水貂阿留申病診斷抗原研究概述

于 凱，倪 佳，馮二凱,3，萬(wàn)洪理，陳立志,3*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林長(zhǎng)春 130118；2.吉林特研生物技術(shù)有限責(zé)任公司，吉林長(zhǎng)春 130122；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林長(zhǎng)春 130122)

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水貂阿留申病診斷抗原研究概述

于 凱1,2，倪 佳2，馮二凱2,3，萬(wàn)洪理2，陳立志2,3*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林長(zhǎng)春 130118；2.吉林特研生物技術(shù)有限責(zé)任公司，吉林長(zhǎng)春 130122；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林長(zhǎng)春 130122)

近年來(lái)，隨著水貂養(yǎng)殖行業(yè)的不斷發(fā)展，一些疫病也成為了制約水貂養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要因素。水貂阿留申病作為毛皮動(dòng)物的三大疫病之一(阿留申病、犬瘟熱、病毒性腸炎)，是導(dǎo)致母貂產(chǎn)仔率下降、公貂配種能力降低和毛皮質(zhì)量下降的一種高度接觸性傳染病。至今為止，還沒(méi)有商品化的疫苗來(lái)控制該病的傳播及蔓延?？刂扑醢⒘羯瓴∽詈玫姆椒ㄊ峭ㄟ^(guò)檢測(cè)淘汰所有抗體為陽(yáng)性的水貂，進(jìn)而達(dá)到凈化貂群的目的。而在抗體檢測(cè)過(guò)程中，診斷抗原的制備和純化決定著檢測(cè)方法的敏感性、特異性和準(zhǔn)確性。論文對(duì)目前阿留申病毒細(xì)胞抗原及基因工程抗原研究進(jìn)展做一綜述，為今后該病病原檢測(cè)工作提供參考。

水貂阿留申??；診斷抗原；VP2基因；對(duì)流免疫電泳

水貂阿留申病(Mink Aleutian disease，AD)是由細(xì)小病毒科阿留申病毒屬的阿留申病毒(Aleutian disease virus，ADV)引起的一種高度接觸性傳染病，主要侵害水貂的免疫系統(tǒng)，引起免疫抑制[1]。AD在很大程度上是由于血液中anti-ADV抗體增加，抗原和抗體形成的復(fù)合物在多個(gè)組織器官內(nèi)沉積而引起炎癥[2]，AD是一種免疫復(fù)合物疾病[3]，可導(dǎo)致母貂的繁育能力降低、空懷和仔貂的死亡。由于AD發(fā)病急、傳播快、危害大，使得控制該病已經(jīng)成為國(guó)際性的難題[4]。由于其特殊的致病機(jī)理，目前沒(méi)有有效的防控手段，因此需要依靠檢測(cè)方法來(lái)根除該病對(duì)貂群的危害。而AD的診斷不僅要依據(jù)臨床癥狀及體征，還需要應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的方法來(lái)得以確定。因此，檢測(cè)抗原的制備尤為重要，研發(fā)和制備抗原對(duì)阿留申病的檢測(cè)具有重要的臨床意義。

1 臟器抗原

最初在缺少水貂阿留申病毒毒株和生產(chǎn)工藝還不完善時(shí)應(yīng)用的一種抗原。1969年P(guān)orter D D等[5]最先以感染ADV的水貂肝臟研磨液通過(guò)離心制備抗原，將其人工接種于健康水貂，接種9 d后可檢出ADV抗體，雖然感染兩個(gè)月后通過(guò)間接免疫熒光技術(shù)測(cè)得其抗體效價(jià)可達(dá)到1∶100 000。但是該項(xiàng)技術(shù)步驟繁瑣，重復(fù)性不高，不適用于實(shí)踐生產(chǎn)；Cho H J和 Ingram D G[6]以被感染水貂的脾、腎和肝為抗原，利用對(duì)流免疫電泳(counter immunoelectrophoresis，CIEP)技術(shù)，檢測(cè)血清中的ADV抗體。檢測(cè)結(jié)果表明水貂在感染ADV約9 d～11 d后便可檢出抗體為陽(yáng)性，該檢測(cè)技術(shù)特異性較強(qiáng)，重復(fù)性高，與剖檢的符合率可達(dá)100%，但是敏感性較低，僅為75%；日本學(xué)者Shimizu Y等[7]從慢性感染ADV的貂體內(nèi)采集脾臟，經(jīng)過(guò)一系列離心、純化、濃縮后，首次使大批量制備阿留申診斷抗原成為了可能，但是方法過(guò)于繁瑣，且散毒風(fēng)險(xiǎn)大，不耐貯存和凍融，所以至今未被采用；關(guān)中湘等[8]從我國(guó)遼寧省金州貂場(chǎng)分離1株被感染的水貂“遼金ADV81-02”病毒株，以人工感染的方式對(duì)8月齡的健康水貂進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，在攻毒后第9天，從急性感染的病貂體內(nèi)取出淋巴結(jié)、肝臟、脾臟進(jìn)而用氟碳提取并純化，經(jīng)過(guò)超速離心濃縮后，用鹽酸-甘氨酸活化，得到檢測(cè)ADV的抗原，但在制備抗原過(guò)程中，提純需要14個(gè)步驟和26次化學(xué)處理，前后需1周時(shí)間，試驗(yàn)中需要昂貴的氟碳提純，這不僅增加了制備抗原的成本，同時(shí)也破壞了抗原的理化性質(zhì)，致使稍一凍融，抗原就會(huì)失效，同時(shí)臟器抗原需對(duì)多個(gè)水貂進(jìn)行攻毒才可獲得大量抗原，因此這種方法不便應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)；與此同時(shí)，美國(guó)濃縮的臟器抗原，在不經(jīng)過(guò)反復(fù)凍融的情況下，4℃僅保存1周，如稀釋成工作液后，4℃保存2 d就已失效，所以在應(yīng)用過(guò)程中有諸多不便，也未得到推廣。

2 細(xì)胞抗原

隨著科研成果的不斷創(chuàng)新，各國(guó)的學(xué)者將目標(biāo)轉(zhuǎn)向了體外培養(yǎng)病毒，20世紀(jì)80年代丹麥?zhǔn)紫妊兄瞥鲶w外培養(yǎng)病毒抗原，采用傳代細(xì)胞進(jìn)行病毒的擴(kuò)增，而傳代細(xì)胞成分單純，工藝先進(jìn)，代表了阿留申診斷抗原研制的新水平[9]。但是在制備純化過(guò)程中離不開(kāi)超速離心，這在很大程度上阻礙了其推廣與普及。隨著對(duì)AD診斷抗原的不斷研究，我國(guó)學(xué)者李增光等[10]比較了各國(guó)抗原制備的優(yōu)點(diǎn)，用貓腎傳代細(xì)胞(CREK)和AMV國(guó)際抗原標(biāo)準(zhǔn)株Utah-1，經(jīng)過(guò)多次的試驗(yàn)，以最新的生產(chǎn)工藝，在我國(guó)首次成功研制出診斷AD的傳代細(xì)胞抗原，其工藝簡(jiǎn)單，不受動(dòng)物來(lái)源及季節(jié)的限制，可隨時(shí)生產(chǎn)，且反復(fù)凍融后也可保持其檢測(cè)能力；吳威等[11]用CRFK細(xì)胞培養(yǎng)ADV-G株病毒，收集病變的細(xì)胞，離心處理后得到診斷AD CIEP的細(xì)胞抗原，通過(guò)酶印記證明該抗原的分子質(zhì)量及純度和美國(guó)細(xì)胞抗原相一致，其靈敏性還高于美國(guó)細(xì)胞抗原，而且該抗原穩(wěn)定性好，可長(zhǎng)久保存，沉淀線清晰，易于觀察，不需要宰殺動(dòng)物，實(shí)現(xiàn)了體外病毒檢測(cè)的可能，至今在CIEP檢測(cè)工作中仍占據(jù)重要的地位。

3 基因工程抗原

分子生物學(xué)技術(shù)已經(jīng)成為快速發(fā)展的研究領(lǐng)域并具有工業(yè)生產(chǎn)蛋白質(zhì)的潛力[12]。目前應(yīng)用基因工程技術(shù)進(jìn)行體外表達(dá)目的蛋白，使重組蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用成為了可能。已有研究表明，AD抗體檢測(cè)技術(shù)中的診斷抗原從最初的ADV-G株的細(xì)胞抗原，正逐漸變成現(xiàn)在通過(guò)基因工程技術(shù)獲得的基因工程抗原VP2蛋白，由于VP2基因占整個(gè)ADV衣殼蛋白的90%，成為ADV最主要的免疫原性蛋白，更是抗原決定簇載體，從而國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者通過(guò)克隆VP2基因，成功表達(dá)具有免疫原性的抗原[13]。由于其具有良好的免疫原性，因而在檢測(cè)結(jié)果的靈敏性和特異性上都得到了明顯的進(jìn)步。因此，利用基因工程技術(shù)獲取CIEP抗原成了研究的重點(diǎn)。

3.1 原核表達(dá)系統(tǒng)的抗原

原核表達(dá)系統(tǒng)是目前最常用的外源基因表達(dá)系統(tǒng)，也是研究最透徹且最經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的表達(dá)系統(tǒng)，以大腸埃希菌為代表的原核表達(dá)系統(tǒng)是外源重組基因表達(dá)的首選[13]。曾祥偉等[15]利用原核表達(dá)載體PMAL-C2對(duì)ADV的VP2基因主要功能區(qū)進(jìn)行原核表達(dá)，將表達(dá)的蛋白純化后作為診斷抗原，建立了VP2-CIEP的診斷方法，與細(xì)胞抗原相比，具有較高的敏感性和特異性，其符合率高達(dá)94.3%；徐磊等[16]通過(guò)PET-28a(+)及PMAL-P2X載體對(duì)ADV的VP2基因上主要兩段抗原區(qū)進(jìn)行原核表達(dá)，將表達(dá)產(chǎn)物作為標(biāo)記抗原，初步建立了水貂AD膠體金免疫層析診斷方法[17]，該診斷方法與CIEP比較，其敏感性是CIEP方法的2倍，同時(shí)與其他非ADV的陽(yáng)性血清無(wú)交叉反應(yīng)，說(shuō)明其特異性好；李艷伍[18]利用PET-28a(+)載體對(duì)AMV-VP2主要功能區(qū)進(jìn)行原核表達(dá)，對(duì)表達(dá)的蛋白純化后包被抗原進(jìn)行間接ELISA抗體檢測(cè)，通過(guò)與CIEP法對(duì)120份血清樣品比較符合率達(dá)95.8%，證明了該方法特異性好，敏感性高，可以將表達(dá)的產(chǎn)物應(yīng)用到抗體檢測(cè)中；黃盼盼[19]以ADV美國(guó)株ADV-G結(jié)構(gòu)蛋白VP2為研究對(duì)象，通過(guò)預(yù)測(cè)B細(xì)胞抗原表位及篩選保守序列，人工合成保守性高的SD序列，通過(guò)大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)誘導(dǎo)表達(dá)，獲得了可溶性SD蛋白。這種全新的人工抗原SD蛋白作為一種檢測(cè)抗原具有良好的反應(yīng)原性，將SD蛋白作為包被抗原成功的建立了間接ELISA抗體檢測(cè)方法，其方法具有重復(fù)性好、特異性強(qiáng)及敏感性高的特點(diǎn)，與CIEP檢測(cè)方法比較符合率較高；李晶[20]將ADV的VP2基因克隆至載體PGEX-4T-1中進(jìn)行原核表達(dá)，將純化的重組蛋白作為包被抗原成功的建立了ADV的Dot-ELISA檢測(cè)方法，該方法與CIEP 同時(shí)對(duì)78份臨床血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明Dot-ELISA陽(yáng)性檢出率為84.6%，CIEP陽(yáng)性檢出率為80.8%，其敏感性高于CIEP，兩者符合率為96.2%；Chen X等[21]通過(guò)PMAL-C2X載體對(duì)AMV VP2截短基因進(jìn)行原核表達(dá)，通過(guò)對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行ELISA抗體檢測(cè)，其特異性和敏感性分別達(dá)97.9%和97.3%。而通過(guò)Western blot檢測(cè)，其特異性和敏感性分別為86.4%和91.7%，雖然低于ELISA抗體檢測(cè)方法，但也說(shuō)明了重組蛋白及檢測(cè)方法具有可行性。

3.2 真核表達(dá)系統(tǒng)的抗原

真核表達(dá)系統(tǒng)及相關(guān)技術(shù)為工業(yè)化生產(chǎn)蛋白提供了技術(shù)平臺(tái)，由于該系統(tǒng)的不斷完善及進(jìn)步，成千上萬(wàn)種重組蛋白被研制成功，對(duì)學(xué)術(shù)界及工業(yè)領(lǐng)域具有重要貢獻(xiàn)。真核表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)成為最有效的體內(nèi)表達(dá)蛋白的工具之一[22]，這使許多重組蛋白得到有效和高水平表達(dá)成為了可能，由于該系統(tǒng)具有翻譯后修飾的特性，其合成蛋白的反應(yīng)原性和免疫原性都與天然蛋白相似，因此在科研領(lǐng)域中得到了廣泛的應(yīng)用。Clemens D L等[23]用重組牛痘病毒VV:ADSP表達(dá)了AMV的自組裝病毒樣粒子(VLP)，對(duì)結(jié)構(gòu)蛋白VP1和VP2進(jìn)行表達(dá)，該表達(dá)產(chǎn)物可產(chǎn)生中和抗體，病毒結(jié)構(gòu)與參考毒株ADV-G極為相似，用重組表達(dá)蛋白作為CIEP抗原檢測(cè)健康及患病水貂的血清，其敏感性高于細(xì)胞抗原。Christensen J等[24]利用腺病毒載體系統(tǒng)成功表達(dá)了ADV的結(jié)構(gòu)蛋白，將表達(dá)的產(chǎn)物用于CIEP檢測(cè)，這不僅避免了散毒的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)也不會(huì)污染健康水貂群，但由于重組蛋白的純化及成本等方面的限制，目前局限于試驗(yàn)研究，尚未推廣應(yīng)用。Wu W H等[25]用桿狀病毒表達(dá)了AMV的VLP，在Western blot中與CIEP效價(jià)小于4的多份血清進(jìn)行比較，證明其具有良好的反應(yīng)原性，通過(guò)CIEP方法證實(shí)其抗原性比商品化抗原更敏感，證明了重組的VLP可以作為診斷ADV的抗原。Knuuttila A等[26]用昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)了重組VP2蛋白，形成了自組裝VLP，純化后作為CIEP診斷抗原檢測(cè)209份水貂血清，與商品化抗原符合率達(dá)100%。對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行ELISA抗體檢測(cè)，該診斷方法的敏感性和特異性分別為99%和97%，完全可以代替細(xì)胞抗原，而且沒(méi)有散毒風(fēng)險(xiǎn)，因此在芬蘭被逐漸推廣應(yīng)用。王振軍等[27]將ADV-G的VP2基因克隆到桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體中，并成功轉(zhuǎn)染到昆蟲(chóng)細(xì)胞Sf9中，獲得了重組桿狀病毒，通過(guò)Western blot、CIEP、免疫熒光的方法證明了該方法具有重復(fù)性好、敏感性高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，表達(dá)的蛋白和商業(yè)的細(xì)胞抗原在檢測(cè)方面具有高度的一致性。張蕾等[28]通過(guò)昆蟲(chóng)桿狀病毒對(duì)AMV VP2基因表達(dá)，其中每10 mL培養(yǎng)液可產(chǎn)生1 mL抗原，比常規(guī)方法生產(chǎn)率提升了4倍；同時(shí)通過(guò)CIEP比較，兩者的符合率達(dá)100%。

4 展望

隨著對(duì)基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理的深入研究探索和生物科學(xué)領(lǐng)域的快速發(fā)展，目前常用的表達(dá)系統(tǒng)都將得到進(jìn)一步的應(yīng)用和完善，同時(shí)人們相信在不久的將來(lái)，會(huì)有越來(lái)越多的表達(dá)系統(tǒng)誕生，但有些表達(dá)系統(tǒng)自身也存在很多缺點(diǎn)，所以要綜合考慮各方面因素來(lái)選擇合適的表達(dá)系統(tǒng)。例如在表達(dá)生物活性蛋白或構(gòu)建基因疫苗時(shí)，真核表達(dá)系統(tǒng)是最佳的選擇。它可以確保二硫鍵的形成及對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行磷酸化、糖基化、信號(hào)切割等修飾，從而使表達(dá)的重組蛋白生物學(xué)活性更接近天然蛋白。雖然重組蛋白很容易表達(dá)，但是蛋白的結(jié)構(gòu)及特性會(huì)發(fā)生一些改變；在重組蛋白的水平上，細(xì)胞內(nèi)、外表達(dá)和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)是不一樣的[29]，雖然真核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)外源基因可有效表達(dá)，但表達(dá)水平差異很大，例如細(xì)胞種類、活力、培養(yǎng)基質(zhì)量、培養(yǎng)環(huán)境和外源基因本身的特性等都可影響其表達(dá)量。反之原核表達(dá)系統(tǒng)可以提供用于診斷的人工抗原并對(duì)不需要翻譯后修飾的蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，而且具有表達(dá)量高、成本低廉、操作簡(jiǎn)單、抗污染能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，至今已在各個(gè)領(lǐng)域中被廣泛應(yīng)用，但原核表達(dá)的重組蛋白多以非天然狀態(tài)折疊致使重組蛋白活性較低，同時(shí)外源基因在重組過(guò)程中容易缺失及表達(dá)的蛋白易以包涵體形式存在，所以提高蛋白質(zhì)產(chǎn)量需要優(yōu)化基因的轉(zhuǎn)錄效率、提高翻譯速度及確保穩(wěn)定的mRNA。因而在選擇表達(dá)系統(tǒng)時(shí)，需要充分考慮多種因素，如最佳表達(dá)的有機(jī)體，最適宜的生長(zhǎng)環(huán)境，所需要表達(dá)的蛋白是否具有可溶性、安全性及天然活性。因此，在實(shí)踐和科研探索過(guò)程中需要謹(jǐn)慎的做出選擇。相信隨著生物學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)及分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，更多的表達(dá)系統(tǒng)將會(huì)不斷產(chǎn)生，終會(huì)獲得表達(dá)量更大、活性更好的重組蛋白。

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Summary of Diagnostic Antigens of Mink Aleutian Disease

YU Kai1,2，NI Jia2，F(xiàn)ENG Er-kai2,3，WAN Hong-li2，CHEN Li-zhi2,3

(1.JilinAgriculturalUniversity，Changchun，Jilin,130118，China；2.JilinSpecialResearchBiologicalTechnologyCo.LTD.，Changchun，Jilin,130122，China；3.InstituteofSpecialWildEconomicAnimalandPlantScience，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Changchun，Jilin,130122，China)

The mink breeding industry has developed rapidly in recent years.Some epidemic diseases become the key factor restricting mink breeding development. Mink Aleutian disease,as one of the three main epidemic diseases (Mink Aleutian disease,canine distemper,virus enteritis) of fur-animals,can lead to decrease the reproductive performance and the quality of furs.It is a highly contagious disease.So far,there is no commercially available vaccine to control the spread of the disease.The best way for controlling Mink Aleutian disease is to detect and eliminate the minks whose antibody is positive,and achieve the purpose of purifying the mink crowds.During the process of antibody detection,the preparation and purification of diagnostic antigens determine the sensitivity,specificity and accuracy of detection methods.This article reviewed the advances on genetic engineering antigens and cell antigens of Mink Aleutian disease virus for providing references for Mink Aleutian disease detecting.

Mmink Aleutian disease；diagnostic antigen；VP2gene；CIEP

2016-09-13

橫向課題(201300001);吉林省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(20150204073NY)

于 凱(1991 -)，女，內(nèi)蒙古呼倫貝爾人，碩士研究生，主要從事特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物疫病研究。

S852.659.2;S858.92

A

1007-5038(2017)04-0116-04

*通訊作者