海拔對(duì)桃兒七果實(shí)特性、活性成分含量及抗氧化能力的影響

栗孟飛，姚園園，丁耀錄，葛莉，曹小路，黎潔，楊德龍* (.甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州730070；.甘肅省甘南藏族自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，甘肅 合作 747000)

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海拔對(duì)桃兒七果實(shí)特性、活性成分含量及抗氧化能力的影響

栗孟飛1，姚園園1，丁耀錄2，葛莉1，曹小路1，黎潔1，楊德龍1*
(1.甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州730070；2.甘肅省甘南藏族自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，甘肅 合作 747000)

為了探明海拔對(duì)桃兒七果實(shí)特性以及活性成分積累的影響，更好地保護(hù)和利用桃兒七野生資源，本研究以不同海拔(2400～2500 m和2900～3000 m)的野生桃兒七果實(shí)為材料，分別對(duì)果實(shí)特性、活性物質(zhì)含量以及抗氧化能力進(jìn)行了測(cè)定與分析。結(jié)果表明，海拔對(duì)桃兒七果實(shí)特性、活性成分積累以及組織間的差異性具有顯著影響。低海拔果實(shí)開花期至成熟期的天數(shù)為111 d，較高海拔延長(zhǎng)5 d，成熟期較高海拔提前13 d，低海拔果實(shí)的縱徑、橫徑、干重、種子數(shù)量和千粒干重均高于高海拔，而縱橫比則相反；低海拔果皮和果肉中可溶性糖、總黃酮和酚類化合物的含量分別顯著高于高海拔；低海拔果皮70%和10%乙醇提取液的抑制率、鐵離子還原/氧化能力(FRAP值)以及果肉70%乙醇提取液的FRAP值分別顯著大于高海拔。同一海拔不同組織而言，果肉中可溶性糖的含量顯著高于果皮，總黃酮和酚類含量則相反；在低海拔地區(qū)，果皮70%和10%乙醇提取液的抑制率和FRAP值分別顯著大于果肉，而在高海拔地區(qū)，僅果皮70%乙醇提取液的FRAP值顯著大于果肉。因此，較低海拔有利于桃兒七果實(shí)的生長(zhǎng)與發(fā)育以及果實(shí)中可溶性糖、總黃酮和酚類化合物等活性物質(zhì)的積累。

桃兒七；海拔；果實(shí)特性；可溶性糖；總黃酮；總酚類；抗氧化能力

桃兒七(Podophyllumhexandrum)為小檗科(Berberidaceae)桃兒七屬(Sinopodophyllum)多年生草本植物，在我國(guó)主要分布于甘肅、青海、陜西、云南、四川和西藏等地區(qū)，通常分布于海拔1500～4300 m高山草叢或林邊[1]。桃兒七根莖中含有大量而獨(dú)特的化學(xué)成分——鬼臼毒素(podophyllotoxin)，其衍生物具有顯著的抗癌、抗腫瘤和抗病毒活性，已廣泛應(yīng)用于臨床，市場(chǎng)的需求使得野生資源過度被采挖，目前已面臨瀕危[2-3]。桃兒七成熟干燥果實(shí)，原名小葉蓮，為傳統(tǒng)藏藥，具有調(diào)經(jīng)活血功能，可用于血瘀經(jīng)閉，難產(chǎn)，死胎等[4]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，桃兒七果實(shí)也具有較好的抗癌、抗腫瘤作用[5-7]。

研究發(fā)現(xiàn)，桃兒七干燥果實(shí)中含有鬼臼毒素、去氧鬼臼毒素(desoxypodophyllotoxin7)、4′-去甲去氧鬼臼毒素(4′-demethyldesoxypodophyllotoxin)、8,2′-二異戊烯基-槲皮素-3-甲醚(8,2′-diprenylquercetin 3-methyl ether)、8-異戊烯基山奈酚(8-prenylkaempferol)、槲皮素(quercetin)、山奈酚(kaempferol)、蘆丁(rutin)、β-谷甾醇(β-sitosterol)、胡蘿卜甾醇(daucosterol)、檸檬酚(citrusinol)等有機(jī)化合物[4,7-8]。到目前為止，國(guó)內(nèi)外對(duì)桃兒七化學(xué)成分、藥理學(xué)作用以及鬼臼毒素生物合成等方面進(jìn)行了大量研究[9-10]，而就海拔對(duì)桃兒七果實(shí)特性以及活性成分積累影響等方面的研究報(bào)道較少。為此，本研究就不同海拔桃兒七果實(shí)特性(成熟期、縱橫徑和干重等)、主要活性物質(zhì)(可溶性糖、總黃酮類和酚類)含量以及抗氧化能力進(jìn)行了測(cè)定與分析，旨在為保護(hù)和利用桃兒七野生資源提供理論基礎(chǔ)與依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以甘肅省渭源縣蓮峰鎮(zhèn)(海拔2400～2500 m, 104°04′52″-104°09′1″ E, 34°58′8″-34°59′36″ N)和夏河縣博拉鄉(xiāng)(海拔2900～3000 m, 102°53′12″-102°55′46″ E, 34°42′22″-34°43′40″ N)兩個(gè)地區(qū)的野生桃兒七成熟和完整果實(shí)為試驗(yàn)材料；渭源縣蓮峰鎮(zhèn)成熟果實(shí)于2015年8月20日采集，夏河縣博拉鄉(xiāng)成熟果實(shí)于2015年9月2日采集；將成熟果實(shí)剝離分為果皮、果肉和種子三部分，果皮和果肉陰干后用于活性物質(zhì)和抗氧化能力測(cè)定。

1.2 測(cè)定方法及項(xiàng)目

1.2.1 提取液的制備 取陰干的果皮和果肉，研碎后過0.177 mm篩，準(zhǔn)確稱取0.50 g粉末，分別置于20 mL 10%和70%乙醇具塞三角瓶中，室溫、黑暗、120 r/min旋轉(zhuǎn)振蕩提取3 d；然后在4 ℃、5000 r/min條件下離心10 min；收集上清液，分別用10%和70%乙醇定容至25 mL，獲得提取液25 mL，用于可溶性糖、總黃酮、總酚類以及抗氧化能力測(cè)定。

1.2.2 可溶性糖含量的測(cè)定 采用硫酸—苯酚法測(cè)可溶性糖含量，參考Dubois等[11]和康霞等[12]的方法測(cè)定。其中，測(cè)定樣品為1.2.1 中10%乙醇提取液20.0 μL，可溶性糖的含量以蔗糖為標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)定，計(jì)算公式為：

可溶性糖含量(mg/g DW)=(C×V2)/(V1×M×1000)

標(biāo)準(zhǔn)曲線方程C(μg)=90.91A-3.55 (R2=0.990)

式中:C為可溶性糖的量(μg)，V1為測(cè)定樣品溶液的體積(mL)，V2為提取液的體積(mL)，A為樣品溶液的吸光值，M為材料的干物質(zhì)重量(g)。

1.2.3 總黃酮含量的測(cè)定 采用亞硝酸鈉—硝酸鋁—?dú)溲趸c法測(cè)定總黃酮化合物的含量，參考康霞等[12]和Ma等[13]的測(cè)定方法。其中，測(cè)定樣品為1.2.1中70%乙醇提取液400.0 μL，總黃酮化合物的含量以兒茶素(catechin，CE)為標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)定，計(jì)算公式為：

總黃酮含量(mg/g DW)=(C×V2)/(V1×M×1000)

標(biāo)準(zhǔn)曲線方程C(CE μg)=200A-5.80 (R2=0.996)

式中：C為總黃酮的量(μg)，V1為測(cè)定樣品溶液的體積(mL)，V2為提取液的體積(mL)，A為樣品溶液的吸光值，M為材料的干物質(zhì)重量(g)。

1.2.4 總酚類含量的測(cè)定 采用福林酚(Folin-Ciocalteu)試劑法測(cè)定總酚類化合物的含量，參考康霞等[12]和Beato等[14]的測(cè)定方法。其中，測(cè)定樣品為1.2.1中70%乙醇提取液20.0 μL，總酚類化合物的含量以沒食子酸(gallic acid，GAE)為標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)定，計(jì)算公式為：

總酚類含量(mg/g DW)=(C×V2)/(V1×M×1000)

標(biāo)準(zhǔn)曲線方程C(GAE μg)=34.48A+0.72 (R2=0.994)

式中：C為總酚類的量(μg)，V1為測(cè)定樣品溶液的體積(mL)，V2為提取液的體積(mL)，A為樣品溶液的吸光值，M為材料的干物質(zhì)重量(g)。

1.2.5 抗氧化能力的測(cè)定 為了更為準(zhǔn)確、全面地反映提取液的總抗氧化能力，分別采用較為廣泛應(yīng)用的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)和鐵離子還原/氧化能力(ferric reducing/antioxidant power，F(xiàn)RAP)兩種測(cè)定方法。

DPPH法參考Nencini等[15]和Li等[16]的方法測(cè)定。其中，測(cè)定樣品為1.2.1中10%和70%乙醇提取液20.0 μL，以 500 μmol/L 90% 抗壞血酸(Vitamin C，Vc)的甲醇溶液為陽性對(duì)照，計(jì)算公式為：

抑制率(inhibition percentage，I%)=[(A0-A)/A0]×100

式中：A為樣品溶液的吸光值，A0不加樣品溶液的吸光值。

FRAP法參考康霞等[12]、Li等[16]和Benzie等[17]的方法測(cè)定。其中，測(cè)定樣品為1.2.1 中10%和70%提取液20.0 μL，以500 μmol/L抗壞血酸90%甲醇溶液為陽性對(duì)照。樣品溶液的抗氧化能力以500 μmol/L Fe2+(FeSO4·7H2O)為參比基礎(chǔ)，計(jì)算公式為：

FRAP值 (μmol/L)=[(A-A0)/(AFeSO4·7H2O-A0)]×500 (μmol/L)

式中：A為樣品溶液的吸光值，AFeSO4·7H2O為FeSO4·7H2O溶液的吸光值，A0為不加樣品溶液的吸光值。

1.3 統(tǒng)計(jì)與分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行One-Way ANOVA Duncan數(shù)據(jù)差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同海拔桃兒七果實(shí)的特性

由表1可知，低海拔渭源地區(qū)桃兒七果實(shí)開花期和成熟期分別較高海拔夏河地區(qū)提前18和13 d，低海拔渭源地區(qū)開花期和成熟期天數(shù)為111 d，較高海拔夏河地區(qū)延長(zhǎng)5 d，低海拔果實(shí)的縱徑和橫徑較高海拔分別高8.82%和11.68%，而縱橫比較高海拔低2.52%；低海拔果實(shí)干重、種子數(shù)量和種子千粒干重分別較高海拔增加56.61%、14.90%和34.70%。

表1 不同海拔桃兒七果實(shí)特性的比較 (n=50)Table 1 Comparison of fruit characteristics of P. hexandrum at different altitudes (n=50)

2.2 不同海拔桃兒七果實(shí)中可溶性糖的含量

由圖1可知，在低海拔渭源、高海拔夏河兩個(gè)地區(qū)，果肉中可溶性糖的含量均顯著高于果皮(P<0.05)，分別較果皮高15.64%和24.27%；同一組織而言，低海拔果皮、果肉中可溶性糖含量分別較高海拔地區(qū)顯著高15.12%和16.50%。

2.3 不同海拔桃兒七果實(shí)中總黃酮化合物的含量

在低海拔渭源、高海拔夏河兩個(gè)地區(qū)，果皮中總黃酮化合物的含量均顯著高于果肉，分別較果肉高2.37和3.47倍；同一組織而言，低海拔果皮、果肉中總黃酮化合物的含量分別較高海拔地區(qū)顯著高1.35和1.98倍(圖2)。

圖1 不同海拔桃兒七果實(shí)中可溶性糖的含量Fig.1 Soluble sugar content in fruit of P. hexandrum at different altitudes

圖2 不同海拔桃兒七果實(shí)中總黃酮化合物的含量Fig.2 Total flavonoid content in fruit of P. hexandrum at different altitudes

不同小寫字母表示在P<0.05水平下達(dá)到顯著性差異。下同。Different lowercases indicated significant differences atP<0.05 level. The same as follow.

2.4 不同海拔桃兒七果實(shí)中總酚類化合物的含量

圖3 不同海拔桃兒七果實(shí)中總酚類化合物的含量Fig.3 Total phenolic content in fruit of P. hexandrum at different altitudes

圖3表明，在低海拔渭源、高海拔夏河兩個(gè)地區(qū)，果皮中總酚類化合物的含量均顯著高于果肉，分別較果肉高1.39和2.21倍；同一組織而言，低海拔果皮、果肉中總酚類化合物的含量分別較高海拔地區(qū)顯著高1.39和2.20倍。

2.5 不同海拔桃兒七果實(shí)提取液的抗氧化能力

由圖4可知，低海拔渭源、高海拔夏河兩個(gè)地區(qū)，果皮、果肉乙醇提取液的抑制率均大于陽性對(duì)照Vc；在低海拔地區(qū)，果皮70%和10%乙醇提取液的抑制率分別顯著大于果肉，高海拔地區(qū)70%和10%乙醇提取液的抑制率也分別大于果肉，但差異性不顯著(P<0.05)；就同一組織相同濃度乙醇提取液而言，低海拔果皮70%和10%乙醇提取液的抑制率顯著大于高海拔，分別高出43.41%和60.25%，而低海拔果肉70%和10%乙醇提取液的抑制率與高海拔無顯著差異(P<0.05)。

圖4 不同海拔桃兒七果實(shí)提取液的抑制率Fig.4 Inhibition percentage of extracts from fruit of P. hexandrum at different altitudes

由圖5可知，低海拔渭源、高海拔夏河兩個(gè)地區(qū)，果皮、果肉乙醇提取液的FRAP值也均大于陽性對(duì)照Vc；在低海拔地區(qū)，果皮70%和10%乙醇提取液的FRAP值分別顯著大于果肉，在高海拔地區(qū)，果皮70%乙醇提取液的FRAP值顯著大于果肉，而10%乙醇提取液二者之間無顯著性差異(P<0.05)；就同一組織相同濃度乙醇提取液而言，低海拔果皮和果肉70%乙醇提取液的FRAP值均顯著大于高海拔，低海拔果皮10%乙醇提取液的FRAP值也顯著大于高海拔，但果肉10%乙醇提取液二者之間的差異性不顯著(P<0.05)。

圖5 不同海拔桃兒七果實(shí)提取液的FRAP值Fig.5 FRAP value of extracts from fruit of P. hexandrum at different altitudes

3 討論與結(jié)論

植物次生代謝是植物在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中與環(huán)境相互作用的結(jié)果，其代謝途徑和次生代謝物的產(chǎn)生和分布通常有種屬、器官組織和生長(zhǎng)發(fā)育期的特異性，并且代謝物質(zhì)的代謝與積累易受到生長(zhǎng)環(huán)境的影響和調(diào)控[18]。很多研究表明，桃兒七的生長(zhǎng)發(fā)育和活性物質(zhì)的積累易受環(huán)境因素的影響。尚海琳等[19]通過對(duì)我國(guó)由南向北5個(gè)種源地桃兒七的光合生理生態(tài)特性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，桃兒七是一種喜光但又較耐陰植物，但不同分布區(qū)桃兒七的光合生理生態(tài)特征出現(xiàn)了較顯著的地理分化。馬紹賓等[20]報(bào)道稱，桃兒七是一個(gè)分布區(qū)范圍較廣的物種，其居群的分布格局受到光照、水分、土壤、溫度和海拔等條件的影響，其中，海拔對(duì)桃兒七生長(zhǎng)的影響是通過溫度來實(shí)現(xiàn)的，海拔越高，年平均溫度及極端最低溫度越低，桃兒七的物候期也就相應(yīng)地向后延長(zhǎng)，一般規(guī)律是海拔每升高100 m，桃兒七的物候期向后推遲3～5 d。馬紹賓等[21]研究發(fā)現(xiàn)，桃兒七花胚珠數(shù)、種子數(shù)和結(jié)實(shí)率與種群海拔呈正相關(guān)，單粒種子干重和果實(shí)內(nèi)種子數(shù)與海拔呈負(fù)相關(guān)，同一種群在不同年份平均種子產(chǎn)量差異不大。

蔣寶等[22]通過研究海拔對(duì)黃土高原地區(qū)赤霞珠果實(shí)酚類物質(zhì)含量及抗氧化活性的影響，發(fā)現(xiàn)海拔對(duì)赤霞珠果實(shí)理化特性，比如還原糖、總酸、糖酸比、單寧及pH，活性物質(zhì)，比如沒食子酸、安息香酸、丁香酸、咖啡酸、阿魏酸、香豆酸、水楊酸、兒茶素、槲皮素、蘆丁以及抗氧化活性具有一定影響，表現(xiàn)為低海拔谷地赤霞珠果實(shí)的成熟度、酚類化合物含量及抗氧化能力均優(yōu)于高海拔坡地赤霞珠果實(shí)。程籍等[23]研究川藏高海拔地區(qū)金冠蘋果品質(zhì)(比如單果質(zhì)量、果形指數(shù)、花青素、總糖、總酸、Vc等含量)與氣象因子的關(guān)系，結(jié)果表明，影響蘋果品質(zhì)的因素很多，其中生態(tài)因子起著關(guān)鍵作用，較大的平均晝夜溫差及日照時(shí)數(shù)有利于川藏高海拔地區(qū)金冠蘋果果面著色、果形端莊、五棱凸起、花青苷和總糖積累的特點(diǎn)，但也存在果實(shí)偏小的缺點(diǎn)。

海拔對(duì)果實(shí)產(chǎn)量和品質(zhì)的影響是相關(guān)氣候因子間接作用的綜合結(jié)果，其中以溫度、光強(qiáng)、紫外輻射和晝夜溫差等的影響較為顯著。研究表明，海拔平均每上升100 m直接輻射增大5.6%，散射輻射減小1.9%，光照強(qiáng)度遞增4%～5%；在山地相同的地形條件下，隨海拔的升高，空氣溫度降低，無霜期縮短[24]。海拔不僅影響植物形態(tài)，比如株高矮化、增粗、節(jié)間縮短等；還對(duì)葉片結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著的影響，比如表皮細(xì)胞短徑與柵欄細(xì)胞長(zhǎng)徑逐漸降低，柵欄組織層數(shù)、柵欄細(xì)胞厚度和葉片厚度逐漸增加等[25-26]。另外，海拔還影響植物的光合特性，進(jìn)而影響生長(zhǎng)發(fā)育和物質(zhì)代謝，比如，隨著海拔的升高，凈光合速率、氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率值降低[27-28]。

本研究發(fā)現(xiàn)，低海拔渭源地區(qū)桃兒七果實(shí)開花期和成熟期分別較高海拔夏河地區(qū)提前18和13 d，低海拔渭源地區(qū)開花期和成熟期天數(shù)為111 d，較高海拔夏河地區(qū)延長(zhǎng)5 d，低海拔果實(shí)的縱徑、橫徑、果實(shí)干重、單果種子數(shù)量和種子千粒干重均高于高海拔；隨著海拔的增加，果皮和果肉中可溶性糖、總黃酮和酚類化合物含量以及抗氧化活性顯著下降；且海拔對(duì)果皮和果肉組織間活性物質(zhì)的差異性還具有顯著的影響。本試驗(yàn)只對(duì)桃兒七成熟果實(shí)特性、主要活性物質(zhì)(可溶性糖、總黃酮和酚類化合物)積累量以及抗氧化能力進(jìn)行了測(cè)定，而對(duì)具體化學(xué)成分的分析，還有待進(jìn)一步的研究。

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Effect of altitude on fruit characteristics, bioactive compounds and antioxidant capacity inPodophyllumhexandrum

LI Meng-Fei1, YAO Yuan-Yuan1, DING Yao-Lu2, GE Li1, CAO Xiao-Lu1, LI Jie1, YANG De-Long1*

1.GansuProvincialKeyLabofAridlandCropScience,CollegeofLifeScienceandTechnology,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China； 2.InstituteofAgriculturalSciences,GannanTibetanAutonomousPrefecture,GansuProvince,Hezuo747000,China

This study investigated the effect of altitude on fruit characteristics and the accumulation of bioactive compounds in the fruit ofPodophyllumhexandrum, with the aim of better protecting and utilizing this wild resource. The experiments were conducted at different altitudes (2400-2500 m and 2900-3000 m), with measurements taken of fruit characteristics, bioactive compound content and antioxidant capacity. Differences in altitude showed very strong effects on fruit characteristics and the accumulation of bioactive compounds in fruit tissue. The duration from flowering to fruit ripening stages at lower altitudes was 111 d, 5 d longer than that at higher altitudes, and the duration of the ripening stage increased by 13 d. The length, diameter, dry weight, seed number and thousand-seed weight per fruit were greater at lower than at higher altitudes, while the ratio of length-diameter was lower. The contents of soluble sugar, total flavonoid and phenolic in both peel and pulp at lower altitudes were significantly higher than those at higher altitudes. The inhibition percentages (I%) and ferric reducing/antioxidant power (FRAP value) of 70% and 10% ethanol extracts from the peel and the FRAP value of 70% ethanol extracts from the pulp at lower altitudes were significantly higher than those at higher altitudes. At the same altitude, the content of soluble sugar in the pulp was significantly greater than that in the peel, while the contents of total flavonoid and phenolic were lower. The I% and FRAP value of 70% and 10% ethanol extracts from peel were significantly greater than those from pulp at lower altitudes, while at higher altitudes only the FRAP value of 70% ethanol extracts from the peel was significantly greater than that from the pulp. In conclusion, this study indicates that low altitude is conducive for fruit growth and development and for the accumulation of soluble sugar, total flavonoid and phenolic contents in the fruit ofP.hexandrum.

Podophyllumhexandrum; altitude; fruit characteristic; soluble sugar; total flavonoid; total phenolic; antioxidant capacity

10.11686/cyxb2016212

http://cyxb.lzu.edu.cn

2016-05-23；改回日期：2016-06-07

國(guó)家自然科學(xué)基金(81560617，31360148)，甘肅省中藥材產(chǎn)業(yè)科技攻關(guān)(GYC14-03)和甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)SRTP(20160808)資助。

栗孟飛(1980-)，男，河南駐馬店人，副教授，博士。E-mail:lmf@gsau.edu.cn*通信作者Corresponding author. E-mail:yangdl@gsau.edu.cn

栗孟飛, 姚園園, 丁耀錄, 葛莉, 曹小路, 黎潔, 楊德龍. 海拔對(duì)桃兒七果實(shí)特性、活性成分含量及抗氧化能力的影響. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2017, 26(4): 162-168.

LI Meng-Fei, YAO Yuan-Yuan, DING Yao-Lu, GE Li, CAO Xiao-Lu, LI Jie, YANG De-Long. Effect of altitude on fruit characteristics, bioactive compounds and antioxidant capacity inPodophyllumhexandrum. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(4): 162-168.