槲皮素對(duì)軟脂酸誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞eNOS合成的影響

由繼君　趙丹玉

[摘要] 目的 研究槲皮素對(duì)軟脂酸誘導(dǎo)EA.hy926細(xì)胞eNOS合成的影響。 方法 體外培養(yǎng)EA.hy926細(xì)胞，分正常對(duì)照組、模型組、槲皮素組、二甲雙胍組，采用RT-PCR法及免疫組化法，測(cè)定各組細(xì)胞 eNOS mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果模型組細(xì)胞eNOS mRNA和蛋白表達(dá)顯著低于正常對(duì)照組（P<0.05），藥物組與模型組相比eNOS mRNA及蛋白表達(dá)顯著增加（P<0.05），藥物組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 槲皮素對(duì)軟脂酸誘導(dǎo)EA.hy926細(xì)胞eNOS合成具有顯著促進(jìn)作用。

[關(guān)鍵詞] 槲皮素；eNOS；胰島素抵抗

[中圖分類號(hào)] R285 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1672-4062（2016）12（a）-0001-04

[Abstract] Objective To study the effect of EA.hy926 cells induced by quercetin and eNOS on the synthesis of palmitic acid. Methods EA.hy926 cells were cultured in vitro. Normal control group， model group， quercetin group， metformin group， using RT-PCR method and immunohistochemical method， the expression of mRNA eNOS and protein in each group were determined. Results The cells in the model group of eNOS mRNA and protein expression was significantly lower than that of the normal control group（P < 0.05） and drug treatment group and model group compared eNOS mRNA and protein expression was significantly increased（P < 0.05）， drug group no significant difference（P > 0.05）. Conclusion Quercetin has significant promoting effect on palmitic acid induced EA.hy926 cell eNOS synthesis.

[Key words] Quercetin；eNOS；Insulin resistance

2型糖尿病是由于遺傳和環(huán)境因素共同作用，互為因果而引起的一種常見的嚴(yán)重影響人類健康的慢性復(fù)雜性疾病[1]。胰島素抵抗（insulin resistance，IR）是2型糖尿病的主要發(fā)病機(jī)制。相關(guān)研究顯示，IR的發(fā)生，與血管內(nèi)皮細(xì)胞的胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙關(guān)系密切[2-3]。其中內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）起重要的調(diào)節(jié)作用，可促進(jìn)血管舒張因子一氧化氮（NO）的釋放[4]。該實(shí)驗(yàn)通過體外高濃度軟脂酸誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株（EA.hy926細(xì)胞），建立IR的血管內(nèi)皮細(xì)胞模型，研究槲皮素對(duì)IR狀態(tài)EA.hy926細(xì)胞中eNOS mRNA 和蛋白表達(dá)的影響。

1 臨床資料

1.1 細(xì)胞

人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞EA.hy926細(xì)胞，購自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.2 主要藥物及試劑

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶、兔抗人eNOS一抗抗體、羊抗兔IgG二抗、PT-PCR試劑盒、槲皮素（MUST-12072505）、 二甲雙胍。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，傳代后生長(zhǎng)狀態(tài)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，分裝到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)備用。

2.2 制備

配制0.1 mmol/L軟脂酸鈉溶液 稱0.04 g NaOH加入10 mL蒸餾水制成0.1 mmol/L的NaOH溶液，再稱取0.025 6 g軟脂酸與NaOH溶液混合，70℃水浴。將0.1 mmol/L軟脂酸鈉溶液溶于5%牛血清白蛋白9∶1混合后，37℃水浴1 h，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 實(shí)驗(yàn)分組

將體外培養(yǎng)的EA.hy926細(xì)胞按5×105/mL密度接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、槲皮素組及二甲雙胍組。各組分別加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基和終濃度為50 nmol/L的胰島素。除正常對(duì)照組外，各組分別加入終濃度為600 μmol/L的軟脂酸。根據(jù)該實(shí)驗(yàn)前期研究結(jié)果，槲皮素組加入終濃度25 mg/L的槲皮素，二甲雙胍組加入終濃度為2 mmol/L的二甲雙胍。

2.4 RT-PCR測(cè)定各組細(xì)胞eNOS mRNA的表達(dá)

各組細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)處理后，收集細(xì)胞，提取總RNA并測(cè)定濃度。按RT-PCR反應(yīng)試劑盒說明進(jìn)行操作，上游引物序列：5'-GACATTGAGAGCAAAGGGCTG-3'，下游引物序列：5'-CGGCTTGTCACCTCCTGG-3'，擴(kuò)增片斷大小408bp；β-actin上游引物序列：5'-ACACGAAA GCAATGCTATCACCTC-3'，下游引物序列：5'-TGACAG CAGTCGGTTGGAGCGA-3'，擴(kuò)增片斷大小153bp。退火溫度為65℃。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果用凝膠電泳儀進(jìn)行分析，測(cè)各組IOD值，以各組基因條帶吸光度與內(nèi)參β-actin條帶吸光度的比值來表示eNOS mRNA表達(dá)的強(qiáng)弱。

2.5 免疫組化測(cè)各組細(xì)胞eNOS的蛋白表達(dá)

將細(xì)胞接種于24孔板中，各組加藥處理后，4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗3遍。進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)膜后，PBS洗3遍。在加3%H2O2滅活內(nèi)源性酶15 min，PBS洗3遍，滴入封閉液，室溫20 min后吸出，各組分別加入雙抗。DAB顯色，倒置顯微鏡下觀察拍照。采用醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)測(cè)定平均光密度值每組測(cè)6個(gè)不同視野取均值作為該組測(cè)定值。

2.6 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，進(jìn)行單因素方差分析，兩兩比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組EA.hy926細(xì)胞eNOS mRNA的表達(dá)

RT-PCR結(jié)果，與正常組相比，模型組細(xì)胞eNOS mRNA表達(dá)顯著減少。槲皮素組、二甲雙胍組與模型組相比eNOS mRNA 表達(dá)顯著增加。藥物組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖1、圖2及表1。

3.2 免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

正常對(duì)照組可見大量的eNOS 陽性表達(dá)細(xì)胞，與正常對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞eNOS 蛋白陽性表達(dá)顯著減少，藥物組可見大量eNOS 陽性表達(dá)細(xì)胞，與模型組相比表達(dá)顯著增加。見圖3及表2。

4 討論

血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的胰島素受體與血液中的胰島素結(jié)合后，將胰島素受體底物2（IRS2）磷酸化，IRS2進(jìn)一步激活磷脂酰肌醇3激酶（PI3K），后者激活下游蛋白激酶B（PKB，也稱作Akt）等，Akt能激活eNOS，使其磷酸化從而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，活化的eNOS能催化合成NO[5]。IRS2/eNOS信號(hào)途徑的激活增加了NO的合成，提高了毛細(xì)血管的通透性，促進(jìn)胰島素從血液進(jìn)入組織，產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)，達(dá)到降低血糖的作用。NO是心血管內(nèi)重要的舒張調(diào)節(jié)因子，起著調(diào)節(jié)血管舒張功能，保護(hù)血管的作用?？梢种蒲“寰奂|(zhì)過氧化等[6]。NO由一氧化氮合酶催化產(chǎn)生，相關(guān)研究顯示eNOS合成異常時(shí)，NO合成減少，血管內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)功能障礙，使靶細(xì)胞對(duì)胰島素的攝取、利用降低， 從而引起IR發(fā)生[7]。該實(shí)驗(yàn)通過體外培養(yǎng)EA.hy 926細(xì)胞，加入高濃度軟脂酸在培養(yǎng)基中，以建立高脂狀態(tài)下IR的血管內(nèi)皮細(xì)胞模型，并用槲皮素進(jìn)行干預(yù)，研究在IR狀態(tài)下血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)eNOS信號(hào)通路的變化，試闡明2型糖尿病的部分機(jī)制，以及槲皮素的作用機(jī)制，為胰島素抵抗的治療尋求新的靶點(diǎn)。

隨著雙胍類、磺酰脲類、α-糖苷酶抑制劑等治療藥物的廣泛應(yīng)用，糖尿病的藥物治療取得了迅速發(fā)展，但許多方案仍不理想，不能有效穩(wěn)定的控制糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生[8]，中醫(yī)中藥的研發(fā)利用已成為當(dāng)代醫(yī)家學(xué)者面臨的重要課題。槲皮素是一種具有多種生物活性的黃酮類化合物，其廣泛存在于自然界，相關(guān)報(bào)道顯示槲皮素具有抗氧化，抗血小板聚集，抗抑郁、調(diào)節(jié)血糖的作用[9]。槲皮素通過抗炎、抗氧化的功能可減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，有效改善IR，以達(dá)到預(yù)防和限制糖尿病及其并發(fā)癥發(fā)生及發(fā)展。該實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，與正常對(duì)照組比，模型組細(xì)胞的eNOS mRNA及蛋白表達(dá)均顯著下降，說明在高濃度軟脂酸誘導(dǎo)作用下，血管內(nèi)皮細(xì)胞eNOS的表達(dá)受到抑制，可以減少血管內(nèi)皮細(xì)胞NO的釋放，降低NO的生物學(xué)效應(yīng)，使胰島素通過血管內(nèi)皮屏障與靶細(xì)胞作用受阻，影響血管的通透性，與以往研究結(jié)果一致[10]。槲皮素組與二甲雙胍組細(xì)胞的eNOS mRNA 及蛋白表達(dá)均顯著提高，說明槲皮素與二甲雙胍能增強(qiáng)IR狀態(tài)下血管內(nèi)皮細(xì)胞eNOS mRNA 及蛋白表達(dá)，提高了血管內(nèi)皮細(xì)胞NO生成，從而改善血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性，促進(jìn)胰島素發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。槲皮素與二甲雙胍的作用差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但槲皮素不良反應(yīng)小，藥理作用廣泛，對(duì)糖尿病并發(fā)癥療效顯著，具有廣泛的開發(fā)前景。該實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步從分子生物學(xué)水平研究槲皮素改善IR的機(jī)制，觀察了槲皮素對(duì)EA.hy926細(xì)胞的保護(hù)作用，為中醫(yī)中藥開發(fā)研制治療IR的臨床用藥奠定一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2016-09-15）