豬博卡病毒病原學(xué)和檢測方法研究進(jìn)展

汪 洋, 李 玲, 李 真，李 峰，2*

(1.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州 256600)

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豬博卡病毒病原學(xué)和檢測方法研究進(jìn)展

汪 洋1, 李 玲1, 李 真1，李 峰1，2*

(1.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州 256600)

豬博卡病毒是2009年新發(fā)現(xiàn)的一種豬細(xì)小病毒，近幾年來在我國感染率日益升高，且常常與其他病原混合感染，增加了疫病防控的難度。論文就豬博卡病毒病原學(xué)與檢測方法做一綜述，為提高我國豬博卡病毒的綜合防控能力提供參考。

豬博卡病毒；病原學(xué)；檢測方法

豬博卡病毒(Porcine bocavirus，PBoV)是一種新型的豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus，PPV)，于2009年首次在患斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Post weaning multisystemic wating syndrome,PMWS)的仔豬淋巴結(jié)中分離鑒定出來[1]，隨后世界養(yǎng)豬密集地區(qū)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)該病毒的感染，目前該病毒已呈世界范圍內(nèi)流行[2-5]。PBoV感染引起的臨床癥狀與普通的PPV感染相似，仔豬的發(fā)病率和病死率高，成年豬的發(fā)病率和病死率較低[6-7]，近年來該病毒在我國豬群中感染情況呈逐漸上升的趨勢[8]。PBoV是一種人畜共患病毒，該病毒不僅能感染豬，還可以感染牛和人，不僅給養(yǎng)豬業(yè)帶來經(jīng)濟(jì)損失，還威脅人類健康，加強(qiáng)PBoV防控技術(shù)研究，對保障養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展和公共衛(wèi)生安全均至關(guān)重要。論文綜述了PBoV病原學(xué)與檢測方法的最新研究現(xiàn)狀與未來發(fā)展趨勢，旨在為我國PBoV防控措施的制定提供技術(shù)支持，進(jìn)而逐步提高我國PBoV的綜合防控能力。

1 豬博卡病毒的病原學(xué)

1.1 豬博卡病毒分類

豬博卡病毒屬于細(xì)小病毒科(Parvoviridae)細(xì)小病毒亞科(Parvovirinae)博卡病毒屬(Bocavirus)，博卡病毒屬成員包括牛細(xì)小病毒(Bovine parvovirus,BPV)，大猩猩博卡病毒(Gorilla parvovirus,GBoV)，犬細(xì)小病毒(Canine parvovirus,CnMV)，豬博卡病毒(PBoV)和人博卡病毒(Human parvovirus,HBoV)[9]。PBoV為單股DNA病毒，病毒基因組全長5.2 kb，正二十面體結(jié)構(gòu)，無囊膜，病毒粒子大小為25 nm～30 nm[10]。國際病毒分類委員會(huì)(ICTV)根據(jù)PBoV非結(jié)構(gòu)蛋白NS1的核苷酸同源性將豬博卡病毒分為5個(gè)基因型(PBoV1-5)[11]，目前，5種基因型的PBoV在豬體內(nèi)都有發(fā)現(xiàn)，PBoV1首先在瑞典患多系統(tǒng)衰竭綜合征病豬體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，PBoV2在美國感染豬圓環(huán)病毒豬體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，PBoV3、PBoV4在中國健康豬群糞便中發(fā)現(xiàn)，PBoV5在香港腹瀉仔豬糞便中發(fā)現(xiàn)[12]。

1.2 豬博卡病毒基因組結(jié)構(gòu)和功能

PBoV與CnMV核苷酸同源性最高，為52%～55%，其次與GBoV核苷酸同源性為50 %，與HBoV核苷酸同源性為44%～48%，與BPV核苷酸同源性為44%～45%[13]。PBoV基因組為單股線狀DNA，全長4786 bp～5905 bp，5種基因型的PBoV基因組結(jié)構(gòu)基本一致，基因組序列從5′端依次含有ORF1、ORF2、ORF3 3個(gè)主要的開放閱讀框[14-15]。其中，ORF1全長1 911 bp，編碼636個(gè)氨基酸，ORF1編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS1，是與病毒的滾環(huán)復(fù)制方式、解螺旋酶活性及三磷酸腺苷酶活性相關(guān)的一段保守序列[16]。ORF2全長657 bp，編碼218個(gè)氨基酸，ORF2編碼衣殼蛋白VP1、VP2，VP1序列內(nèi)含有與病毒感染性有關(guān)的磷脂酸序列，VP1、VP2是病毒的主要抗原性基因[17-18]。ORF3全長1 872 bp，編碼623個(gè)氨基酸，ORF3是病毒特有的開放閱讀框，編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NP1[19]。

1.3 豬博卡病毒流行病學(xué)

PBoV自2009年被首次發(fā)現(xiàn)和報(bào)道后，在短短幾年的時(shí)間內(nèi)，關(guān)于PBoV感染方面已經(jīng)有大量報(bào)道，更有發(fā)生PBoV與豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)、豬偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)混合感染的報(bào)道。PBoV在當(dāng)前豬群中感染十分普遍，侯美如等[20]的統(tǒng)計(jì)表明,5種基因型的PBoV在臨床中都有發(fā)現(xiàn)，PBoV1和PBoV3感染的陽性率最高，分別為39.3%～63.2%和12.59%～64.4%。PBoV4感染的陽性率為16.5%，PBoV2 的感染陽性率為0.76%～6.6%，PboV5感染率相對較低。PBoV對各種消毒劑敏感，常用的消毒劑都有一定的殺滅作用，PBoV在秋末和早春寒冷季節(jié)多發(fā)，病毒可以通過消化道、呼吸道接觸傳播，也可以通過血液和胎盤垂直傳播[21]。PBoV感染可以引起支氣管炎、肺炎和胃腸炎，母豬感染引起流產(chǎn)，產(chǎn)死胎和木乃伊胎，感染仔豬發(fā)生嘔吐、腹瀉，病豬嚴(yán)重消瘦，精神沉郁，最后發(fā)生嚴(yán)重脫水而死亡，剖檢可見腸壁變薄、充血和出血[22]。

2 豬博卡病毒的檢測方法

PBoV感染后的臨床癥狀與PPV感染的臨床癥狀極其相似，且PBoV常與PRRSV、PCV2、PRV等病毒混合感染，增加了PBoV臨床診斷的難度，對于PBoV感染的確診需借助實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)。隨著分子生物學(xué)和免疫學(xué)的快速發(fā)展與其在動(dòng)物疫病診斷中的推廣應(yīng)用，PBoV的分子生物學(xué)與血清學(xué)檢測方法亦得到了快速發(fā)展與完善。

2.1 聚合酶鏈反應(yīng)

聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)操作簡單、檢測快速、敏感、特異，適合于基層實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行PBoV感染的快速診斷與流行病學(xué)調(diào)查等，是一種值得基層推廣應(yīng)用的快速診斷技術(shù)。付朋飛等[23]根據(jù)GenBank中登錄的PBoV1/2型的高度同源保守序列設(shè)計(jì)1對特異性引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增條件優(yōu)化，建立了檢測PBoV1/2型的PCR方法。該方法可以從PBoV1型或2型的陽性樣品中特異性的擴(kuò)增出751 bp的目的片段，而對PRV、PCV2、大腸埃希菌、沙門菌核酸樣品的檢測均為陰性，對PBoV1/2重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的最低檢測限為34.8 copies/μL，為PBoV1/2型的診斷和監(jiān)測提供了技術(shù)支持。同時(shí)，付朋飛等[24]建立了可同時(shí)擴(kuò)增出PBoV3/4/5型的PCR檢測方法，為PBoV3/4/5型的快速檢測提供了有效的技術(shù)支持。胡軍勇等[25]根據(jù)PBoV NS1基因序列設(shè)計(jì)1對引物，建立了PBoV的PCR檢測方法，該方法可以特異性的擴(kuò)增出482 bp的片段，對PBoV的最低檢測量為213.6 copies，利用該檢測方法對湖北、湖南、河南等省的各大豬場進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查，在79個(gè)規(guī)?；i場采集的248份病料樣品中有172份樣品為PBoV陽性，PBoV在腹瀉豬群中的陽性率達(dá)到73.95 %，表明PBoV在國內(nèi)豬群中流行廣泛而且感染率高。翟少倫等[26]也建立了PBoV的PCR檢測方法，通過對2009年我國部分省市豬場的191份臨床樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果75份為豬博卡病毒陽性，表明我國豬群中PBoV相當(dāng)流行，該P(yáng)CR可以作為PBoV臨床診斷上的一種診斷技術(shù)。

2.2 多重PCR

多重PCR是在同一PCR反應(yīng)體系中，加入多對特異性引物，實(shí)現(xiàn)兩種或多種病原核酸的檢測，廣泛用于各種臨床疾病的快速診斷和分型研究。宏春慧等[27]根據(jù)PBoV基因序列分別設(shè)計(jì)3對針對PBoV 1型、2型和3型3種基因型保守區(qū)域的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增目的片段大小分別為645 bp(PBoV1型)、352 bp(PBoV2型)和259 bp(PBoV3型)，建立了PBoV不同基因型三重PCR檢測方法，該方法最低檢測限為8×10-7ng/μL，對臨床樣品進(jìn)行三重PCR和單項(xiàng)PCR檢測，二者符合率為100 %，該方法的建立為PBoV 3種不同基因型的鑒別檢測提供了有效手段。李小鵬等[28]利用同源性分析設(shè)計(jì)3對引物分別擴(kuò)增PboV1、PBoV2、PBoV3，也建立了PBoV多重PCR檢測方法，實(shí)現(xiàn)了PBoV快速多基因型檢測。蔡雨函等[29]根據(jù)PBoV1/2型和PBoV3/4/5型的基因組序列，分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增PBoV1/2型和PBoV3/4/5型的檢測引物，在建立單一PCR檢測方法的基礎(chǔ)上，通過反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了PBoV1/2/3/4/5型的雙重PCR檢測方法，應(yīng)用本方法對189份仔豬腹瀉病料進(jìn)行了檢測，結(jié)果共檢出PBoV陽性樣品121份，陽性率達(dá)到64.2%，121份陽性樣品中有79份為PBoV 3/4/5型，29份為PBoV 1/2型，13份為PBoV 1/2型及3/4/5型混合感染，表明四川地區(qū)主要的流行毒株可能是PBoV 3/4/5型。

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

實(shí)時(shí)熒光定量PCR是結(jié)合常規(guī)PCR技術(shù)和光譜技術(shù)發(fā)展起來的一種新型分子生物學(xué)定量檢測技術(shù)，與常規(guī)PCR相比具有敏感性更高、全封閉反應(yīng)、不需核酸電泳檢測、實(shí)時(shí)定量等優(yōu)點(diǎn)。陳鵬強(qiáng)等[30]建立了PBoV5型SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量PCR，該方法在3.64×102copies/μL～3.64×107copies/μL范圍內(nèi)有很好的線性關(guān)系，擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線僅出現(xiàn)單一特異峰，無引物二聚體，Tm值為83.12℃±0.12℃，可重復(fù)性好，組內(nèi)變異系數(shù)為0.35%～1.24%，組間變異系數(shù)為0.43%～1.46%，此方法的建立為定量分析PBoV5型感染豬的感染程度和靶器官提供了精確檢測手段。鄧波等[31]根據(jù)PBoV序列，通過VP1/2基因設(shè)計(jì)引物和TaqMan探針，建立了檢測PBoV的實(shí)時(shí)熒光定量PCR，該方法檢測PPV、PRRSV、PCV2均為陰性，具有較高特異性，在107copies/mL～101copies/mL模板范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，所制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)為0.997，最低可檢測到101copies/mL的陽性質(zhì)粒，所建立的PBoV實(shí)時(shí)熒光定量PCR具有靈敏度高、特異性好和精確性高等優(yōu)點(diǎn)。熒光定量PCR的靈敏度雖高，但該方法對儀器設(shè)備和操作人員技術(shù)水平要求較高，一般基層實(shí)驗(yàn)室由于不具備實(shí)驗(yàn)條件而無法開展。

2.4 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)通過應(yīng)用多條特異性引物和具有鏈置換功能的DNA聚合酶可以實(shí)現(xiàn)等溫?cái)U(kuò)增，不需要特殊的儀器設(shè)備，操作方法簡單，肉眼判讀結(jié)果，更加直觀，方便。李帥偉等[32]應(yīng)用DNA Star生物學(xué)軟件對GenBank中PBoV進(jìn)行同源性分析，獲得PBoV保守靶序列，根據(jù)保守序列設(shè)計(jì)4條特異性引物，經(jīng)LAMP反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了檢測PBoV的LAMP檢測方法，并組裝了試劑盒，該試劑盒檢測豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)、豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemicdiarrhea virus,PEDV)、輪狀病毒(Rotavirus,RV)、PRRSV、PCV2、PPV均為陰性，可以檢測到10-6倍稀釋的PBoV陽性病料核酸DNA，實(shí)現(xiàn)了PBoV的體外快速診斷，該研究成果已經(jīng)申請國家發(fā)明專利。LAMP方法操作簡單、檢測快速，不需要昂貴的實(shí)驗(yàn)儀器，適合在基層臨床疫病診斷中推廣應(yīng)用。

2.5 間接免疫熒光

間接免疫熒光方法以熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體，通過抗原抗體的特異性結(jié)合，是用熒光抗體檢測相應(yīng)抗原的方法。McKillen J等[33]利用豬原代腎細(xì)胞建立了PBoV的原代細(xì)胞培養(yǎng)方法，通過間接免疫熒光試驗(yàn)判定病毒在細(xì)胞上的增殖情況，PBoV可以在豬原代腎細(xì)胞上生長復(fù)制并主要存在于豬原代腎細(xì)胞的細(xì)胞核中。間接免疫熒光方法根據(jù)抗原抗體特異性反應(yīng)原則，特異性強(qiáng)，敏感性高，但需要細(xì)胞培養(yǎng)等無菌操作較嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，操作復(fù)雜、繁瑣，專業(yè)人員需要一定的技術(shù)水平，一般基層實(shí)驗(yàn)室很難具備試驗(yàn)條件。

2.6 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

鄭英帥[34]分別對NP1基因和VP2基因進(jìn)行B細(xì)胞線性抗原表位的預(yù)測分析，設(shè)計(jì)合成特異性引物，采用降落PCR技術(shù)擴(kuò)增NP1基因和截短的VP2基因，并分別將其與原核表達(dá)載體pET32a連接，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后SDS-PAGE電泳可分別檢測到分子質(zhì)量約為44 ku和35 ku的蛋白，重組蛋白純化后經(jīng)Western blot結(jié)果顯示，NP1和VP2重組蛋白均與PBoV陽性血清具有良好的反應(yīng)原性，分別以純化的兩種重組蛋白作為包被抗原，通過對各自反應(yīng)條件的優(yōu)化，分別建立了檢測PBoV NP1抗體和VP2抗體的間接ELISA檢測方法，NP1-ELISA和VP2-ELISA檢測CSFV、PRRSV、PPV、PCV2陽性血清均為陰性，批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)均值都小于10%，臨床樣品檢測表明NP1-ELISA比VP2-ELISA的檢出率高，VP2-ELISA為PBoV感染的快速診斷與流行病學(xué)調(diào)查等提供了一種簡便、快速、高通量的血清學(xué)檢測方法。ELISA簡單、快速、敏感、特異、穩(wěn)定性好，非常適用于大批量樣品的檢測，具有良好的應(yīng)用前景。

3 小結(jié)與展望

國內(nèi)的現(xiàn)階段流行病學(xué)調(diào)查證明PBoV的感染情況，無論在健康豬群還是表現(xiàn)呼吸道以及腹瀉癥狀的豬群中都有很高的陽性率，PBoV值得關(guān)注和持續(xù)化監(jiān)測[35]。目前PBoV防控還沒有疫苗可以應(yīng)用，養(yǎng)豬場防控本病主要通過加強(qiáng)飼養(yǎng)管理和加強(qiáng)環(huán)境衛(wèi)生，定期做好疫病監(jiān)測，及時(shí)發(fā)現(xiàn)病情，及早隔離病豬。在PBoV的各種診斷方法之中，PCR和多重PCR簡單、快速，但該方法敏感性低于熒光定量PCR、LAMP等，容易出現(xiàn)漏檢。熒光定量PCR彌補(bǔ)了常規(guī)PCR不能定量的缺點(diǎn)，且其敏感性大大提高，但該方法對儀器、試劑、操作人員的要求均較高，限制了在基層獸醫(yī)部門的推廣應(yīng)用。LAMP是新興的分子生物學(xué)檢測方法，對儀器、試劑、操作人員的要求較低，特別適合基層獸醫(yī)部門適用，但敏感性太高，易導(dǎo)致假陽性結(jié)果。ELISA操作簡單、高通量，將是PBoV血清學(xué)抗體監(jiān)測的主要方法，具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。綜合判斷，PBoV的各種監(jiān)測方法均具有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，檢測人員可根據(jù)自身實(shí)驗(yàn)條件選擇適合的方法。相信隨著分子生物學(xué)和血清學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，PBoV的各種檢測方法亦會(huì)得到不斷完善，同時(shí)也會(huì)有更多的新型檢測方法不斷建立，不斷為PBoV的診斷、流行病學(xué)調(diào)查和防控提供技術(shù)保障。

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Advance in Etiology and Detection Methods of Porcine Bocavirus

WANG Yang1,LI Ling1,LI Zhen1, LI Feng1,2

(1.ShandongLvduBio-SciencesandTechnologyCo.Ltd.,Binzhou,Shandong,256600,China; 2.ShandongBinzhouAnimalScienceandVeterinaryMedicineAcademy,Binzhou,Shandong,256600,China)

Porcine bocavirus is a swine parvovirus recently discovered.In recent years the infection rate was increasing in China,and often mixed infection with other pathogens,thus increasing the difficulty of disease prevention and control.This paper makes a review on the etiology and detection methods of porcine bocavirus,in order to provide reference for improving the comprehensive prevention and control of porcine bocavirus in China.Key words:Porcine bocavirus;etiology;detection methods

2016-10-08

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)任務(wù)項(xiàng)目(SDAIT-08-17)

汪 洋(1973-)，男，安徽人，碩士，主要從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究。

S854.43;S852.659.2

A

1007-5038(2017)04-0098-04

*通訊作者