90 and Hsp70 showed same patterns underbiotic stress. The results indicate that these two genes may play an important role in response to Amillariella mellea infection.

[Key words] Polyporus umbellatus；heat shock protein；gene clone；gene expression

doi：10.4268/cjcmm20162411

熱激蛋白（heat shock proteins，簡稱Hsp）是在生物體遇到高溫、高鹽、干旱、營養(yǎng)缺乏、重金屬離子等非生物脅迫下應(yīng)激合成的蛋白，它的主要功能之一是通過與非蛋白質(zhì)互相作用來預(yù)防未折疊蛋白變性和調(diào)節(jié)變性蛋白溶解復性[1-4]。溫度變化是誘導Hsp合成的主要因子[5]。熱休克蛋白廣泛存在于從低等的原核生物到高等動植物各等種生物體內(nèi)[6]，根據(jù)相對分子質(zhì)量的不同，可將熱激蛋白分為Hsp110s，Hsp90s，Hsp70s，Hsp60s，小分子sHsps和泛素蛋白這6個家族[7]。其中，Hsp90蛋白可與其他分子伴侶共同調(diào)節(jié)參與各類非生物脅迫應(yīng)激，如高熱、干旱、高鹽、有機物污染脅迫等[8]。Hsp70家族的功能研究的最為清楚，它參與了生物體的許多代謝調(diào)控[9]。有趣的是，Hsp70與植物抵抗病害關(guān)系密切。但是Hsp90與Hsp70在其他物種尤其是真菌中的功能研究報道迄今還很少。

豬苓是我國重要的藥用真菌資源，其菌核是有效的藥用部位。豬苓菌核在生長過程中會與蜜環(huán)菌形成特殊的共生關(guān)系。蜜環(huán)菌菌索侵入豬苓菌核，為其提供生長發(fā)育所必須的營養(yǎng)元素。蜜環(huán)菌通過豬苓菌核表皮侵染菌核時，菌核表皮下層的菌絲具有特異的拮抗性反應(yīng)[10]。到目前為止，豬苓菌核的拮抗分子機制研究尚屬空白。研究和揭示Hsp70及Hsp90基因在豬苓菌核抗逆反應(yīng)中的作用，對豬苓菌核的防御反應(yīng)分子機制的研究提供重要參考，同時對豐富Hsp功能研究奠定基礎(chǔ)。

在研究室前期構(gòu)建豬苓菌核的轉(zhuǎn)錄組文庫中發(fā)現(xiàn)2個特異表達的熱休克蛋白基因的全長開放讀碼框。本研究中應(yīng)用RT-PCR技術(shù)從豬苓菌核中分離得到2種熱休克蛋白基因的開放讀碼框全長序列，并就這2個基因的結(jié)構(gòu)特征和功能進行初步分析，并應(yīng)用實時熒光定量PCR技術(shù)分別對蜜環(huán)菌侵入菌核后這兩個基因的表達模式進行了檢測，以期為這兩個基因在豬苓菌核抵抗蜜環(huán)菌侵染過程中的分子機理研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料

豬苓菌核于2014年7月在山西省古縣豬苓場采集，分別切取豬苓菌核被蜜環(huán)菌侵染的部分（CT）與未被侵染的部分（CK）放入液氮中速凍（圖1），之后放入干冰中保存，運回實驗室待提RNA。每個樣品采集3個重復。

2 方法

2.1 總RNA提取及檢測 應(yīng)用EASYspin Plus 植物RNA快速提取試劑盒（艾德萊，中國）并按照操作說明提取各樣品RNA，用分光光度計測定總RNA的A₂₆₀，A₂₈₀，根據(jù)A₂₆₀/A₂₈₀≈2.0 判斷 RNA 的質(zhì)量，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測 RNA 的完整性。以O(shè)ligo d（T）₁₈為反轉(zhuǎn)錄引物，用 M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒（Promega，USA）合成cDNA 第一鏈，放于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 基因克隆 在本課題組測得的豬苓轉(zhuǎn)錄組文庫中檢索到2個熱休克蛋白基因的全長unigene序列，利用引物設(shè)計軟件Primer5分別從起始密碼子與終止密碼子開始設(shè)計2對引物（表1），用RT-PCR方法從豬苓菌核中克隆這2個基因的全長開放讀碼框。以合成的豬苓cDNA為模板，加入ExTaq聚合酶反應(yīng)緩沖液5 μL（含Mg²⁺），正、反向引物各1 μL（10 mmol·L^-1），dNTP 4 μL（2.5 mmol·L^-1），ExTaq聚合酶0.25 μL（10 U·μL^-1），加ddH₂O至50 μL，輕微渦旋混勻并離心（1 000 r·min^-1，10 s）后進行PCR擴增。反應(yīng)程序為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，40個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)回收純化后連接Zero Background pTOPO-Blunt Simple Cloning Kit （艾德萊，中國），進一步轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌 DH5α中，挑取任意菌落進行擴大培養(yǎng)重組質(zhì)粒，抽提質(zhì)粒DNA，由江蘇金唯智公司進行序列測定。獲得測序結(jié)果后用Bioeditor與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果進行比對，并通過GenBank進行 BLAST 搜索比對。

2.3 基因生物信息學分析 這2個基因的核苷酸序列和推導的氨基酸序列分別在NCBI 網(wǎng)站（http：//www.ncbi.nim.nih.gov/）進行核苷酸序列比對（BLASTn）、氨基酸序列比對（BLASTp）和保守域預(yù)測（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml）；利用ClustalW2（http：//www.ebi.ac.uk /Tools /msa /clustalw2/）軟件對其氨基酸序列進行比對；利用MEGA6 軟件采用鄰近法（N-J法）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹；用ProtParam程序（http：//au.expasy.org/tools/protparam.html）預(yù)測該氨基酸序列的相對分子質(zhì)量和理論等電點（pI）；利用SignalP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）在線分析蛋白質(zhì)的信號肽。

2.4 基因表達分析 利用在線引物設(shè)計軟件primer3（http：//bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/）設(shè)計熒光定量PCR引物 （表2），利用實時熒光定量 PCR 方法分析2種熱休克蛋白基因在豬苓菌核不同部位的表達量，qPCR分析以豬苓 β-tublin基因作為內(nèi)參基因。qRT-PCR 反應(yīng)采用專用熒光檢測管在 C1000 Thermal Cycler 熒光定量 PCR 儀（BioRad公司）上進行。每個反應(yīng)重復 3 次，實驗重復 3 次。20 μL 反應(yīng)體系中包括 9 μL 2.5×SYBR Green mix，9 μL ddH₂O，1 μL cDNA，1 μL 引物混合物（正向引物和反向引物，10 μmol·L^-1）。反應(yīng)程序為：95 ℃ 3 min，95 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，循環(huán) 40 次，65 ℃ 30 s，95 ℃后保溫 1 min，反應(yīng)結(jié)束后采集C （cycle threshold） 值，采用2^-ΔΔCt法進行數(shù)據(jù)分析[11]。

3 結(jié)果

3.1 豬苓2個熱休克蛋白基因的克隆 以未被蜜環(huán)菌侵染的豬苓菌核的RNA所反轉(zhuǎn)錄的 cDNA 為模板，利用表1中的2對引物通過RT-PCR 方法得到相應(yīng)的2個熱休克蛋白基因的目的片段（圖2），目的片段經(jīng)膠回收、克隆、測序分析后得到完整的ORF序列。與轉(zhuǎn)錄組文庫中的序列比對后，發(fā)現(xiàn)其與文庫中的unigene序列的ORF區(qū)一致，進而驗證分離得到的這2個熱休克蛋白基因的全長讀碼框序列是正確。其中PuHSP90基因的開放讀碼框為2 091 bp，PuHSP70基因的開放讀碼框為1 944 bp。

3.2 豬苓2個熱休克蛋白基因編碼蛋白的序列分析 ProtParam程序預(yù)測PuHSP90基因編碼氨基酸序列相對分子質(zhì)量為78.9 kDa，理論pI4.91。推測該蛋白分子式為C₃₅₂₂H₅₆₀₇N₉₀₅O₁₁₀₉S₁₈。核苷酸序列比對結(jié)果分析表明，該基因的核苷酸序列與變色栓菌Trametes versicolor同源性為91%，與肝色牛排菌Fistulina hepatica同源性為88%，將推測的氨基酸序列提交到 NCBI 的保守域數(shù)據(jù)庫（conserved domain database，CDD）進行搜索，部分結(jié)果（圖3）。結(jié)果顯示該基因的核苷酸序具有Hsp90的保守結(jié)構(gòu)域。推測克隆的該基因為豬苓菌核的 Hsp90 基因。NCBI登陸號為KU179150，用SignalP 4.1 Server 檢測不含信號肽序列，無分泌蛋白。信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)分析表明，該 Hsp90蛋白N 端無信號肽，且整條肽鏈位于細胞膜外，也無跨膜結(jié)構(gòu)。

ProtParam程序預(yù)測PuHSP70基因編碼氨基酸序列相對分子質(zhì)量為70.5 kDa，理論pI 5.02。推測該蛋白分子式為C₃₀₉₇H₄₉₃₈N₈₅₆O₉₉₇S₁₃。核苷酸序列比對結(jié)果分析表明，該基因的核苷酸序列與毛韌革菌Stereum hirsutum同源性為91%，與污叉絲孔菌Dichomitus squalens同源性為 90%，將推測的氨基酸序列提交到NCBI的保守域數(shù)據(jù)庫（Conserved Domain Database，CDD）進行搜索，部分結(jié)果（圖4）。結(jié)果顯示該基因的核苷酸序具有Hsp70的保守結(jié)構(gòu)域。推測克隆的該基因為豬苓菌核的Hsp70基因。NCBI登陸號為：KU179151，用SignalP 4.1 Server檢測不含信號肽序列，無分泌蛋白。同樣信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)分析表明，該Hsp70蛋白N 端無信號肽，且整條肽鏈位于細胞膜外，也無跨膜結(jié)構(gòu)。

3.3 2個熱休克蛋白同源序列比對和系統(tǒng)進化分析 利用Clustal W2軟件將豬苓的PuHsp90與其他真菌Hsp90氨基酸序列比對表明，該PuHsp90基因編碼的蛋白與肝色牛排菌Fistulina hepatica、變色栓菌Trametes versicolor等多種真菌的Hsp90高度同源，其中與肝色牛排菌（登錄號KIY50993）氨基酸序列同源性高達 92.1%，與變色栓菌（登錄號EIW51690）氨基酸序列同源性高達91.56%；同樣將PuHsp70與其他真菌的Hsp70氨基酸序列比對表明，該PuHsp70基因與Punctularia strigosozonata、毛韌革菌Stereum hirsutum等多種真菌的Hsp70高度同源，其中與P. strigosozonata（登錄號EIN07501）氨基酸序列同源性高達93%，與毛韌革菌（登錄號EIM90125）氨基酸序列同源性高達90.2%，與肝色牛排菌F. hepatica（登錄號KIY50928）氨基酸序列同源性高達92%。充分說明真菌體內(nèi)Hsp90及Hsp70的高度保守性。從氨基酸序列系統(tǒng)進化樹（圖5）可以得出，Hsp90基因與變色栓菌T. versicolor Hsp90親緣關(guān)系最近，與肝色牛排菌F. hepatica Hsp90親緣關(guān)系較遠；Hsp70基因與肝色牛排菌F. hepatica Hsp70親緣關(guān)系最近，與毛韌革菌S. hirsutum Hsp70親緣關(guān)系較遠。

3.4 豬苓熱休克蛋白表達特性分析 實時熒光定量 PCR 數(shù)據(jù)顯示，豬苓菌核β-tublin基因在各個樣品中表達量比較穩(wěn)定，可作為內(nèi)參基因。實時熒光定量 PCR 分析表明，豬苓菌核不同部位的這2種熱休克蛋白基因均有表達。在蜜環(huán)菌侵染的部位，這2種基因均為表達上調(diào)：其中PuHsp90，PuHsp70在蜜環(huán)菌侵染發(fā)部分的轉(zhuǎn)錄水平分別是未侵染部位的13，16倍左右（圖6）。

4 討論

本研究采用RT-PCR方法從豬苓菌核中克隆得到2個新的豬苓熱休克蛋白基因，即PuHsp70，PuHsp90，這2個基因具有Hsp70，Hsp90家族基因的保守結(jié)構(gòu)域。序列分析表明，這2個熱休克蛋白基因編碼的蛋白與NCBI中已有的擔子菌的熱休克蛋白序列有較大的相似性，說明這2個熱休克蛋白基因隸屬于擔子菌。

大量植物抗逆轉(zhuǎn)錄組學研究表明，植物受到不同生物脅迫或非生物脅迫后許多抗逆基因的轉(zhuǎn)錄被激活。Hsp90與Hsp70與植物抵抗病害有密切關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)沉默本氏煙草的胞質(zhì)HSP70，其會植株表現(xiàn)矮??；在INF-1 蛋白和假單胞桿菌侵染后均無拮抗反應(yīng)發(fā)生；植株對假單胞桿菌的抗性減弱；其體內(nèi)與發(fā)病機制相關(guān)的蛋白基因表達水平減弱。這說明煙草胞質(zhì)HSP70 是INF-1 介導的敏感應(yīng)答和對假單胞桿菌非宿主抗性產(chǎn)生的重要組分，在植物拮抗信號傳導中扮演重要角色[12]。另有研究認為在擬南芥中，其胞質(zhì)HSC70和核HSC70可與SGT1 的相互作用，完成對擬南芥的免疫應(yīng)答的調(diào)控，植株受病原菌侵染后，擬南芥HSC70 的2個亞型表達均顯著上調(diào)，缺失胞質(zhì)HSC70的植株喪失了對病原菌的免疫能力[13]。Hsp90不僅能調(diào)控植物的生長發(fā)育，而且也參與植物的防御反應(yīng)，在小麥中發(fā)現(xiàn)了3種定位于細胞質(zhì)的HSP90蛋白，在TaHsp90.1的缺乏的情況下，小麥秧苗生長會受到抑制，而TaHsp90.2 與TaHsp90.3則參與小麥抗條銹病[14]。本研究中，在蜜環(huán)菌侵入豬苓菌核后，PuHsp90及PuHsp70基因在轉(zhuǎn)錄水平表達急劇上升，表明這2個基因在豬苓菌核防御蜜環(huán)菌侵染的應(yīng)激過程中起到了一定的調(diào)節(jié)作用。

豬苓菌核熱激蛋白基因應(yīng)對蜜環(huán)菌侵染脅迫表達模式的研究為豬苓對抗逆境時內(nèi)在基因表達的變化提供了一個線索，作為分子伴侶的 Hsp90 參與了許多蛋白的激活和運輸?shù)冗^程，從而參與生物體的抗逆過程。Hsp70蛋白在生物體內(nèi)主要起分子伴侶作用，參與新生肽鏈的折疊、損傷蛋白的降解，還負責某些前體蛋白向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的轉(zhuǎn)運[15]，多數(shù)研究證明 Hsp70 的過表達可以提高生物對病害的耐受性[16]。Hsp90與Hsp70 作為生物體響應(yīng)外源性病原菌的一個因子，其在應(yīng)激網(wǎng)絡(luò)上的作用（如與熱激轉(zhuǎn)錄因子如何互相作用增強生物抗逆性）等有待于進一步研究。

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[責任編輯 呂冬梅]