復(fù)方腫節(jié)風(fēng)溶液抗炎和平喘作用的研究

梁正敏，張明昕，彭健波，楊善忠，唐廷崇，賴(lài)勝基，何家康*

(1.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530005；2.廣西獸藥制劑工程技術(shù)研究中心，廣西南寧 530003)

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獸醫(yī)臨床

復(fù)方腫節(jié)風(fēng)溶液抗炎和平喘作用的研究

梁正敏1，張明昕1，彭健波2，楊善忠2，唐廷崇1，賴(lài)勝基1，何家康1*

(1.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530005；2.廣西獸藥制劑工程技術(shù)研究中心，廣西南寧 530003)

為考察復(fù)方腫節(jié)風(fēng)溶液的抗炎平喘作用，進(jìn)行了該藥的體外抗炎和體內(nèi)平喘作用研究。用脂多糖(LPS)誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞建立體外炎癥模型，MTT法檢測(cè)復(fù)方腫節(jié)風(fēng)對(duì)RAW 264.7細(xì)胞活力的影響，ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1 和IL-6 濃度，Griess法檢測(cè)NO水平。體內(nèi)試驗(yàn)通過(guò)卵清蛋白(OVA)致敏、激發(fā)Wistar大鼠建立哮喘模型，并灌服不同劑量(12、6、3 g/kg)的復(fù)方腫節(jié)風(fēng)溶液。ELISA檢測(cè)大鼠血清中IL-4、IL-17、IFN-γ及IgE水平；瑞特-吉姆薩染色血涂片，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)血液白細(xì)胞總數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)，肺組織HE染色，觀(guān)察肺組織病理變化。體外抗炎試驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)方腫節(jié)風(fēng)溶液在10 μg/mL～40 μg/mL的濃度范圍內(nèi)對(duì)RAW 264.7細(xì)胞活力無(wú)顯著影響。10、20、40 μg/mL的復(fù)方腫節(jié)風(fēng)溶液能不同程度抑制LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α、IL-6、IL-1和NO的水平(P<0.05)，并存在一定的劑量依賴(lài)關(guān)系。體內(nèi)平喘試驗(yàn)結(jié)果表明，與哮喘模型組相比，復(fù)方腫節(jié)風(fēng)溶液能明顯下調(diào)血清中IL-4、IL-17和IgE的高分泌，上調(diào)血清中IFN-γ水平(P<0.05)。表明復(fù)方腫節(jié)風(fēng)溶液抗炎平喘作可能通過(guò)抑制相關(guān)炎癥因子的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

復(fù)方腫節(jié)風(fēng)溶液；小鼠單核-巨噬細(xì)胞；抗炎；平喘；炎癥因子

復(fù)方腫節(jié)風(fēng)溶液系由腫節(jié)風(fēng)、苦玄參兩味中藥，經(jīng)加工精制而成的新型中藥復(fù)方口服溶液，其處方來(lái)源寓意于《中華人民共和國(guó)藥典》中“萬(wàn)通炎康片”的立方宗旨，具有疏風(fēng)清熱、解毒消腫的功效；用于外感風(fēng)熱所致的咽部紅腫，牙齦紅腫、瘡瘍腫痛；急慢性咽炎、扁桃體炎、牙齦炎、瘡癤等證候者[1]。本研究采用LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞建立體外炎癥模型，以O(shè)VA致敏、激發(fā)建立體內(nèi)哮喘模型，探討復(fù)方腫節(jié)風(fēng)溶液的抗炎平喘作用，為該制劑的臨床應(yīng)用提供藥效學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 小鼠單核-巨噬細(xì)胞系RAW 264.7細(xì)胞，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù)。Wistar大鼠，雌性，36只，SPF級(jí)，體重200 g±20 g，購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK桂2013-0002，試驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.1.2 試劑 RPMI-1640 培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、新生牛血清、0.5 g/L胰蛋白酶-EDTA，均為Gibco公司產(chǎn)品；MTT、L-谷氨酰胺、LPS和OVA，均為Sigma產(chǎn)品；活性氧試劑盒，購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；TNF-a 、IL-l、IL-6、IL-4、IL-17、IFN-γ和IgE ELISA檢測(cè)試劑盒，均購(gòu)自欣博盛生物科技有限公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)購(gòu)自索萊寶生物科技有限公司；二甲基亞砜(DMSO)，購(gòu)自楚杰生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 藥品制備 復(fù)方腫節(jié)風(fēng)溶液制備：取腫節(jié)風(fēng)、苦玄參二味中藥，加水煎煮2次，每次2 h，合并煎液，濾過(guò)，濾液濃縮至相對(duì)密度為1.10～1.15(75℃)的清膏，冷卻，加入3倍量乙醇，攪勻，靜置24 h，取上清液回收乙醇，濃縮至相對(duì)密度為1.10～1.20(70℃)的清膏，加水至約1 000 mL，攪勻，冷藏(4℃～7℃)24 h，濾過(guò)，濾液加適量的防腐劑，加水至1 000 mL，攪勻，灌裝，滅菌，即得(每1 mL相當(dāng)于原生藥1.2 g)。經(jīng)檢驗(yàn)，每1 mL口服液含有效成分迷迭香酸0.15 mg。

1.2.2 體外抗炎試驗(yàn)

1.2.2.1 復(fù)方腫節(jié)風(fēng)溶液對(duì)RAW 264.7細(xì)胞活力的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW 264.7細(xì)胞，調(diào)整濃度為1×l06個(gè)/mL，每孔100 μL接種于96孔培養(yǎng)板，37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜。次日棄去上清液，每孔加入200 μL用培養(yǎng)液稀釋的不同濃度復(fù)方腫節(jié)風(fēng)溶液(10、20、40 μg/mL，以腫節(jié)風(fēng)有效成分迷迭香酸計(jì))預(yù)處理1 h，加入10 μL終濃度為10 μg/mL的LPS，空白對(duì)照組加入200 μL培養(yǎng)液，LPS對(duì)照組加入200 μL 10 μg/mL的LPS。每組設(shè)定6個(gè)平行孔，培養(yǎng)12、24、48 h。每孔加20 μL MTT溶液，37℃ 孵育4 h。棄去上清液，每孔加入100 μL DMSO，用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD 490 nm值。

1.2.2.2 Griess法測(cè)定細(xì)胞上清液中的NO水平 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW 264.7細(xì)胞，調(diào)整濃度為1×l06個(gè)/mL，每孔400 μL，接種于24孔培養(yǎng)板，37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜。設(shè)空白對(duì)照組，LPS對(duì)照組，高(40 μg/mL)、中(20 μg/mL)、低(10 μg/mL)劑量復(fù)方腫節(jié)風(fēng)溶液組。棄去上清液，藥物組加入400 μL高、中、低劑量的復(fù)方腫節(jié)風(fēng)溶液預(yù)處理1 h，加入10 μL終濃度為10 μg/mL的LPS，空白對(duì)照組加入400 μL培養(yǎng)液，LPS對(duì)照組加入400 μL 10 μg/mL的LPS。培養(yǎng)4、8、24、48 h后終止培養(yǎng)，收集細(xì)胞上清液，用于NO測(cè)定。測(cè)定方法：于96孔板中每孔加入50 μL細(xì)胞上清液，分別加入 50 μL Griess Reagent Ⅰ和50 μL Griess Reagent Ⅱ，微振蕩搖勻，避光反應(yīng)10 min，用酶標(biāo)儀測(cè)OD450 nm值，用亞硝酸鈉制備不同濃度標(biāo)準(zhǔn)液，最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程換算NO釋放量。

1.2.2.3 ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清液中的TNF-α、IL-l、IL-6含量 試驗(yàn)處理同1.2.2.2，復(fù)方腫節(jié)風(fēng)溶液作用細(xì)胞24 h后收集細(xì)胞上清液，置-80℃保存用于TNF-α、IL-l、IL-6濃度測(cè)定，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.2.3 體內(nèi)平喘試驗(yàn)

1.2.3.1 哮喘模型建立與分組處理 把36只Wistar大鼠隨機(jī)分為6組，每組6只，分別為空白對(duì)照組、哮喘模型組、復(fù)方腫節(jié)風(fēng)溶液高、中、低劑量組和地塞米松藥物對(duì)照組。大鼠于干燥、通風(fēng)、安靜的環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后進(jìn)行試驗(yàn)。模型組和各治療組于試驗(yàn)的第1、8天腹腔注射1 mL 100 g/L OVA(含氫氧化鋁佐劑)致敏大鼠，2周后用10 g/L OVA溶液霧化吸入激發(fā)大鼠，每天1次，每次30 min，連續(xù)激發(fā)7 d，空白對(duì)照組以生理鹽水代替OVA。以出現(xiàn)呼吸急促、口唇發(fā)紺、腹肌痙攣、點(diǎn)頭呼吸及安靜爬臥等表現(xiàn)為哮喘模型誘發(fā)成功。

各組哮喘模型誘發(fā)成功后，于試驗(yàn)第15天開(kāi)始給藥，復(fù)方腫節(jié)風(fēng)溶液高、中、低劑量組分別以12、6、3 g/kg(以原生藥計(jì))灌服，地塞米松按3 mg/kg腹腔注射，空白對(duì)照組和模型對(duì)照組注射等量生理鹽水。每天1次，連續(xù)給藥7 d。最后一次激發(fā)24 h后取樣，剪尾采血做血涂片，瑞特-吉姆薩染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)白細(xì)胞總數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)。眼球采血分離血清用于細(xì)胞因子和抗體檢測(cè)，肺組織于40 g/L多聚甲醛溶液中固定，經(jīng)脫水、石蠟包埋，HE染色。

1.2.3.2 ELISA檢測(cè)血清中IL-4、IL-17、IFN-γ和IgE含量 ELISA檢測(cè)血清中IL-4、IL-17、IFN-γ和IgE的水平，按照ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 用SPSS17.0軟件進(jìn)行分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素ANOVA分析及t檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 體外抗炎作用

2.1.1 復(fù)方腫節(jié)風(fēng)溶液對(duì)RAW164.7細(xì)胞增殖的影響 復(fù)方腫節(jié)風(fēng)溶液分別作用12 h和24 h時(shí)，與空白對(duì)照組相比，LPS對(duì)照組細(xì)胞增殖受到一定程度的抑制,但差異不顯著，中、高劑量復(fù)方腫節(jié)風(fēng)溶液顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖(P<0.05)；而復(fù)方腫節(jié)風(fēng)溶液作用48 h后，與空白對(duì)照組相比,復(fù)方腫節(jié)風(fēng)溶液組增殖能力有所降低(表1)，這可能與LPS刺激細(xì)胞誘發(fā)炎癥有關(guān)。

2.1.2 復(fù)方腫節(jié)風(fēng)溶液對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞釋放NO的影響 與空白對(duì)照組相比，LPS刺激導(dǎo)致細(xì)胞釋放NO水平極顯著升高(P<0.01)；而與LPS對(duì)照組相比，復(fù)方腫節(jié)風(fēng)溶液能夠極顯著抑制NO的釋放(P<0.01)，且存在明顯的劑量依賴(lài)關(guān)系。表明復(fù)方腫節(jié)風(fēng)溶液可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞釋放NO的水平(表2)。這可能是其發(fā)揮抗炎作用的機(jī)制之一。此外，本研究發(fā)現(xiàn)LPS刺激細(xì)胞8 h時(shí)NO水平最高，在24 h時(shí)有所下降，這可能與細(xì)胞本身的免疫調(diào)節(jié)作用有關(guān)。

表1 復(fù)方腫節(jié)風(fēng)溶液對(duì)RAW 264.7細(xì)胞增殖的影響

注：*表示與空白對(duì)照組比較差異顯著(P<0.05)；**表示與空白對(duì)照組比較差異極顯著(P<0.01)。

Note：*indicates siginificant difference compared with normal control group (P<0.05);**indicates extremely siginificant difference compared with normal control group (P<0.01).

表2 復(fù)方腫節(jié)風(fēng)溶液對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞釋放NO的影響

注：*表示與LPS對(duì)照組比較差異顯著(P<0.05)；**表示與LPS對(duì)照組比較差異極顯著(P<0.01)。

Note：*indicates siginificant difference compared with LPS control group (P<0.05);**indicates extremely siginificant difference compared with LPS control group (P<0.01).

2.1.3 復(fù)方腫節(jié)風(fēng)溶液對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞分泌IL-1、IL-6 和TNF-α的影響 與空白對(duì)照組相比，LPS對(duì)照組IL-1、IL-6和 TNF-α水平顯著升高，與LPS對(duì)照組比較差異極顯著(P<0.01)，高、中、低劑量復(fù)方腫節(jié)風(fēng)溶液不同程度地抑制了IL-1、IL-6和 TNF-α的分泌。其中以高劑量組的抑制作用表現(xiàn)最優(yōu)(表3)。表明復(fù)方腫節(jié)風(fēng)溶液可明顯降低LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞分泌IL-1、IL-6 和TNF-α水平。

2.2 體內(nèi)平喘作用

2.2.1 大鼠哮喘模型的建立 本研究建立大鼠哮喘模型的致敏原為卵白蛋白(OVA)，以氫氧化鋁為佐劑，致敏方式為腹腔注射；采用超聲霧化吸入OVA的方式進(jìn)行激發(fā)。連續(xù)激發(fā)14 d后，模型組和復(fù)方腫節(jié)風(fēng)溶液高、中、低劑量組、地塞米松藥物對(duì)照組出現(xiàn)煩躁不安、呼吸急促、頻繁搔癢、抓鼻、腹肌痙攣、點(diǎn)頭呼吸及扎堆趴臥等癥狀，表明本試驗(yàn)成功建立了大鼠哮喘模型。而大鼠通過(guò)復(fù)方腫節(jié)風(fēng)溶液和地塞米松治療后，觀(guān)察到上述癥狀顯著的緩解，具體的臨床表現(xiàn)為呼吸逐步平穩(wěn)，行動(dòng)靈活，瘙癢改善等。

表3 復(fù)方腫節(jié)風(fēng)溶液對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞分泌IL-1、IL-6 和TNF-α的影響

注：*表示與LPS陽(yáng)性對(duì)照組比較差異顯著(P<0.05)；**表示與LPS陽(yáng)性對(duì)照組比較差異極顯著(P<0.01)。

Note：*indicates siginificant difference compared with LPS control group (P<0.05);**indicates extremely siginificant difference compared with LPS control group (P<0.01).

2.2.2 復(fù)方腫節(jié)風(fēng)溶液對(duì)哮喘大鼠血液嗜酸性粒細(xì)胞的影響 與空白對(duì)照組相比，模型組白細(xì)胞總數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)明顯增多(P<0.01)；用藥后，高、中、低劑量組白細(xì)胞數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)較模型組有所減少，其中高劑量組和中劑量組極顯著減少白細(xì)胞總數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)(P<0.01)(表4)。

2.2.3 復(fù)方腫節(jié)風(fēng)溶液對(duì)哮喘大鼠血清IgE、IL-4、IL-17和IFN-γ的含量的影響 與空白組相比，哮喘模型組血清IL-4、IL-17和IgE分泌異常升高，濃度極顯著升高(P<0.01)，而哮喘大鼠服用復(fù)方腫節(jié)風(fēng)溶液后IL-4、IL-17 和IgE濃度明顯下降，表明復(fù)方腫節(jié)風(fēng)溶液可抑制IL-4、IL-17和IgE的分泌，其中以高劑量組的抑制作用最顯著(P<0.01)。對(duì)INF-γ，哮喘模型組較空白組濃度極顯著減少，給藥后血清中INF-γ濃度有所上升(表5)，表明復(fù)方腫節(jié)風(fēng)溶液可明顯促進(jìn)INF-γ分泌，以高劑量的促進(jìn)作用表現(xiàn)最優(yōu)(P<0.01)。

2.2.4 大鼠肺組織病理組織學(xué)觀(guān)察 正常大鼠的支氣管和血管周?chē)鸁o(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，管壁結(jié)完整，肌層厚度合適。模型組大鼠支氣管和血管周?chē)写罅恳允人嵝粤＜?xì)胞和淋巴細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，管壁結(jié)構(gòu)不完整。復(fù)方腫節(jié)風(fēng)溶液低劑量組肺組織和氣管及其周?chē)难仔约?xì)胞數(shù)量明顯減少，氣管壁的組織結(jié)構(gòu)較完整。復(fù)方腫節(jié)風(fēng)溶液高劑量組肺組織和氣管及其周?chē)鷥H見(jiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，氣管壁較完整(圖1)。

表4 復(fù)方腫節(jié)風(fēng)溶液對(duì)哮喘大鼠血液白細(xì)胞的影響

注：*表示與哮喘模型組比較差異顯著(P<0.05)；**表示與哮喘模型組比較差異極顯著(P<0.01)。

Note：*indicates siginificant difference compared with the asthma control group (P<0.05);**indicates extremely siginificant difference compared with the asthma control group (P<0.01).

3 討論

NO既是炎癥反應(yīng)與免疫調(diào)節(jié)的效應(yīng)因子，也是關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子，參與多種炎癥信號(hào)傳導(dǎo)。外來(lái)刺激如細(xì)菌、病毒、前炎癥因子類(lèi)如IL-1、IL-6、TNF-α等都可激活NOS合成NO，主要的NOS誘導(dǎo)劑是內(nèi)毒素LPS[2]。體內(nèi)NO水平升高可從多個(gè)途徑影響病理生理進(jìn)程，關(guān)系到多種疾病的發(fā)生發(fā)展。因此，有效地抑制NOS不僅能在初始階段影響炎癥的發(fā)生，也對(duì)抑制和終結(jié)炎癥有作用。因此減少NO的過(guò)度分泌、抑制NOS的基因表達(dá)成為預(yù)防、治療炎癥性疾病的重要方式，本試驗(yàn)采集用藥4、8、24 h后的細(xì)胞上清液作為樣品，分時(shí)段測(cè)定了細(xì)胞上清液中NO的含量，觀(guān)察到復(fù)方腫節(jié)風(fēng)溶液在不同刺激時(shí)間對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞釋放NO水平的變化，結(jié)果表明復(fù)方腫節(jié)風(fēng)溶液對(duì)NO的抑制作用持續(xù)而穩(wěn)定。

表5 復(fù)方腫節(jié)風(fēng)溶液對(duì)哮喘大鼠血清中IgE、IL-4、IL-17 和IFN-γ的影響

注：*表示與哮喘模型組比較差異顯著(P<0.05)；**表示與哮喘模型組比較差異極顯著(P<0.01)。

Note：*indicates siginificant difference compared with the asthma control group (P<0.05);**indicates extremely siginificant difference compared with the asthma control group (P<0.01).

A.空白對(duì)照組；B.模型組；C.低劑量組；D.高劑量組

IL-6、TNF-α是最重要的促炎細(xì)胞因子，其中IL-6可促進(jìn)B細(xì)胞分化，活化絲裂原活化蛋白激酶，激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子而加重炎癥反應(yīng)過(guò)程[3-4]。TNF-α作為重要的參與炎癥反應(yīng)的因子，在許多病理生理過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。而白細(xì)胞介素則是由多種細(xì)胞產(chǎn)生并作用于多種細(xì)胞的一類(lèi)細(xì)胞因子。它們?cè)诿庖呒?xì)胞的成熟、活化增殖和免疫調(diào)節(jié)等一系列過(guò)程中均發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示，復(fù)方腫節(jié)風(fēng)溶液能夠降低LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞分泌IL-6 、IL-1、TNF-α和NO等炎癥因子的含量，表現(xiàn)在降低上清液中細(xì)胞因子IL- 1、IL-6、TNF-α的含量，表明復(fù)方腫節(jié)風(fēng)溶液對(duì)改善細(xì)胞炎癥反應(yīng)具有明顯的作用。

哮喘是氣道慢性炎癥性病變，病理特征主要為以嗜酸性粒細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、氣道的高反應(yīng)性以及黏液高分泌等。EOS是哮喘發(fā)生機(jī)制中重要的炎癥效應(yīng)細(xì)胞。減少EOS在變態(tài)反應(yīng)中的數(shù)量或調(diào)節(jié)其凋亡，可以減輕炎癥反應(yīng)，促進(jìn)炎癥消退。試驗(yàn)結(jié)果顯示，復(fù)方腫節(jié)風(fēng)溶液明顯降低了血液中白細(xì)胞總數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)。另外，哮喘模型的血清學(xué)特征主要是總IgE水平和OVA特異性IgE水平增高[5-6]。而IL-4可誘導(dǎo)IgG向IgE轉(zhuǎn)換[7]，體內(nèi)IL-4增多，IL-4/IFN-γ的比例失衡，是哮喘患者體內(nèi)IgE合成過(guò)多的主要機(jī)制之一[8]。IL-17是一個(gè)關(guān)鍵的促炎細(xì)胞因子，它是由CD4+T細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞產(chǎn)生，有報(bào)道稱(chēng)IL-17促進(jìn)中性粒細(xì)胞炎癥和氣道重塑[9]。IFN-γ由于可抑制氣道嗜酸性粒細(xì)胞的侵潤(rùn)，對(duì)于抑制氣道炎癥具有重要作用[10]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)方腫節(jié)風(fēng)溶液能明顯下調(diào)哮喘大鼠血清中IgE、IL-4、IL-17濃度，上調(diào)IFN-γ水平，能夠有效調(diào)節(jié)IL-4/IFN-γ的動(dòng)態(tài)平衡，減輕哮喘大鼠肺組織炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，從而改善大鼠的哮喘癥狀。

復(fù)方腫節(jié)風(fēng)溶液由腫節(jié)風(fēng)、苦玄參兩味中藥組成，具有疏風(fēng)清熱、解毒消腫之功效；主用于咽喉腫痛，急慢性咽炎、扁桃體炎等[1]。腫節(jié)風(fēng)是方中君藥，具有清熱涼血、活血消斑、祛風(fēng)通絡(luò)等功效；苦玄參具有清熱解毒、消腫止痛的功效；兩藥合用共奏疏風(fēng)清熱、解毒消腫之功效[11]。本研究表明復(fù)方腫節(jié)風(fēng)溶液具有明顯的體外抗炎和平喘作用，這為復(fù)方腫節(jié)風(fēng)溶液用于畜禽慢性呼吸道疾病的研究提供了理論基礎(chǔ)。復(fù)方腫節(jié)風(fēng)溶液的抗炎平喘機(jī)制可能與復(fù)方腫節(jié)風(fēng)溶液能抑制相關(guān)炎性介質(zhì)的產(chǎn)生有關(guān)，也可能是抑制了控制炎性介質(zhì)的相關(guān)基因或蛋白的表達(dá)，這需要進(jìn)一步深入研究。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì)主編.中華人民共和國(guó)藥典[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2015.

[2] Funatogawa K,Matsuura M,Nakano M,et al.Relationship of structure and biological activity of monosaccharide lipid A analogues to induction of nitric oxide production by murine macrophage RAW 264.7 cells[J].Infect Immun,1998,66(12):5792-5798.

[3] Adams J L,Czuprynski C J.Mycobacterial cell wall components induce the production of TNF-alpha,IL-1,and IL-6 by bovine monocytes and the murine macrophage cell line RAW 264.7[J].Microbial Pathogene,1994,16(6):401-411.

[4] Hodge D R,Hurt E M,Farrar W L.The role of IL-6 and STAT3 in inflammation and cancer[J].Eur J Cancer,2005,41(16):2502-2512.

[5] Liang Z,Xu Y,Wen X,et al.Rosmarinic acid attenuates airway inflammation and hyper-responsiveness in a murine model of Asthma[J].Molecules,2016,21(6):769.

[6] Wei D,Ci X,Chu X,et al.Hesperidin suppresses ovalbumin-induced airway inflammation in a mouse allergic asthma model[J].Inflammation,2012,35(1):114-121.

[7] Kraft M,Lewis C,Pham D,et al.IL-4,IL-13, and dexamethasone augment fibroblast proliferation in asthma[J].J Allergy Clin Immunol,2001,107(4):602-606.

[8] 黃 勛，陳偉斌.辛蒼滴鼻凝膠劑對(duì)哮喘大鼠血，肺泡灌洗液中 IL-4，IFN-γ 及嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響[J].江蘇中醫(yī)藥，2012，44(1)：72-74.

[9] Tan H L,Rosenthal M.IL-17 in lung disease: friend or foe?[J].Thorax, 2013,68(8):788-790.

[10] 趙克明.加味小柴胡湯干預(yù)大鼠哮喘模型的實(shí)驗(yàn)研究[D].遼寧沈陽(yáng)：遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，2010.

[11] 方兔慧，丘 琴，甄漢深，等.苦玄參近年研究的進(jìn)展[J].中國(guó)民族民間醫(yī)藥，2011，20(24)：62-62.

Experimental Study of Compound Zhongjiefeng Oral Liquid on Anti-inflammatory and Antiasthmatic Activities

LIANG Zheng-min1,ZHANG Ming-xin1,PENG Jian-bo2,YANG Shan-zhong2,TANG Ting-chong1,LAI Sheng-ji1,HE Jia-kang1

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,GuangxiUniversity,Nanning,Guangxi530005,China; 2.GuangxiEngineeringResearchCenterforVeterinaryMedicine,Nanning,Guangxi，530003,China)

In order to investigate the anti-inflammatory and antiasthmatic activities of compound Zhongjiefeng oral liquid,the cell inflammation model of RAW 264.7 cells was induced by LPSinvitro.MTT assay was used to measure the RAW 264.7 cell activity,ELISA method was used to measure TNF-a,IL-1 and IL-6 concentrations in cell supernatant,and NO level was measured by Griess method.In addition,female Wistar rats were sensitized and challenged with ovalbumin (OVA) to establish asthma model,and then treated daily with compound Zhongjiefeng oral liquid(12，6，3 g/kg)invivo.ELISA method was used to measure IL-4,IL-17 and IFN-γ and IgE concentrations in serum;The total leukocytes and the number of eosinophils in the blood were detected with hemacytometer and cytospins by staining with the Wright-Giemsa staining method.Lung sections were stained with hematoxylin and eosin (H&E) for histopathological lesions.Anti-inflammatory experimentinvitroresults showed the compound Zhongjiefeng oral liquid in the concentration range of 10 to 40 μg/mL on RAW 264. 7 cell viability had no significant effect.10,20,40 μg/mL of compound Zhongjiefeng oral liquid can significantly inhibit the levels of TNF-α,IL-6,IL-1 in RAW 264.7 cells induced by LPS with a dose dependent relationship (P< 0.05).Studiesinvivoresults showed that the compound Zhongjiefeng oral liquid makedly down-regulated IL-4,IL-17 and IgE hypersecretion and up-regulated IFN -γ in serum compared with the asthma model group (P< 0.05).The results suggested that the protective effects of the compound Zhongjiefeng oral liquid on the cell inflammation model or rats asthma model might be mediated by the inhibition of inflammatory factors.

Zhongjiefeng oral liquid;RAW 264.7 cell;anti-inflamation;inhibiting asthma;inflammatory factors

2016-08-31

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31360624)；廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2014GXNSFAA118115)

梁正敏(1992-)，女，貴州遵義人，碩士研究生，主要從事中獸醫(yī)藥研究。

1007-5038(2017)04-0120-06

*通訊作者