魚藤素斷環(huán)結構氨基酸衍生物的合成及其抗腫瘤活性

孫婧雯, 姜志輝, 吳碧娟, 譚翠雯, 吳新榮*

(1. 華南理工大學 食品科學與工程學院，廣東 廣州 510641；2. 廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院 藥學部，廣東 廣州 510010)

·研究論文·

魚藤素斷環(huán)結構氨基酸衍生物的合成及其抗腫瘤活性

孫婧雯1,2, 姜志輝2, 吳碧娟2, 譚翠雯2, 吳新榮1,2*

(1. 華南理工大學 食品科學與工程學院，廣東 廣州 510641；2. 廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院 藥學部，廣東 廣州 510010)

采用化學法，以異戊烯醛和2,4-二羥基苯甲醛為起始原料，經烯醛加成和醛胺縮合反應合成了4種新的魚藤素斷環(huán)結構氨基酸衍生物(3a～3d)，其結構經1H NMR,13C NMR和LC-MS表征。采用CCK8法將3a～3d作用于H1299肺癌細胞和HBE正常細胞，對其抗腫瘤活性和毒性進行初步研究。結果表明：3a～3d對肺癌H1299細胞增殖表現(xiàn)出不同程度的抑制作用，均呈現(xiàn)時間濃度依賴性。與魚藤素相比，3a～3d的抗腫瘤活性下降， 3d的活性最好，IC50為655.8±34.7μmol·L-1，但對HBE正常肺細胞的毒性明顯小于魚藤素。

異戊烯醛; 2,4-二羥基苯甲醛; 魚藤素; 氨基酸衍生物; 合成; 抗腫瘤活性

肺癌是目前世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，其中80%～85%為非小細胞肺癌(NSCLC)[1]。吸煙是引起肺癌的主要環(huán)境因素，遺傳、環(huán)境污染及煤礦建筑等行業(yè)的職業(yè)暴露和飲食習慣也是導致肺癌的重要原因。近年來，肺癌的發(fā)病率不斷升高，對肺癌進行有效的治療和預防已成為我國癌癥研究中一個急迫的方向。經手術、放療和化療等綜合治療后，其5年生存率仍低于15%[2]。因此，開發(fā)低毒可持續(xù)的抗腫瘤藥物對肺癌的治療具有重大意義。

Scheme 1

Chart 1

魚藤素(Deguelin, Chart 1)是一種天然異黃酮類化合物，可以從豆科植物魚藤和灰葉屬的非洲山毛豆中提取獲得[3]。魚藤素起初被用作毒魚劑，后被發(fā)現(xiàn)對肺癌、乳腺癌、胰腺癌、淋巴癌、骨髓瘤及肝癌等多種癌癥具有化學預防和化學治療作用[4-5]，是一種具有巨大潛力的抗腫瘤前藥。盡管實驗表明，魚藤素在有效濃度范圍內有良好的抗腫瘤活性。但當其劑量大于有效濃度，或作用時間過長時，具有一定的毒性，實驗小鼠會出現(xiàn)類似帕金森病的癥狀[6]。對魚藤素進行結構改造，增強其抗腫瘤活性或水溶性，降低其毒性，直接或間接降低其給藥濃度，從而使毒副作用減小是魚藤素抗腫瘤研究的一個重要方向。

氨基酸是一種生命活動的基本物質，具有良好的生物相容性和細胞親和性，氨基酸的引入可以提高活性物質對靶向細胞的選擇，更容易通過細胞膜，從而提高其生物利用度[7]，為尋求高效低毒的抗腫瘤藥物開辟途徑。目前國內有大量天然藥物因水溶性問題限制了其臨床應用，長春堿、樺木酸、3-氧代齊墩果酸、喜樹堿、甘草酸及甘草次酸是代表性的化合物，在自然界中分布較廣，個別化合物的衍生藥物已進入Ⅰ期臨床，但由于水溶性和一些毒副作用，限制了它們的進一步研究應用。氨基酸、短肽對天然藥物活性基團進行修飾，不僅改善它們的水溶性問題，而且提高了其抗腫瘤和抗炎效果[8]。

本課題組在對魚藤素進行結構改造的過程中發(fā)現(xiàn)，魚藤素具有獨特的剛性五環(huán)結構，由于空間位阻的存在，不打破其剛性結構，直接與活性物質相連十分困難。基于以上考慮，本文參照魚藤素改造的相關研究[9-11]，選取魚藤素活性部位對其進行合成，并與具有良好的生物相容性和細胞親和性的氨基酸相連以期合成活性良好的目標物。以異戊烯醛和2，4-二羥基苯甲醛為原料，先后經加成和縮合反應合成了4種新型的5-甲氧基-2,2-二甲基-二氫-苯并吡喃-6-亞甲基氨基酸衍生物(3a～3d, Scheme 1)，其結構經1H NMR,13C NMR和LC-MS表征。并對化合物的抗腫瘤活性和毒性進行了初步驗證。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

AVANCE III HD 600型核磁共振儀(DMSO-d6為溶劑，TMS為內標)；HPLC-6400型三級四級桿液質聯(lián)用儀；ELX800型酶標儀。

H1299肺癌細胞和HBE正常肺細胞，廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院醫(yī)學實驗科；2,4-二羥基苯甲醛(批號Q26415，純度99%)和硫酸二甲酯(批號Y5050，純度99%)，山東西亞化學工業(yè)有限公司；異戊烯醛(批號CK200069，純度98%)，安耐吉化學；氰基硼氫化鈉(批號C10030449，純度95%)，上海麥克林生化科技有限公司；亮氨酸(批號101528664，純度99.5%)、苯丙氨酸(批號1001465864，純度99%)、異亮氨酸(批號101646063，純度98%)和蛋氨酸(批號101604328，純度98%)，美國Sigma公司；其余所用試劑均為分析純。

1.2 合成

(1) 1的合成[12]

在反應瓶中依次加入甲醇150 mL， 2,4-二羥基苯甲醛1.0 g(6.71 mmol)和氫氧化鈣0.745 g(10.06 mmol)，攪拌使其溶解；待其形成堿性體系(30 min)，緩慢滴加異戊烯醛3.045 g(36.2 mmol)，于室溫反應12 h。加入1 mol·L-1鹽酸淬滅反應，調至pH 1～2，蒸除甲醇，水相用乙酸乙酯(3×150 mL)萃取，萃取液依次用飽和食鹽水(2×100 mL)洗滌，無水硫酸鈉干燥，蒸干后經快速硅膠柱層析[洗脫劑：A=V(石油醚) ∶V(乙酸乙酯)=9 ∶1]純化得黃色油狀液體1 0.68 g，產率50%；1H NMR(600 MHz, CDCl3)δ: 11.62(s, 1H), 9.63(s, 1H), 7.37(m, 1H), 6.65(m, 1H), 6.40(d,J=8.5 Hz, 1H), 5.74(m, 1H), 1.44(s, 6H);13C NMR(100.63 MHz)δ: 194.5, 160.6, 158.7, 134.7, 128.6, 115.2, 115.1, 109.4, 108.8, 78.2, 28.4; LC-MSm/z: 203.1{[M-H]+}。

(2) 2的合成[12]

在反應瓶中加入碳酸鉀2.43 g(17.6 mmol)，氮氣保護，緩慢注入1 1.80 g(8.8 mmol)的無水丙酮(15 mL)溶液，滴加硫酸二甲酯1.67 g(13.2 mmol)，滴畢，氮氣保護下于室溫反應20 h。加入蒸餾水20 mL淬滅反應，蒸除丙酮，水相用1 mol·L-1鹽酸酸化至pH 2～3，用乙酸乙酯(3×100 mL)萃取，萃取液依次用飽和食鹽水(2×50 mL)洗滌，無水Na2SO4干燥，蒸干，粗產物經快速硅膠柱層析(洗脫劑：A=10 ∶1)純化得黃色油狀液體2 1.5 g，產率78%；1H NMR(600 MHz, CDCl3)δ: 10.18(s, 1H), 7.66(d,J=8.6 Hz, 1H), 7.27(s, 1H), 6.63(dd,J=31.4 Hz, 9.3 Hz, 2H), 5.86(m, 1H), 3.91(s, 3H), 1.47(s, 6H);13C NMR(100.63 MHz)δ: 188.3, 160.0, 159.9, 130.5, 129.8, 122.5, 115.9, 114.4, 113.4, 64.4, 28.2; LC-MSm/z: 219.2{[M+H]+}。

(3) 3a～3d的合成

在反應瓶中依次加入2 0.22 g(1 mmol)，氰基硼氫化鈉0.13 g(2 mmol)，亮氨酸0.26 g(2 mmol)和甲醇150 ml，攪拌下回流(60 ℃)反應12 h。蒸除甲醇，水相用乙酸乙酯(3×150 mL)萃取，萃取液依次用飽和食鹽水(2×100 mL)洗滌，無水Na2SO4干燥，蒸除溶劑，殘余物經硅膠柱層析(洗脫劑：A=3 ∶1)純化得淡黃色固體3a 0.17 g。

用類似方法合成3b～3d。

3a： 產率52%;1H NMR(600 MHz)δ: 7.18(d,J=8.4 Hz, 1H), 6.53(t,J=8.6 Hz, 2H), 5.78(d,J=10.0 Hz, 1H), 3.77(d,J=13.0 Hz, 2H), 3.70(s, 3H), 3.62(d,J=13.1 Hz, 2H), 3.02(t,J=7.1 Hz, 1H), 2.50(dt,J=3.5 Hz, 1.7 Hz, 1H), 1.78(dp,J=13.4 Hz, 6.7 Hz, 1H), 1.35(s, 6H), 1.23(s, 1H), 0.84(d,J=6.6 Hz, 3H), 0.79(d,J=6.6 Hz, 3H);13C NMR(151 MHz, DMSO-d6)δ: 175.35, 154.76, 153.29, 131.38, 130.58, 117.01, 114.65, 112.22, 76.09, 62.74 , 60.70, 45.44, 41.95, 40.34, 40.13, 39.99, 39.85, 39.71, 39.57, 27.82, 24.95, 23.22, 22.73; LC-MSm/z: 334.9{[M+H]+}。

3b: 淡黃色固體，產率51%；1H NMR(600 MHz)δ: 7.20(m, 4H), 7.13(t,J=6.7 Hz, 1H), 6.95(d,J=8.1 Hz, 1H), 6.45(dd,J=20.2 Hz, 9.1 Hz, 2H), 5.74(d,J=9.9 Hz, 1H), 3.61(d,J=13.0 Hz, 2H), 3.54(s, 3H), 3.42(d,J=13.0 Hz, 1H), 3.16(t,J=6.4 Hz, 1H), 2.98(dd,J=13.5 Hz, 4.8 Hz, 1H), 2.73(dd,J=13.4 Hz, 8.1 Hz, 1H), 2.50(m, 1H), 1.33(s, 6H);13C NMR(151 MHz)δ: 176.33, 154.53, 152.82, 140.43, 131.21, 130.12, 129.80, 128.24, 126.10, 124.88, 117.04, 114.56, 111.98, 75.96, 64.34, 62.49, 46.11, 40.32, 40.15, 40.05, 39.83, 39.83, 39.76, 39.50, 27.85; LC-MSm/z: 368.2{[M+H]+}。

3c: 黃色固體，產率55%;1H NMR(600 MHz)δ: 7.15(d,J=8.4 Hz, 1H), 6.48(dd,J=9.0 Hz, 6.9 Hz, 2H), 5.74(d,J=10.0 Hz, 1H), 3.70(d,J=13.0 Hz, 2H), 3.56(d,J=13.0 Hz, 4H), 2.84(d,J=4.8 Hz, 1H), 2.46(dt,J=3.5 Hz, 1.7 Hz, 2H), 1.31(s, 6H), 0.80(d,J=6.8 Hz, 3H), 0.75(t,J=7.4 Hz, 3H);13C NMR(151 MHz)δ: 154.78, 153.20, 131.33, 130.55, 117.02, 114.62, 112.20, 76.07, 66.65, 62.73, 46.26, 40.35, 40.27, 40.13, 40.00, 39.92, 39.71, 39.57, 37.42, 27.84, 25.67, 16.28, 12.13; LC-MSm/z: 333.3{[M+H]+}。

3d: 白色固體，產率61%;1H NMR(600 MHz)δ: 7.18(d,J=8.4 Hz, 1H), 6.53(d,J=3.1 Hz, 1H), 6.51(d,J=4.7 Hz, 1H), 5.77(d,J=9.9 Hz, 1H), 3.75(m, 1H), 3.70(s, 3H), 3.61(m, 4H), 3.03(t,J=6.0 Hz, 1H), 2.52(m, 3H), 2.00(s, 3H), 1.35(s, 6H);13C NMR(151 MHz)δ: 154.73, 153.20, 131.33, 130.56, 117.02, 114.62, 112.18, 76.07, 62.75, 61.75, 45.78, 40.37, 40.16, 40.09, 39.90, 39.81, 39.68, 39.54, 32.47, 30.66, 27.85, 15.05; LC-MSm/z: 352.2{[M+H]+}。

1.3 抗腫瘤活性及毒性測定

參照文獻方法[13]，采用CCK8(Cell Counting Kit-8)法測定化合物的抗腫瘤活性。取對數(shù)生長期的H1299肺癌細胞和HBE正常肺細胞，以5×104個/mL的密度接種于96孔板，于5%CO2， 37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，待細胞貼壁后，分別加入不同濃度(0.5 mmol·L-1, 1.0 mmol·L-1, 1.5 mmol·L-1, 2.0 mmol·L-1和2.5 mmol·L-1)待測化合物3a～3d，作用于H1299細胞評價其抗腫瘤活性，作用于HBE細胞評價其毒性。每個濃度設5個平行組，并設不加細胞和藥液的培養(yǎng)基空白組和只加細胞不加藥的對照組，培養(yǎng)24 h, 48 h和72 h，以酶標儀分別測其450 nm處的吸光度值(A)，實驗重復3次。按公式[(A藥液-A空白)/(A對照-A空白)×100%]計算其存活率，使用GraphPad Prism 6軟件計算72 h的半數(shù)抑制濃度(IC50)，并以其存活率繪制時間劑量圖。

2 結果與討論

2.1 合成

異戊烯醛與2,4-二羥基苯甲醛在堿催化下發(fā)生加成反應合成1，對該步反應條件進行優(yōu)化。結果顯示在催化劑用量為2,4-二羥基苯甲醛的1.5 eq.，反應效果較佳。2的醛基與氨基酸的氨基在氰基硼氫化鈉催化下進行反應，合成3a～3d。該步反應雖然理論上醛基與甲氧基共軛，但由于處于鄰位增大其反應活性，并且在反應過程中加熱回流，延長反應時間，實際縮合效果不錯。

2.2 抗腫瘤活性

3a～3d的抗腫瘤活性篩選結果見表1。由表1可見，經過結構改造所得化合物3a～3d的IC50分別為901.0±7.1, 704.1±34.9, 682.8±38.4, 655.8±34.7 μmol·L-1，遠大于魚藤素(2.0±0.21 μmol·L-1)，說明其抗腫瘤活性降低。

表1 化合物對H1299的半數(shù)抑制濃度

濃度分別為0 mmol·L-1, 0.5 mmol·L-1, 1.0 mmol·L-1, 1.5 mmol·L-1, 2.0 mmol·L-1和2.5 mmol·L-1的3a～3d作用于H1299細胞24 h, 48 h和72 h后，細胞存活率見圖1。由圖1可見，與對照組相比，3a～3d作用于H1299肺癌細胞對增殖的抑制作用均均呈時間依賴性和濃度依賴性。本課題組以往的實驗數(shù)據(jù)表明，魚藤素處理H1299細胞72 h，在10～2 000 nmol·L-1濃度范圍，細胞的增殖抑制率為20.1%～54.1%，其半數(shù)抑制濃度約為2 μmol·L-1[14]。

所合成的4種魚藤素斷環(huán)結構與氨基酸的衍生物，對H1299肺癌細胞有不同程度的抑制作用，均表現(xiàn)出了時間濃度依賴性。計算其半數(shù)抑制濃度，相比魚藤素而言，其抗腫瘤活性下降。該文所進行的結構改造研究保留了魚藤素一半的結構，雖與氨基酸相連，活性仍喪失較大。研究表明，A環(huán)中的兩個甲氧基對其活性同樣非常關鍵[11]，在今后的改造中，應嘗試保留其A、D、E環(huán)，打開BC環(huán)，這樣既打破其剛性結構，降低合成難度，又可保證其活性。

2.3 毒性測定

毒性成為限制魚藤素的一個很重要的因素，文獻報道，1 μmol·L-1魚藤素作用于HBE正常細胞，其抑制率達到40% 左右[9]，其對正常細胞毒性大，限制其抗腫瘤應用。本文將化合物3a～3d作用于HBE細胞，結果見圖2。由圖2可見，3a～3d對HBE細胞的增殖物明顯抑制，在低劑量時，有促進其生長的作用。在對肺癌H1299細胞的抑制率50%左右的時候，在24 h和48 h時對其增殖有促進作用，72 h時出現(xiàn)輕微抑制。在對肺癌H1299細胞的抑制率達到80%以上時，對HBE細胞的抑制在20%左右，可判定其毒性大大降低，具有應用于腫瘤治療的潛力。

c(3a)/mmol·L-1

c(3b)/mmol·L-1

c(3c)/mmol·L-1

c(3d)/mmol·L-1

設計并合成了4種魚藤素斷環(huán)結構氨基酸衍生物，其對腫瘤細胞的增殖有不同程度抑制作用。與魚藤素比，改造后的化合物對腫瘤細胞的抑制活性降低，但其對正常肺細胞的毒性也大大降低。還目標化合物的生物利用度、神經毒性及體內活性有待進一步研究。

c(3a)/mmol·L-1

c(3b)/mmol·L-1

c(3c)/mmol·L-1

c(3d)/mmol·L-1

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《合成化學》再次入選中國科技核心期刊

根據(jù)中國科學技術信息研究所發(fā)布的最新中國科技論文統(tǒng)計結果，《合成化學》被“中國科學論文與引文數(shù)據(jù)庫”再次編入《2016年中國科技核心期刊目錄(自然科學卷)》，有效期至2017年12月，這也是《合成化學》連續(xù)第12次入選中國科技核心期刊。

《合成化學》編輯部

Synthesis and Antitumor Activities of Ring-truncated Deguelin-amino Acid Conjugates

SUN Jing-wen1,2, JIANG Zhi-hui2, WU Bi-juan2, TAN Cui-wen2, WU Xin-rong1,2*

(1. School of Light Industry and Food, South China University of Technology, Guangzhou 510641, China 2. Department of Pharmacy, Genenral Hospital of Guangzhou Military Command of PLA, Guangzhou 510010, China)

Four novel ring-truncated deguelin-amino acid conjugates(3a～3d) were synthesized by olefine aldehyde addition and aldimine condensation from 3-methylcrotonaldehyde and 2,4-dihydroxybenzaldehyde. The structures were characterized by1H NMR,13C NMR and LC-MS. The anticancer effects and toxicities were investigated by CCK8 method. The results showed that 3a～3d exhibited good inhibition activities and time dose dependence. Although compared with deguelin, antitumor activities of 3a～3d declined, IC50of 3d which has the best activity was 655.8±34.7 μmol·L-1, however their toxicity towards immortalized HBE lung cell were also settled.

3-methylcrotonaldehyde; 2,4-dihydroxybenzaldehyde; deguelin; amino acid conjugate; synthesis; antitumor activity

2016-12-29；

2017-02-27

廣東省科技計劃項目(2011A080300004)； 廣州市科技計劃項目(201509010012)

孫婧雯(1991-)，女，漢族，山東濱州人，碩士研究生，主要從事魚藤素的合成及抗腫瘤活性的研究。 E-mail: shero1121@126.com

吳新榮，教授，副主任藥師， Tel. 020-36653476, E-mail: gzwxrong@yahoo.com

O621.3； O629.71

A

10.15952/j.cnki.cjsc.1005-1511.2017.04.16333