野生麻花秦艽中化感活性物質(zhì)對牧草萌發(fā)及生理特性的影響

丁春發(fā)，魏小紅，王芳琳(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

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野生麻花秦艽中化感活性物質(zhì)對牧草萌發(fā)及生理特性的影響

丁春發(fā)，魏小紅*，王芳琳
(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

采用超聲提取法從野生麻花秦艽中提取龍膽苦苷(gentiopicroside)和黃酮(flavonoids)，用不同濃度龍膽苦苷和黃酮提取液處理受試植物紫花苜蓿、紅三葉和白三葉，通過對受試植物種子萌發(fā)和幼苗生理特性[苗高、根長、鮮重以及超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)3種抗氧化酶活性]的研究，探討了野生麻花秦艽的化感作用及抗氧化性。研究表明，野生麻花秦艽中龍膽苦苷和黃酮提取液對受體植物的種子萌發(fā)和幼苗生長大多表現(xiàn)出化感抑制作用，僅龍膽苦苷濃度為2.52 mg/mL時，對白三葉的苗高表現(xiàn)出促進(jìn)生長的作用；隨龍膽苦苷和黃酮提取液濃度增大，對3種抗氧化酶活性影響程度不同：3種受體植物幼苗體內(nèi)的POD和CAT的活性分別在6.30和1.95 mg/mL時達(dá)到最大值，紫花苜蓿幼苗體內(nèi)SOD活性在濃度分別為12.60和3.90 mg/mL時活性最大，分別為22.971和25.013 U/g，紅三葉和白三葉幼苗體內(nèi)的SOD活性在6.30和1.95 mg/mL時達(dá)到最大值，說明不同植物對化感脅迫的耐受能力不同，紫花苜蓿對化感脅迫的耐受能力強(qiáng)于紅三葉和白三葉。

野生麻花秦艽；龍膽苦苷；黃酮；化感作用；抗氧化酶

中藥秦艽是我國重要的常用中藥材，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，麻花秦艽(Gentianastraminea)是其主要原植物之一，屬龍膽科(Gentianaceae)龍膽屬(Gentiana)秦艽組(Sect.Cruciata Gaudin)多年生草本植物，其根中含有以龍膽苦苷為主的多種環(huán)烯醚萜苷類化合物，是主要的藥用有效成分且具有多方面的藥理作用[1]。由于秦艽具有很高的藥用價值,臨床用藥大量增加，經(jīng)多年的過度采挖，造成秦艽野生資源的嚴(yán)重匱乏。目前，我國40%的藥材供應(yīng)主要依靠栽培品種，在栽培的藥用植物中，根類藥材占70%左右，生產(chǎn)中絕大多數(shù)根類藥材栽培會產(chǎn)生連作障礙，已成為制約我國中藥材可持續(xù)發(fā)展的重大問題[2]；土壤質(zhì)量退化和土壤污染也是造成藥用植物栽培過程中質(zhì)量和產(chǎn)量下降的一種重要因素，連作土壤的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性急劇下降，微生物種類減少，病原菌增多，嚴(yán)重影響到微生態(tài)環(huán)境的穩(wěn)定性[3]。

研究發(fā)現(xiàn)，藥用植物連作障礙與其產(chǎn)生的化感物質(zhì)密切相關(guān)，藥用植物化感作用是其發(fā)生連作障礙的重要因素之一[4]，植物化感作用是一種自然現(xiàn)象，是植物對環(huán)境的一種適應(yīng)和防御機(jī)制，是植物與周圍的生物群落通過次生代謝物質(zhì)為媒介建立的穩(wěn)固化學(xué)作用關(guān)系[5-6]。大多數(shù)藥用植物可以向環(huán)境中釋放次生代謝產(chǎn)物即化感物質(zhì)對周圍植物和自身起作用[7]，龍膽苦苷和黃酮不僅是麻花秦艽中主要的化感物質(zhì)[8]，而且是中草藥中主要活性成分和抗氧化物[9]；豆科牧草輪作能使土壤微生物群落復(fù)雜程度顯著增加，大幅度改良土壤質(zhì)量，且改良效果隨豆科植物品種不同、連作年限長短而存在差異[10-13]。對于麻花秦艽的研究前人已在其藥用成分、藥理與栽培方面做了大量工作，但其主要的次生產(chǎn)物龍膽苦苷和黃酮的化感作用及其抗氧化性還鮮有報道。本研究以麻花秦艽根、花為原料，利用超聲提取法對龍膽苦苷和黃酮進(jìn)行提取，通過龍膽苦苷和黃酮對3種豆科牧草紅三葉(Trifoliumpratense)、白三葉(Trifoliumrepens)和紫花苜蓿(Medicagosativa)種子發(fā)芽及幼苗的生理特性影響揭示其化感作用及其抗氧化性，從而建立麻花秦艽和豆科牧草之間的輪作體系，緩解或解除麻花秦艽栽培過程中的連作障礙，為麻花秦艽的人工栽培和充分利用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集地自然概況和受體植物

野生麻花秦艽采集于天祝藏族自治縣金強(qiáng)河封育多年的天然草地，其位于甘肅省中部，祁連山東端，地處青藏、黃土、內(nèi)蒙古三大高原交匯過渡地段，海拔2500～3200 m，該地區(qū)氣候濕潤，年平均氣溫-1.0～1.3 ℃，年降水量265～600 mm,全年日照2500～2700 h，氣候?qū)俚湫偷拇箨懶愿咴撅L(fēng)氣候,植被生長季90～145 d。

麻花秦艽屬于多年生的藥用植物，秋季時節(jié)其花和葉成熟，2015年9月采集生長期達(dá)3年以上且根、葉、花完整的植株，洗凈，將其根、葉、花分離后自然風(fēng)干，粉碎機(jī)粉碎過0.45 mm篩后貯藏備用。

受體植物：紫花苜蓿(阿爾岡金號)、白三葉(百事)及紅三葉(Marathon)都是豆科植物，屬優(yōu)良牧草，三者在甘肅境內(nèi)都有廣泛分布，其種子購于甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院。

1.2 實驗方法

1.2.1 野生麻花秦艽龍膽苦苷和黃酮提取液的制備 參照康輝等[14]的方法：稱取干燥的麻花秦艽根粉末5 g，按照料液比1∶30加入150 mL蒸餾水，利用超聲提取法，在40 ℃下提取40 min,然后用離心機(jī)在3500 r/min離心5 min，合并上清液并用蒸餾水定容至150 mL，吸取少量在273 nm處測定其吸光值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，求得龍膽苦苷提取液的濃度為12.60 mg/mL，按不同倍數(shù)稀釋得到6.30和2.52 mg/mL的龍膽苦苷稀釋液，備用。

參照康輝等[14]和杜芳艷等[15]的方法：稱取干燥的麻花秦艽花粉末5 g，按照料液比1∶40加入200 mL 60%乙醇，在最大超聲頻率下，于65 ℃超聲處理20 min后，冷卻過濾，濾渣重復(fù)提取兩次，合并濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至50 mL時，按1∶1加入石油醚除去脂溶性物質(zhì)和葉綠素等，回收石油醚，下層粗提液轉(zhuǎn)入150 mL三角瓶中，用蒸餾水定容至刻度，吸取少量在510 nm處測定其吸光值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，求得黃酮提取液的濃度為3.90 mg/mL，按不同倍數(shù)稀釋得到1.95 和0.78 mg/mL的黃酮稀釋液，備用。

1.2.2 種子發(fā)芽和幼苗生長試驗 采用培養(yǎng)皿濾紙法[16]進(jìn)行種子發(fā)芽培養(yǎng)，實驗于2015年12月在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院植物生理實驗室進(jìn)行，挑選飽滿、均勻、大小一致的紅三葉、白三葉和紫花苜蓿種子，用0.1%HgCl2溶液消毒3～5 min，無菌蒸餾水對消毒后的種子反復(fù)多次沖洗后均勻置于預(yù)先處理過的培養(yǎng)皿中，每皿50粒，并設(shè)置龍膽苦苷(2.52、6.30、12.60 mg/mL)和黃酮(0.78、1.95、3.90 mg/mL)各3個不同濃度，對照用蒸餾水處理，每處理設(shè)3次重復(fù)，每個培養(yǎng)皿分別加入不同濃度麻花秦艽龍膽苦苷或者黃酮提取液5 mL，對照加入5 mL無菌蒸餾水。分別置于(21±2)、(20±5)、(28±2) ℃恒溫光照培養(yǎng)箱內(nèi)，在600 μmol/(m2·s)光照強(qiáng)度下每天光照12 h，相對濕度60%～80%，每天統(tǒng)計發(fā)芽的種子數(shù)。

參照李偉麗等[17]的方法進(jìn)行幼苗生長試驗，略有改動：于2016年1月在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院植物生理實驗室進(jìn)行，用15 cm×13 cm 的營養(yǎng)缽進(jìn)行幼苗培養(yǎng)，并設(shè)置龍膽苦苷(2.52、6.30、12.60 mg/mL)和黃酮(0.78、1.95、3.90 mg/mL)各3個不同濃度，對照用蒸餾水處理，每種處理設(shè)3次重復(fù)。營養(yǎng)缽中加入500 g已滅菌的蛭石。播種前種子用0.1%HgCl2溶液消毒3～5 min，蒸餾水沖洗3～5次，然后將紅三葉、白三葉和紫花苜蓿種子直接播在消毒蛭石中，每缽50粒。播種后于植物生長室中培養(yǎng)，生長室的溫度分別為(21±2)、(20±5)、(28±2) ℃，在600 μmol/(m2·s)光照強(qiáng)度下每天光照12 h，相對濕度60%～80%，待幼苗培養(yǎng)至第7天時，然后每隔兩天用不同濃度的龍膽苦苷或黃酮提取液10 mL處理(幼苗培養(yǎng)期間，于下一次加入提取液之前用適量蒸餾水處理幼苗，自然滲出后再加入提取液，以弱化由于提取液積累造成的濃度誤差)，對照每隔兩天加入10 mL蒸餾水，幼苗培養(yǎng)至30 d時對其生長指標(biāo)和生理指標(biāo)進(jìn)行測定。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 發(fā)芽指標(biāo)及化感指數(shù)的測定 種子萌發(fā)處理后以胚根長為種子長的2倍，胚芽與種子等長作為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，于每天早上8:00統(tǒng)計3種受體植物發(fā)芽的種子數(shù)，試驗結(jié)束的標(biāo)記是以連續(xù)3 d不再有受體植物種子發(fā)芽，計算種子最終發(fā)芽率(germination rate,GR)、發(fā)芽勢(germination energy,GE)和發(fā)芽指數(shù)(germination index,GI)，每種處理設(shè)3次重復(fù)，取其平均值。

GR=[7 d發(fā)芽種子數(shù)/測試種子總數(shù)]×100%[18]
GE=[前3 d發(fā)芽種子數(shù)/種子總數(shù)]×100%[18-19]
GI=∑(Gt/Dt)[20]

式中:Dt為日發(fā)芽種子數(shù);Gt為與Dt相應(yīng)的每天的發(fā)芽種子數(shù)。

化感效應(yīng)指數(shù)RI=1-C/T(T≥C)，或者RI=C/T-1(T

式中:C為對照發(fā)芽率;T為處理發(fā)芽率。RI表示化感作用強(qiáng)度大小，正值表示促進(jìn)，負(fù)值表示抑制，絕對值大小反映化感作用的強(qiáng)弱[21]。

1.3.2 生長指標(biāo)的測定 株高和根長的測定：直接用尺子測量不同濃度龍膽苦苷和黃酮處理下的苜蓿、紅三葉和白三葉幼苗的株高和主根長。每種處理取樣10株，取其平均值，每組設(shè)3次重復(fù)。

鮮重的測量：將不同濃度龍膽苦苷和黃酮處理下的紫花苜蓿、紅三葉和白三葉幼苗從營養(yǎng)缽中小心取出，用水沖洗掉其根部附著的蛭石，并用吸水紙吸干其表面水珠，分別于天平上稱重。每個處理取樣10株，取其平均值，每組設(shè)3次重復(fù)。

1.3.3 生理指標(biāo)的測定 抗氧化酶酶液的提取參照Zhu等[22]和An等[23]的方法，超氧化物歧化酶(SOD)活性測定參照Huang等[24]的方法；過氧化物酶(POD)活性測定參照Shi等[25]的方法；過氧化氫酶(CAT)活性測定參照Aebi[26]的方法，每組設(shè)3次重復(fù)，取其平均值。

1. 4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

各項試驗重復(fù)3次，所得數(shù)據(jù)用Excel 2010軟件求得平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤；采用SPSS軟件對不同處理進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan檢驗法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生麻花秦艽龍膽苦苷和黃酮提取液對受體植物種子萌發(fā)的影響

表1、表2顯示：不同濃度的龍膽苦苷和黃酮提取液對白三葉、紅三葉和紫花苜蓿種子的發(fā)芽都有抑制作用，且抑制作用與濃度大致呈正比關(guān)系，與對照差異顯著(P<0.05)。從總體上看，同濃度下龍膽苦苷提取液對紅三葉發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)的化感效應(yīng)指數(shù)都要小于白三葉和紫花苜蓿，說明龍膽苦苷對紫花苜蓿和白三葉的化感抑制作用要強(qiáng)于紅三葉。相比較而言，黃酮提取液濃度為0.78 mg/mL時對紅三葉發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)的化感指數(shù)大于紫花苜蓿和白三葉，對紫花苜蓿和白三葉的化感抑制作用弱于紅三葉，而濃度為1.95和3.90 mg/mL時，對紫花苜蓿和白三葉發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)的化感指數(shù)大于紅三葉，說明對紫花苜蓿和白三葉的化感抑制作用強(qiáng)于紅三葉。

表1 野生麻花秦艽龍膽苦苷提取液對紅三葉、紫花苜蓿和白三葉種子發(fā)芽的影響Table 1 Effects of different concentration gentiopicroside from feral G. straminea on seed germination of T. pratense, M. sativa and T. repens

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

Noe:The different small letters within the same column mean the significant differences atP<0.05, the same below.

2.2 野生麻花秦艽龍膽苦苷和黃酮提取液對受體植物幼苗生長的影響

不同濃度的龍膽苦苷和黃酮提取液對紫花苜蓿、紅三葉及白三葉幼苗生長均表現(xiàn)出化感作用(或促進(jìn)或抑制)。龍膽苦苷濃度為2.52 mg/mL時(圖1～3)，白三葉的苗高長于對照，說明對白三葉的苗高表現(xiàn)出促進(jìn)生長的作用，對其根長和鮮重表現(xiàn)出抑制作用。龍膽苦苷濃度為2.52和6.30 mg/mL時，對3種牧草鮮重影響差異都不顯著，此濃度下與濃度為12.60 mg/mL時相比，差異顯著；三者與對照相比都差異顯著(P<0.05)。同樣，黃酮濃度為0.78和1.95 mg/mL時，對3種受體牧草鮮重影響差異都不顯著，此濃度下與濃度為3.90 mg/mL時相比，紅三葉和白三葉鮮重差異顯著，紫花苜蓿鮮重差異不顯著，三者與對照相比差異都顯著(P<0.05)。

表2 野生麻花秦艽黃酮提取液對紅三葉、紫花苜蓿和白三葉種子發(fā)芽的影響Table 2 Effects of different concentration flavonoids from feral G. straminea on seed germination of T. pratense, M. sativa and T. repens

圖1 不同濃度野生麻花秦艽龍膽苦苷和黃酮提取液對植物幼苗生長的影響Fig.1 Affects of different concentration gentiopicroside and flavonoids from feral G. straminea on the plant seedlings height 不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。The different small letters mean the significant differences at P<0.05, the same below.

圖2 不同濃度野生麻花秦艽龍膽苦苷和黃銅提取液對植物幼苗根長的影響Fig.2 Affects of different concentration gentiopicroside and flavonoids from feral G. straminea on the plant seedlings root length

圖3 不同濃度野生麻花秦艽龍膽苦苷和黃銅提取液對植物幼苗鮮重的影響Fig.3 Affects of different concentration gentiopicroside and flavonoids from feral G. straminea on the plant seedlings fresh weight

圖4 不同濃度野生麻花秦艽龍膽苦苷提取液對植物幼苗抗氧化酶活性的影響Fig.4 Affects of different concentration gentiopicroside from feral G. straminea on the plant seedlings antioxidant enzymes activity

圖5 不同濃度野生麻花秦艽黃酮提取液對植物幼苗抗氧化酶活性的影響Fig.5 Affects of different concentration flavonoids from feral G. straminea on the plant seedlings antioxidant enzymes activity

2.3 野生麻花秦艽龍膽苦苷和黃酮提取液對植物幼苗抗氧化酶活性的影響

圖4、圖5顯示：隨著龍膽苦苷提取液濃度增大，紫花苜蓿超氧化物歧化酶活性逐漸增強(qiáng)，12.60 mg/mL時其活性達(dá)最大值，且不同濃度間差異顯著(P<0.05)。白三葉和紅三葉濃度為6.30 mg/mL時超氧化物歧化酶活性最強(qiáng)。黃酮提取液隨濃度增大，紫花苜蓿超氧化物歧化酶活性逐漸增強(qiáng)，3.90 mg/mL時其活性達(dá)最大值，且不同濃度間差異顯著(P<0.05)，白三葉和紅三葉濃度為1.95 mg/mL時超氧化物歧化酶活性最強(qiáng)，濃度為0.78 mg/mL時白三葉超氧化物歧化酶活性弱于對照，濃度為3.90 mg/mL時與對照差異不顯著。

不同濃度龍膽苦苷和黃酮提取液處理下3種受體植物幼苗的過氧化物酶活性都有顯著增強(qiáng)，龍膽苦苷和黃酮提取液濃度分別為6.30和1.95 mg/mL時，過氧化物酶活性達(dá)最大值，二者在濃度分別為12.60和3.90 mg/mL時，過氧化物酶活性都要低于2.52和0.78 mg/mL，且都高于對照(P<0.05)。

龍膽苦苷和黃酮提取液濃度分別為6.30和1.95 mg/mL時，過氧化氫酶活性達(dá)最大值，二者在濃度分別為12.60和3.90 mg/mL時，過氧化氫酶活性都要低于2.52和0.78 mg/mL，且都高于對照(P<0.05)。

3 討論

種子萌發(fā)對物種更新至關(guān)重要，種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)均可反映種子發(fā)芽能力。一般情況下，發(fā)芽率與種子生活力是一致的，因此在生產(chǎn)上通常將種子的發(fā)芽率作為鑒定種子質(zhì)量的重要指標(biāo)之一；發(fā)芽指數(shù)反映了種子發(fā)芽的速率和整齊程度[27]。種子發(fā)芽率降低會降低植物在群落中的密度，種子發(fā)芽指數(shù)降低，出芽滯后，將嚴(yán)重影響植物對地上和地下資源的競爭能力，在生長季節(jié)相對短暫的區(qū)域,會直接降低植物生物量，有時會導(dǎo)致植物無法完成生活史[28-31]。種子的發(fā)芽和發(fā)芽后幼苗的建成是內(nèi)外因素相互作用的結(jié)果[32]。自然條件下，種子發(fā)芽和幼苗生長容易受到化感活性物質(zhì)的影響，使其發(fā)芽和生長受到抑制或促進(jìn)[33-35]。本研究中，3種受體植物紫花苜蓿、紅三葉和白三葉種子經(jīng)龍膽苦苷和黃酮提取液處理后，其發(fā)芽率顯著降低，且隨濃度增加，抑制作用逐漸增強(qiáng)；同時，隨提取液濃度增大，受體植物種子發(fā)芽指數(shù)下降，發(fā)芽時間延長。化感活性物質(zhì)能夠影響種子內(nèi)部物質(zhì)代謝及各種代謝關(guān)鍵酶的活性，引起種子劣變，使種子活力降低，進(jìn)而使得發(fā)芽率降低，發(fā)芽時間延遲[36-37]。同一濃度的龍膽苦苷或黃酮提取液對兩種受體植物種子萌發(fā)的抑制作用表現(xiàn)出差異性：同濃度下龍膽苦苷提取液對紅三葉發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)的化感指數(shù)都要小于白三葉和紫花苜蓿，說明龍膽苦苷對白三葉和紫花苜蓿的化感抑制作用要強(qiáng)于紅三葉。相比較而言，黃酮提取液濃度為0.78 mg/mL時對紅三葉發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)的化感指數(shù)大于白三葉和紫花苜蓿，對白三葉和紫花苜?；幸种谱饔萌跤诩t三葉，而濃度為1.95和3.90 mg/mL時，對白三葉和紫花苜蓿發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)的化感指數(shù)大于紅三葉，說明對白三葉和紫花苜?；幸种谱饔脧?qiáng)于紅三葉，證明化感作用不僅與受體植物種類有關(guān)，與供體植物本身也有關(guān)聯(lián)[38]。整體上龍膽苦苷和黃酮對紅三葉種子發(fā)芽的抑制作用要弱于白三葉和紫花苜蓿，因此，在麻花秦艽的栽培過程中，紅三葉可以作為輪作、間作或套作作物，用來緩解或解除連作效應(yīng)。

化感作用在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上有多方面的作用，近些年來，植物的化感作用和自毒作用受到世界各國科學(xué)家的重視，逐漸形成了一個新的研究領(lǐng)域[37,39-40]。化感物質(zhì)不僅能降低種子的萌發(fā)率、延長發(fā)芽時間[33-35]，對伴生植物根長、株高也表現(xiàn)出抑制作用，且隨著濃度的增加，抑制率也逐漸增高[41]。但是，化感物質(zhì)起作用需要達(dá)到一定的濃度,在自然條件下, 外來植物向土壤中釋放的化感物質(zhì)濃度只有達(dá)到了某一有效作用閾值, 才會對周圍的伴生植物產(chǎn)生抑制效果[42]。本研究證明，不同濃度的龍膽苦苷和黃酮提取液對紫花苜蓿、紅三葉及白三葉的苗高、根長和鮮重都表現(xiàn)出明顯的化感作用——抑制或促進(jìn)。龍膽苦苷濃度為2.52 mg/mL時，對苜蓿和紅三葉的苗高、根長和鮮重都表現(xiàn)出不同程度的抑制作用，此濃度下白三葉的苗高長于對照，說明對白三葉的苗高表現(xiàn)出促進(jìn)生長的作用，對其根長和鮮重仍表現(xiàn)出抑制作用。不同濃度下的龍膽苦苷提取液對苜蓿和紅三葉的鮮重影響都不顯著，三者與對照相比都顯著(P<0.05)，同樣，不同濃度下的黃酮提取液對苜蓿的鮮重影響都不顯著，三者與對照相比都顯著(P<0.05)。證明白三葉對化感脅迫的敏感性強(qiáng)于紅三葉和紫花苜蓿[43-44]。在對同一種受體植物幼苗根長和莖長的比較可以看出，龍膽苦苷和黃酮提取液對受體植物根長生長的影響明顯強(qiáng)于對莖長生長的影響, 這與前人研究結(jié)果一致[45-46]。龍膽苦苷對白三葉表現(xiàn)出萌芽抑制和幼苗生長促進(jìn)，與鐘聲等[47]對紫莖澤蘭(Eupatoriumadenophora)提取液的化感作用研究結(jié)果相符?；形镔|(zhì)主要通過莖葉淋溶、根系分泌、地上揮發(fā)和植物殘體分解釋放到外界環(huán)境中[48-49]，化感物質(zhì)進(jìn)入土壤后,在到達(dá)目標(biāo)植物之前，要經(jīng)過土壤顆粒和土壤微生物的吸附、運輸、轉(zhuǎn)化甚至降解,其結(jié)構(gòu)、有效性和活性均會發(fā)生復(fù)雜的變化，導(dǎo)致對受試植物的化感效應(yīng)出現(xiàn)相應(yīng)變化[50]。藥用植物根系分泌物的化感自毒作用[50]、根系分泌物對生態(tài)效應(yīng)的間接作用及土壤微生物區(qū)系紊亂是導(dǎo)致植物連作障礙的主要因素[51-52]。龍膽苦苷和黃酮作為藥用植物麻花秦艽的活性成分，其可能通過特定方式釋放到自然生態(tài)系統(tǒng)中，對自身的連作產(chǎn)生不良效應(yīng)、對伴生植物及輪作作物的發(fā)芽和生長產(chǎn)生抑制和毒害。

植物細(xì)胞中活性氧的清除主要是通過抗氧化酶系統(tǒng)SOD、POD、APX 和CAT以及一些抗氧化物完成的，SOD能將超氧陰離子(O2-·)自由基清除而形成H2O2，而POD和CAT可把H2O2變?yōu)镠2O，它們協(xié)調(diào)一致的作用，可使活性氧(ROS: H2O2、·OH、O2-·)維持在一個較低水平，在逆境脅迫中起到保護(hù)細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)構(gòu)、減輕有毒物質(zhì)對生活細(xì)胞的毒害、延遲或阻止細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損的作用[53-55]。但是，化感物質(zhì)引起的脅迫往往會誘導(dǎo)ROS的過量積累而使受體代謝失衡，ROS作為信號分子，參與細(xì)胞內(nèi)的抗氧化應(yīng)答，低劑量的ROS也會誘導(dǎo)抗氧化酶活性升高，以達(dá)到清除過量ROS的目的，當(dāng)ROS積累過多，受體抗氧化系統(tǒng)會遭到破壞，SOD、POD、CAT等抗氧化酶的活性受到影響[56-60]。研究表明，隨龍膽苦苷和黃酮提取液濃度增大，紫花苜蓿、紅三葉和白三葉幼苗超氧化物歧化酶、過氧化物酶和過氧化氫酶活性逐漸增強(qiáng)，受體植物幼苗體內(nèi)酶活性的增強(qiáng)可能是其受到化感脅迫后，體內(nèi)過氧化產(chǎn)物增多導(dǎo)致應(yīng)激機(jī)制啟動，從而誘導(dǎo)受體植物抗氧化能力的升高[61]，當(dāng)濃度高于6.30或1.95 mg/mL時，紅三葉和白三葉幼苗體內(nèi)SOD、POD、CAT活性又開始下降，使其不能正常發(fā)揮作用，不能有效清除幼苗在化感脅迫下生成的ROS，隨著ROS在體內(nèi)的累積，植物受害逐漸加重，最后導(dǎo)致植物的生長受到抑制甚至死亡[62]，而紫花苜蓿幼苗體內(nèi)抗氧化酶活性繼續(xù)增強(qiáng)，可能是不同植物對化感脅迫的耐受能力不同，紫花苜蓿對化感脅迫的耐受能力要強(qiáng)于紅三葉和白三葉?；形镔|(zhì)可以通過化感脅迫作用調(diào)節(jié)抗氧化酶基因-ZmSOD，ZmCAT，ZmPOD的表達(dá)，增強(qiáng)或抑制抗氧化酶的活性, 但是不同抗氧化酶基因的表達(dá)對不同化感物質(zhì)的脅迫效應(yīng)應(yīng)答有所差異[63]。

4 結(jié)論

本試驗研究了中草藥野生麻花秦艽中龍膽苦苷和黃酮提取液對受體植物種子發(fā)芽和幼苗生理特性的影響，結(jié)果表明二者對受體植物的種子發(fā)芽，幼苗的苗高、根長、鮮重以及3種抗氧化酶活性都有不同程度的影響-或抑制或促進(jìn)，且白三葉對化感脅迫的敏感性強(qiáng)于紫花苜蓿和紅三葉；不同牧草對化感脅迫的耐受能力不同，紫花苜蓿對化感脅迫的耐受能力強(qiáng)于紅三葉和白三葉。在自然生態(tài)系統(tǒng)中，野生麻花秦艽中龍膽苦苷和黃酮是以何種方式釋放到無機(jī)環(huán)境中還需進(jìn)一步研究，此研究為建立麻花秦艽輪作、間作及套作體系進(jìn)而緩解并解除其在栽培過程中的連作障礙提供了一定的理論依據(jù)，為充分利用這一中草藥資源奠定基礎(chǔ)。

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Effects of active allelochemicals from feral Gentiana straminea on the seed germination and seedling physiological properties of forages

DING Chun-Fa, WEI Xiao-Hong*, WANG Fang-Lin

CollegeofLifeScienceandTechnology,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China

Gentiopicroside and flavonoids were extracted from feralGentianastramineausing ultrasonic extraction methods and then the extracts were applied at different concentrations to three forages,Medicagosativa,TrifoliumpratenseandT.repens. The forages’ seed germination and seedling physiological properties (seedling height, root length, fresh weight and the activities of SOD, POD and CAT) were measured to analyze the allelopathy and antioxidation effects of feralG.straminea. In general, the gentiopicroside and flavonoid extracts showed allelopathic inhibitory effects on seed germination and seedling growth in the selected forages. The exception was gentiopicroside at 2.52 mg/mL, which increased seedling height inT.repens. The effects of gentiopicroside and flavonoid extracts on the activity of anti-oxidative enzymes varied with extract concentration. Specifically, both POD and CAT activities in seedlings of the three forages peaked when the concentrations of gentiopicroside and flavonoid extracts were 6.30 and 1.95 mg/mL respectively. When the concentrations of gentiopicroside and flavonoid extracts were 12.60 and 3.90 mg/mL respectively, SOD activity inM.sativaseedlings reached their maximums (22.971 and 25.013 U/g respectively), while inT.pretenseandT.repensthese activities peaked when the concentrations of gentiopicroside and flavonoid extracts were 6.30 and 1.95 mg/mL respectively. In conclusion, the sampled plants differ in their tolerance to allelopathic stress andM.sativashows a greater tolerance than eitherT.pretenseandT.repens.

feralGentianastraminea； gentiopicroside； flavonoids； allelopathic inhibition； antioxidant enzymes

10.11686/cyxb2016181

http://cyxb.lzu.edu.cn

2016-05-03；改回日期：2016-06-13

國家自然基金項目(31560663)和甘肅省自然基金項目(145RJZA196)資助。

丁春發(fā)(1982-)，男，甘肅天水人，在讀碩士。E-mail:1260201460@qq.com*通信作者Corresponding author. E-mail:weixh@gsau.edu.cn

丁春發(fā), 魏小紅, 王芳琳. 野生麻花秦艽中化感活性物質(zhì)對牧草萌發(fā)及生理特性的影響. 草業(yè)學(xué)報, 2017, 26(4): 150-161.

DING Chun-Fa, WEI Xiao-Hong, WANG Fang-Lin. Effects of active allelochemicals from feral Gentiana straminea on the seed germination and seedling physiological properties of forages. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(4): 150-161.