甜高粱青貯有氧暴露的穩(wěn)定性及微生物變化的研究

周斐然，張?zhí)K江，王明，肖丹，郭雪峰(塔里木畜牧科技兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾843300)

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甜高粱青貯有氧暴露的穩(wěn)定性及微生物變化的研究

周斐然，張?zhí)K江*，王明，肖丹，郭雪峰
(塔里木畜牧科技兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾843300)

為了更好地開發(fā)利用甜高粱青貯飼料，本研究以高糖甜高粱青貯(HSS)、低糖甜高粱青貯(LSS)和玉米青貯(MZS)為材料，研究了在有氧暴露0、5、10、15、20和25 d時(shí)干物質(zhì)、水溶性碳水化合物(WSC)、pH、溫度和微生物數(shù)量的變化。結(jié)果表明，在有氧暴露前期(0～5 d)，與LSS和MZS比較，HSS具有較低的pH值，較高的乳酸菌含量和較高的溫度；在有氧暴露的后期(15～25 d)，HSS酵母菌、霉菌和好氧菌數(shù)量均顯著大于LSS和MZS (P<0.05)，LSS的溫度和pH值顯著低于HSS和MZS(P<0.05)；在整個(gè)有氧過程中，WSC含量在HSS中最高，干物質(zhì)含量在LSS中最高(P<0.05)?？梢?，在有氧暴露環(huán)境下，LSS有氧穩(wěn)定性最好，酵母菌、霉菌和好氧細(xì)菌數(shù)量增加最少；HSS有氧穩(wěn)定性最差，酵母菌、霉菌和好氧細(xì)菌數(shù)量增加最多；MZS有氧穩(wěn)定性和好氧性微生物數(shù)量居中。本研究結(jié)果提示，HSS在有氧暴露環(huán)境下更容易發(fā)生二次發(fā)酵，因此，有必要在青貯中使用添加劑，以保證HSS在使用過程的營養(yǎng)品質(zhì)。

甜高粱；青貯；有氧穩(wěn)定性；微生物

甜高粱(Sorghumbicolor/sweet sorghum)屬C4作物，是粒用高粱的一個(gè)變種，起源于非洲。由于其光合效率高、生物產(chǎn)量高、含糖量高，具有抗旱、耐貧瘠、耐鹽堿等特性，甜高粱作為能源、飼料和糖源作物已受到世界各國的普遍重視，被認(rèn)為是最具開發(fā)潛力的能源植物之一[1-2]。作為飼料作物，制作青貯是目前甜高粱應(yīng)用的主要形式。研究表明，青貯甜高粱粗纖維、蛋白質(zhì)含量與青貯玉米(Zeamays)相當(dāng)或優(yōu)于青貯玉米[3]，干物質(zhì)降解率、中性洗滌纖維消化率高于玉米青貯，pH值、乳酸含量與玉米青貯相近[4-5]。

目前，青貯飼料是奶牛、肉牛養(yǎng)殖過程必不可少的重要飼料，而且在其他草食動(dòng)物，如羊和鹿養(yǎng)殖中也有廣泛應(yīng)用。青貯的質(zhì)量對(duì)家畜的生產(chǎn)和生長都有直接影響，因此，青貯的品質(zhì)倍受關(guān)注。豐富的水溶性碳水化合物(water soluble carbohydrate WSC)和適宜的水分含量是制作優(yōu)質(zhì)青貯飼料的基礎(chǔ)。然而，在開窖、取料、配制全混合日糧以及飼喂過程中，青貯飼料因接觸空氣容易發(fā)生二次發(fā)酵的問題[6]。青貯二次發(fā)酵使腐敗菌大量繁殖，造成青貯飼料營養(yǎng)物質(zhì)損失，產(chǎn)生難聞的氣味，進(jìn)而影響到家畜的采食量和生產(chǎn)性能[7]。

研究表明，青貯飼料的有氧穩(wěn)定性不僅可以受到有機(jī)酸[8]和微生物[9]添加劑的影響，而且可以受到飼料原料組成[10-11]的影響。然而，作為一種在干旱、半干旱地區(qū)極具開發(fā)潛力的青貯飼料作物[2,12]，甜高粱青貯飼料有氧穩(wěn)定性方面的研究尚少見報(bào)道，為此，本研究選擇了含糖量存在差異的兩種甜高粱和普通玉米加工而成的甜高粱青貯和玉米青貯為材料，通過跟蹤分析有氧環(huán)境條件下3種青貯飼料中微生物數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化、溫度及pH變化，進(jìn)而評(píng)價(jià)甜高粱青貯的有氧穩(wěn)定性，為甜高粱青貯飼料的科學(xué)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 青貯飼料制作

高糖甜高粱(high sugar sweet sorghum, HS)品種為麗歐，糖錘度為22.1%，低糖甜高粱(low sugar sweet sorghum, LS)品種為X096，糖錘度為9.4%，玉米(maize, MZ)品種為包玉2號(hào)，糖錘度為9.2%。兩個(gè)品種甜高粱與玉米于2015年4月28日播種，每個(gè)播種小區(qū)面積約為100 m2(20 m×5 m)，每個(gè)品種重復(fù)播種3個(gè)小區(qū)。播種行距為60 cm，株距20 cm，人工播種，按常規(guī)方法進(jìn)行田間管理，臘熟期甜高粱和玉米2015年10月10日收割，分別制作高糖甜高粱青貯(high sugar sweet sorghum silage, HSS)、低糖甜高粱青貯(low sugar sweet sorghum silage, LSS)和玉米青貯(maize silage, MZS)，青貯原料的化學(xué)成分見表1。

HS: High sugar sweet sorghum; LS: Low sugar sweet sorghum; MZ: Maize; DM: Dry matter; CP: Crude protein; WSC: Water soluble carbohydrate; NDF: Neutral detergent fibre; ADF: Acid detergent fibre; ADL: Acid detergent lignin. 下同The same below.

用普通粉草機(jī)將收割的玉米及甜高粱粉碎至2～3 cm，人工填裝于青貯塑料罐中。在填裝青貯原料的過程中，用粗細(xì)適宜的短木棒不斷用力搗壓，最大限度確保每罐青貯原料被壓實(shí)壓緊。之后，在罐口上附密封墊，擰緊蓋口，標(biāo)記后于室溫(15～25 ℃)避光保存，每種青貯制作10罐青貯。

1.2 有氧穩(wěn)定性分析

青貯飼料在2016年4月1日開罐，以一個(gè)發(fā)酵罐為重復(fù)單位，每種青貯取3個(gè)重復(fù)。松動(dòng)開窖后青貯使之與空氣能充分接觸。把多路溫度記錄儀(NZ93-6，南京能兆科技有限公司)探頭放置于青貯飼料的中心位置，之后覆蓋2層紗布，放置于室溫下。在開罐有氧暴露后0，5，10，15，20，25 d時(shí)，從每個(gè)青貯罐中分別取樣，測(cè)定青貯飼料各時(shí)間點(diǎn)pH值、干物質(zhì)、微生物數(shù)量。有氧穩(wěn)定性定義為青貯飼料接觸空氣后核心物料溫度比外界溫度高出2 ℃時(shí)所需要的小時(shí)(h)數(shù)[13]。

1.3 溫度、干物質(zhì)、WSC及pH值測(cè)定

pH值的測(cè)定：取出15 g青貯飼料樣品，浸于135 mL蒸餾水中攪拌1 min，并用2層濾紙進(jìn)行過濾處理。濾液經(jīng)離心后用電子酸度計(jì)(PHSJ-5，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)測(cè)定pH值。干物質(zhì)采用烘干法測(cè)定。WSC采用硫酸-蒽酮比色法測(cè)定[14]。溫度由多路溫度記錄儀測(cè)定。

大學(xué)生自身專業(yè)學(xué)習(xí)能力、日常興趣愛好、思想價(jià)值觀念也是影響就業(yè)觀形成的主要因素。在面臨就業(yè)問題的時(shí)候，大學(xué)生通常會(huì)根據(jù)自己的能力、愛好、物質(zhì)追求等來確立自身的就業(yè)方向。

1.4 微生物菌落測(cè)定

從每種青貯飼料中各取5 g樣品，剪碎放入45 mL的無菌蒸餾水中封口，置于37 ℃恒溫?fù)u床中慢速搖40 min后，即成10-1稀釋液。用裝有無菌槍頭的移液槍吸取100 μL的10-1稀釋液移入裝有900 μL無菌水的離心管中混合均勻，即成10-2稀釋液。按此方法連續(xù)稀釋，制成10-3、10-4、10-5、10-6、10-7稀釋菌液[15]。取選擇性培養(yǎng)基，用記號(hào)筆在培養(yǎng)皿的底部劃分10-3、10-4、10-5、10-6、10-7五種扇形稀釋梯度，分別吸取不同稀釋梯度的菌液10 μL滴在相應(yīng)的扇形區(qū)域內(nèi)，用涂抹棒均勻涂抹，每個(gè)稀釋梯度做3個(gè)重復(fù)。

按Ashbell等[16]的方法，乳酸菌、好氧細(xì)菌和酵母菌分別采用Rogosa瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和孟加拉紅培養(yǎng)基，霉菌采用葡萄糖麥芽浸膏培養(yǎng)基。乳酸菌用CO2培養(yǎng)箱(BC-J80S，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)、好氧細(xì)菌和酵母菌用生化培養(yǎng)箱(SPX-150B，北京光明醫(yī)療儀器有限公司)、霉菌放在霉菌培養(yǎng)箱(MJX-160，寧波江南儀器廠)，37 ℃培養(yǎng)48 h，用菌落計(jì)數(shù)器(YLN-30A,北京中興偉業(yè)儀器有限公司)統(tǒng)計(jì)菌落形成單位(colony forming unit, CFU)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2007對(duì)pH、微生物數(shù)量、溫度和DM數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，微生物數(shù)據(jù)進(jìn)行以10為底的對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換。采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 19.0進(jìn)行方差分析，采用Duncan法進(jìn)行多重比較，顯著性檢驗(yàn)水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 有氧暴露過程pH、DM、WSC和溫度的變化

HSS、LSS和MZS飼料有氧暴露過程pH、DM、WSC和溫度的變化情況見表2。在0到第15天期間，3種青貯DM含量由高到低依次為LSS，MZS，HSS(P<0.05)。在20和25 d時(shí)， DM在HSS和MZS達(dá)到同一水平(P>0.05)，但依然顯著低于LSS(P<0.05)。在25 d的有氧暴露過程中，HSS增加了21.7%，MZS增加了10.1%，LSS增加了8.6%。

從pH值看，在0 d時(shí)，HSS顯著低于LSS和MZS(P<0.05)，在第10天時(shí)，3種青貯pH達(dá)到同一水平(P>0.05)，而在第25天時(shí)，MZS的pH最大，LSS最低，HSS居中，三者之間差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)。3種青貯pH值都隨著有氧暴露時(shí)間的延長而上升。

從溫度變化來看，3種青貯飼料在0 d時(shí)溫度基本一致，但在有氧環(huán)境下，在5、10和15 d期間青貯飼料溫度持續(xù)升高，HSS和MZS溫度顯著大于LSS(P<0.05)；從0到第5天，HSS溫度增加了3 ℃，MZS溫度增加了1.9 ℃，LSS溫度增加了1.4 ℃。在15和20 d時(shí)，各組青貯溫度均有所下降，在25 d時(shí)，各青貯溫度依然高于室溫。

2.2 有氧暴露過程微生物的數(shù)量變化

3種青貯飼料在有氧暴露過程中微生物數(shù)量的變化見表3。有氧暴露第0天時(shí)，HSS中乳酸菌數(shù)量最多，顯著大于LSS(P<0.05)，MZS居中。在5至25 d期間，3種青貯的乳酸菌數(shù)量持續(xù)減少，在25 d時(shí)，乳酸菌數(shù)量在3種青貯中差異不顯著(P>0.05)。酵母菌和霉菌的數(shù)量變化相似，在有氧暴露的0 d時(shí)，3種青貯飼料之間酵母菌、霉菌數(shù)量無顯著差異(P>0.05)，但在10至25 d期間，酵母菌和霉菌數(shù)量持續(xù)增加，HSS的酵母菌和霉菌數(shù)量顯著大于LSS(P<0.05)，MZS居中。有氧暴露后，3種青貯中的好氧細(xì)菌數(shù)量均逐漸增加，在整個(gè)有氧暴露期間，好氧細(xì)菌數(shù)量在HSS中顯著高于LSS(P<0.05)，而MZS的好氧菌數(shù)量基本處于二者之間。

表2 青貯有氧暴露過程DM、pH、WSC和溫度的變化Table 2 The change of DM, pH, WSC and temperature during aerobic exposure of the silages

注：HSS：高糖甜高粱青貯；LSS：低糖甜高粱青貯；MZS：玉米青貯。表中同一指標(biāo)同行比較，標(biāo)注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

Note: HSS：High sugar sweet sorghum silage；LSS：Low sugar sweet sorghum silage；MZS：Maize silage.The values within rows under the same items are significantly different (P<0.05). The same below.

表3 青貯有氧暴露過程微生物數(shù)量的變化Table 3 The change of microbial populations in the silages during aerobic exposure log cfu/g FM

注： log cfu/g FM為每g青貯中菌落的對(duì)數(shù)值。

Note: log cfu/g FM means logarithm of bacterial colonies in 1 g silage.

3 討論

3.1 有氧條件下青貯pH、DM、WSC和溫度的變化

青貯DM與青貯原料本身的含水量有直接的關(guān)系。LS含水量最低，因此在LSS中DM也最大；HS持綠期較長，HS甜高粱表面富含的蠟質(zhì)也阻止了水分的散失，在收割時(shí)含水量較多，導(dǎo)致HSS中DM較低；而MZ的水分在秋季很容易散失，導(dǎo)致含水量下降，使MZS的DM含量也較大。

青貯飼料pH值是評(píng)判青貯質(zhì)量的關(guān)鍵性指標(biāo)，是青貯乳酸發(fā)酵的結(jié)果。一般來講pH值越低，酸度越大，青貯越容易保存[17-18]。在有氧環(huán)境條件下，青貯飼料pH值會(huì)隨接觸空氣時(shí)間的延長而增加，這主要是好氣性微生物快速增殖所引起的[18]。在有氧暴露的前5 d，HSS的pH值顯著低于LSS和MZS，這是由HSS初始pH較低(pH=3.68)所引起的。在25 d時(shí)，LSS的pH值最低，MZS最高，HSS居中，這可能與三者可發(fā)酵糖的含量有關(guān)。

原料中豐富的WSC是保證青貯成功的關(guān)鍵因素之一，WSC是一類易發(fā)酵的物質(zhì)，可以為青貯乳酸菌的增殖提供營養(yǎng)物質(zhì)，產(chǎn)生有機(jī)酸而使pH下降。在0 d時(shí)，HSS、MZS和LSS中的WSC是青貯發(fā)酵后殘余的WSC。HSS中較高的WSC說明了HS在青貯發(fā)酵達(dá)到穩(wěn)定階段后殘余的WSC較多，這與青貯原料HS中富含WSC(18.40%)有關(guān)。而在有氧條件下，HSS中豐富的WSC可以為好氧微生物的大量增殖提供養(yǎng)分，導(dǎo)致WSC的快速下降，同樣，LSS和MZS中殘留的WSC也可以為好氧菌的生長提供養(yǎng)分而下降。

產(chǎn)熱是青貯飼料在有氧環(huán)境條件下最顯著的變化之一，它是大量微生物活動(dòng)的結(jié)果，也是青貯養(yǎng)分損失的過程。一般人們用有氧穩(wěn)定性來判斷青貯飼料在有氧條件下變質(zhì)的速度。有氧穩(wěn)定性低，說明青貯遇氧變質(zhì)速度越快[19]。在本研究中，環(huán)境溫度為21 ℃，因此，按有氧穩(wěn)定性的定義，有氧穩(wěn)定性LSS最高，HSS最低，而MZS居中。這種差異反映了青貯飼料中易發(fā)酵物質(zhì)的多少，容易發(fā)酵物質(zhì)越多，在有氧條件下，由于好氣性微生物快速增殖而使變質(zhì)速度加快。因此，HSS較多的WSC可能是導(dǎo)致其有氧穩(wěn)定性差的主要原因，此外，HSS較高含水量也加速了其變質(zhì)過程；相反，LSS較低WSC含量是導(dǎo)致其在有氧條件下溫度上升較慢的主要原因，而MZS雖然WSC含量也比較低，但MZS所含的豐富淀粉也屬于易發(fā)酵物質(zhì)，可以為好氧菌的生長提供養(yǎng)分，導(dǎo)致其在有氧條件下溫度上升也較快。

3.2 有氧條件下青貯微生物的變化

青貯過程是一個(gè)復(fù)雜的微生物發(fā)酵過程，其中乳酸菌被認(rèn)為是決定青貯發(fā)酵能否成功的關(guān)鍵微生物[20]，青貯過程添加乳酸菌制劑往往也可以明顯提高青貯的品質(zhì)[21]。研究表明[3]，HS和MZ比LS更容易青貯，與LSS相比，HSS殘留了更多的WSC，MZS則殘留了較多的淀粉。殘留在HSS中較多的WSC和MZS中的淀粉均屬易發(fā)酵糖類，在有氧的環(huán)境條件下，很容易被微生物利用而發(fā)生二次有氧發(fā)酵，導(dǎo)致HSS和MZS在有氧環(huán)境下酵母菌、霉菌和好氧細(xì)菌的快速增殖，而乳酸菌受到抑制而數(shù)量下降，更容易引起青貯飼料腐爛變質(zhì)。LSS中較少的WSC和較低的含水量，可能是導(dǎo)致酵母、霉菌和好氧菌增殖較慢的重要原因。酵母菌和霉菌等好氣性微生物通過氧化青貯有機(jī)酸而引起青貯飼料的有氧變質(zhì)[22]，是導(dǎo)致青貯二次發(fā)酵過程營養(yǎng)損失的主要因素。有研究估計(jì)，在青貯發(fā)酵過程中的有氧變質(zhì)損失可高達(dá)10%～15%[23]。由此，在有氧暴露環(huán)境下，酵母菌和霉菌等好氣性微生物所引起的HSS和MZS營養(yǎng)損失也是不可忽視的。

青貯乳酸菌的發(fā)酵類型，可以影響有氧條件下青貯的微生物數(shù)量和有氧穩(wěn)定性。有研究表明，異型發(fā)酵乳酸菌產(chǎn)乳酸的能力雖然不如同型發(fā)酵乳酸菌，但它能夠增加青貯中乙酸、丙酸的比例，而乙酸和丙酸具有抑制酵母菌和霉菌生長的特性[24-26]。由此推測(cè)，在有氧條件下，LSS中酵母菌和霉菌數(shù)量較少，很可能由于LSS是以異型乳酸菌發(fā)酵為主，產(chǎn)生了較多的乙酸和丙酸，后者抑制了酵母菌和霉菌等好氣性微生物的增殖。但具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

此外，不同的青貯原料附著的微生物種類和數(shù)量存在很大差異，這些微生物在青貯酸性環(huán)境條件下生長增殖受到了抑制，一旦環(huán)境發(fā)生變化，受抑制的微生物就會(huì)重新生長增殖。因此，HSS、MZS和LSS在有氧環(huán)境條件下不同微生物的數(shù)量變化也可能與其原料附著的微生物數(shù)量有關(guān)。

4 結(jié)論

有氧暴露條件下，LSS有氧穩(wěn)定性最好，酵母菌、霉菌和好氧細(xì)菌數(shù)量增加最少；HSS有氧穩(wěn)定性最差，酵母菌、霉菌和好氧細(xì)菌數(shù)量增加最多；MZS有氧穩(wěn)定性和好氧性微生物數(shù)量居中。本研究結(jié)果提示，HSS在有氧暴露環(huán)境下更容易發(fā)生二次發(fā)酵，因此，有必要在青貯過程中使用添加劑，以保證HSS在使用過程中的營養(yǎng)品質(zhì)。

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Aerobic stability and microbial populations in sweet sorghum silages during aerobic exposure

ZHOU Fei-Ran, ZHANG Su-Jiang*, WANG Ming, XIAO Dan, GUO Xue-Feng

KeyLaboratoryofTarimAnimalHusbandryScience&Technology,CollegeofAnimalScience,TarimUniversity,Alar843300,China

In order to promote the exploitation and utilization of sweet sorghum silage, three kinds of silages (high sugar sweet sorghum silage, HSS; low sugar sweet silage, LSS; maize silage, MZS) were used to analyze the changes in dry matter (DM), water soluble carbohydrates (WSC), pH, temperature and microbial populations during aerobic exposure over 0, 5, 10, 15, 20 and 25 days. The results showed that HSS had a lower pH and higher LAB (lactic acid bacteria) population and higher temperature compared with LSS and MZS (P<0.05) in the early stage of aerobic exposure (0-5 d). The numbers of yeast, mould and aerobic bacteria in HSS were higher than that in LSS and MZS (P<0.05), while temperature and pH were lower in LSS than those in HSS and MZS (P<0.05) in the latter stages of aerobic exposure (15-25 d). HSS had the highest WSC and LSS had the lowest dry matter content (P<0.05) over all exposure periods. Overall, LSS had the greatest aerobic stability with less yeast, mould and aerobic bacteria which were highest in HSS which had the lowest aerobic stability; bacteria numbers and aerobic stability were intermediate in in MZS. The results of this study suggest that it is necessary to use additives when making HSS to assure quality because it is more prone to secondary fermentation under aerobic exposure.

sweet sorghum; silage; aerobic stability; microbe

10.11686/cyxb2016304

http://cyxb.lzu.edu.cn

2016-08-17；改回日期：2016-11-14

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31160472)資助。

周斐然(1991-)，男，新疆喀什人，在讀碩士。E-mail: 710298044@qq.com*通信作者Corresponding author. E-mail: zsjdky@126.com

周斐然, 張?zhí)K江, 王明, 肖丹, 郭雪峰. 甜高粱青貯有氧暴露的穩(wěn)定性及微生物變化的研究. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2017, 26(4): 106-112.

ZHOU Fei-Ran, ZHANG Su-Jiang, WANG Ming, XIAO Dan, GUO Xue-Feng. Aerobic stability and microbial populations in sweet sorghum silages during aerobic exposure. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(4): 106-112.