液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定大鼠血漿中靛藍(lán)的濃度及藥動(dòng)學(xué)研究

孔樹(shù)佳，李硯文（昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院/云南省腫瘤醫(yī)院藥劑科，昆明 650118）

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定大鼠血漿中靛藍(lán)的濃度及藥動(dòng)學(xué)研究

孔樹(shù)佳＊，李硯文#（昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院/云南省腫瘤醫(yī)院藥劑科，昆明 650118）

目的：建立測(cè)定大鼠血漿中靛藍(lán)濃度的方法，研究靛藍(lán)在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特征。方法：將18只大鼠隨機(jī)分為低、中、高劑量組，每組6只，分別ig 10、20、40 mg/kg的靛藍(lán)溶液。分別于給藥前和給藥后0.083、0.25、0.5、0.75、1、2、4、6、8、10、12、16、24、48、72 h眼眶采全血0.3 mL，分離血漿，甲醇沉淀后采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法測(cè)定靛藍(lán)的血藥濃度。色譜柱為Agilent Poroshell EC-C18，流動(dòng)相為甲醇-5 mmol/L乙酸銨溶液（95∶5，V/V），流速為0.4 mL/min；以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式進(jìn)行定量分析，用于監(jiān)測(cè)的離子對(duì)（m/z）為263.1～218.8（靛藍(lán)）和237.2～194.1（卡馬西平，內(nèi)標(biāo)）；采用DAS 3.0軟件計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。結(jié)果：靛藍(lán)檢測(cè)質(zhì)量濃度的線性范圍為0.5～100 ng/mL（r＝0.999 9），日內(nèi)、日間RSD均小于9%（n＝5），低、中、高質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品的基質(zhì)效應(yīng)分別為（98.25±3.71）%、（102.23±2.64）%、（102.29±3.79）%（n＝5）。靛藍(lán)在低、中、高劑量組大鼠體內(nèi)的tmax分別為（8.6±1.1）、（9.2±0.8）、（9.5±0.8）h，cmax分別為（30.9±8.6）、（44.9±10.1）、（96.1±17.4）ng/mL，t1/2分別為（14.9±2.1）、（16.3± 2.9）、（15.3±3.7）h，AUC0-72h分別為（366.6±83.4）、（694.9±105.8）、（1 223.42±108.7）ng·h/mL。結(jié)論：本方法靈敏度高、特異性好，可用于大鼠血漿樣品中靛藍(lán)的含量測(cè)定；靛藍(lán)在大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)特征符合非房室模型。

靛藍(lán)；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；大鼠；血漿；藥動(dòng)學(xué)

青黛，別名靛花、藍(lán)靛，主要含靛藍(lán)、靛玉紅、色胺酮和青黛酮等活性成分，具有清熱解毒、消肝瀉火、涼血止血、定驚之功效。近年來(lái)，青黛類(lèi)中藥被廣泛用于內(nèi)科、外科、兒科、婦科、傳染科等病癥的治療，引起了國(guó)內(nèi)外研究者的重視[1]。靛藍(lán)是青黛的主要成分之一，具有抗病毒作用[2]，對(duì)幽門(mén)螺旋桿菌的體外抗菌活性較好[3-4]，但其體內(nèi)過(guò)程文獻(xiàn)報(bào)道較少。目前對(duì)于靛藍(lán)的分析方法主要有高效液相色譜（HPLC）法[5]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）法[6]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）法[7]，大多用于中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)或體外試驗(yàn)測(cè)定，樣品分析時(shí)間長(zhǎng)、樣品前處理方法復(fù)雜、定量下限高，均不太適合用于生物樣本分析及體內(nèi)過(guò)程評(píng)價(jià)。在本研究中，筆者擬以卡馬西平為內(nèi)標(biāo)，建立以液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法[8]測(cè)定大鼠血漿中靛藍(lán)含量的分析方法，并將其用于靛藍(lán)在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究。

1 材料

1.1 儀器

5500 Q TRAPTM質(zhì)譜儀，配有電噴霧（ESI）離子源（美國(guó)AB Sciex公司）；30A系列超HPLC儀（日本島津公司）；H1650-W高速臺(tái)式離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)有限公司，離心半徑：20 cm）。

1.2 藥品與試劑

靛藍(lán)對(duì)照品（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：110716-201111，純度：≥98%）；卡馬西平對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100142-201004，純度：≥99%）；甲醇、乙酸銨為色譜純，其他試劑均為分析純，水為Milli-Q超純水。

1.3 動(dòng)物

SD大鼠，♂，體質(zhì)量200～220 g，購(gòu)自第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK（軍）2007-015、SCXK（渝）2007-0003。實(shí)驗(yàn)所使用大鼠的購(gòu)買(mǎi)、實(shí)驗(yàn)處置都嚴(yán)格遵循《第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理暫行規(guī)定》。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液 精密稱取靛藍(lán)對(duì)照品適量（相當(dāng)于靛藍(lán)10.0 mg），置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的貯備液。精密量取上述貯備液10μL，加入990μL甲醇，渦旋混勻，得10 μg/mL的對(duì)照品溶液，－20℃下保存，備用。

2.1.2 內(nèi)標(biāo)溶液 精密稱取卡馬西平對(duì)照品10.11 mg（相當(dāng)于卡馬西平10.0 mg），置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的貯備液。精密量取上述貯備液10μL，加入990μL甲醇，渦旋混勻，制得10 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液，－20℃下保存，備用。

2.2 色譜條件與質(zhì)譜條件

色譜柱：Agilent Poroshell EC-C18（150 mm×3.0 mm，2.7 μm）；流動(dòng)相：甲醇-5 mmol/mL乙酸銨溶液（95∶5，V/V，pH 6.8），流速：0.4 mL/min；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：2 μL。

靛藍(lán)和卡馬西平的離子化采用ESI離子源，正離子模式，以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式分析。離子源參數(shù)：氣簾氣為39 psi（1 psi＝6 895 Pa），霧化氣為88 psi，輔助加熱氣為89 psi，離子源溫度為500℃，離子源電壓為5 000 V。四級(jí)桿參數(shù)：靛藍(lán)監(jiān)測(cè)離子對(duì)（m/z）為263.1～218.8，去簇電壓（DP）為60 eV，碰撞能量（CE）為33 eV，碰撞池出口電壓（CXP）為3.3 eV；卡馬西平監(jiān)測(cè)離子對(duì)（m/z）為237.2～194.1，DP為100 eV，CE為26.3 eV，CXP為5.9 eV。

2.3 樣品處理

將40 ng/mL內(nèi)標(biāo)甲醇溶液1 mL加入到0.1 mL樣品中，渦旋混勻2 min，13 000 r/min離心5 min，取上清過(guò)0.22 μm微孔濾膜，濾液供LC-MS/MS上樣分析。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性試驗(yàn) 按相關(guān)專屬性試驗(yàn)方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在正離子模式下，靛藍(lán)和內(nèi)標(biāo)產(chǎn)生了質(zhì)子化的母離子[M+1]+。質(zhì)譜圖中可觀察到，靛藍(lán)主要的離子為m/z 263.1，內(nèi)標(biāo)主要的離子為m/z 237.2；靛藍(lán)強(qiáng)度最高的子離子為m/z 218.8，內(nèi)標(biāo)強(qiáng)度最高的子離子為m/z 194.1。在“2.2”項(xiàng)條件下，內(nèi)源性雜質(zhì)對(duì)待測(cè)物無(wú)干擾，靛藍(lán)和內(nèi)標(biāo)峰形良好，保留時(shí)間分別為2.92、2.16 min。靛藍(lán)和內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜圖見(jiàn)圖1，LC-MS/MS圖見(jiàn)圖2。 40、20、5、2、1、0.5 ng/mL的質(zhì)控樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，進(jìn)樣測(cè)定。以靛藍(lán)的峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值（y）與靛藍(lán)的質(zhì)量濃度（x）進(jìn)行回歸分析，得回歸方程為y＝0.049 3x+0.015 9（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，靛藍(lán)檢測(cè)質(zhì)量濃度的線性范圍為0.5～100 ng/mL，定量下限為0.5 ng/mL。

圖1 靛藍(lán)和內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜圖Fig 1 Spectrometry of indigo and internal standard

圖2 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜圖Fig 2 LC-MS/MS spectrometry

2.4.3 基質(zhì)效應(yīng)考察 分別以甲醇沉淀后的大鼠空白血漿和去離子水為溶劑，制備靛藍(lán)低、中、高質(zhì)量濃度（1、10、80 ng/mL）的樣品，每個(gè)質(zhì)量濃度5份，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，進(jìn)樣測(cè)定?；|(zhì)效應(yīng)（%）＝沉淀后空白血漿制備樣品的峰面積/去離子水制備樣品的峰面積× 100%；內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)效應(yīng)（%）＝靛藍(lán)的基質(zhì)效應(yīng)/內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)效應(yīng)×100%?；|(zhì)效應(yīng)考察結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 基質(zhì)效應(yīng)考察結(jié)果（±s，n＝5）Tab 1 Results of matrix effects（±s，n＝5）

表1 基質(zhì)效應(yīng)考察結(jié)果（±s，n＝5）Tab 1 Results of matrix effects（±s，n＝5）

待測(cè)物靛藍(lán)內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)效應(yīng)，% 94.83±8.27 98.63±6.62 98.72±6.12加入量，ng/mL 1 10 80 40內(nèi)標(biāo)基質(zhì)效應(yīng)，% 98.25±3.71 102.23±2.64 102.29±3.79 103.87±6.21

2.4.2 線性關(guān)系與定量下限考察 取大鼠空白血漿加入適量的靛藍(lán)對(duì)照品溶液，分別制備成含靛藍(lán)100、50、

2.4.4 精密度和準(zhǔn)確度試驗(yàn) 制備低、中、高質(zhì)量濃度（1、10、80 ng/mL）的質(zhì)控樣品，每個(gè)質(zhì)量濃度5份，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，進(jìn)樣測(cè)定，連續(xù)測(cè)定3 d，考察日內(nèi)、日間精密度和準(zhǔn)確度。結(jié)果顯示，低、中、高質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品的日內(nèi)RSD分別為8.13%、1.93%、2.48%（n＝5），日間RSD分別為3.27%、4.36%、4.85%（n＝3），準(zhǔn)確度分別為94.2%、103.2%、108.72%（n＝5）。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 制備低、中、高質(zhì)量濃度（1、10、80 ng/mL）的質(zhì)控樣品，分別置于室溫下4 h（n＝5）、自動(dòng)進(jìn)樣器內(nèi)24 h（n＝5）、－80℃下14 d（n＝5）、－80℃反復(fù)凍融3次（n＝5），再按“2.3”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣測(cè)定，考察穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，RSD均小于15%，表明靛藍(lán)的血漿樣品在上述條件下均穩(wěn)定。

2.5 藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)

將18只大鼠隨機(jī)分為低、中、高劑量組，每組6只，分別ig 10、20、40 mg/kg的靛藍(lán)溶液。分別于給藥前和給藥后0.083、0.25、0.5、0.75、1、2、4、6、8、10、12、16、24、48、72 h眼眶采血0.3 mL并抗凝，常溫下4 000 r/min（離心半徑：20 cm）離心5 min分離血漿后，－80℃下凍存。采用LC-MS/MS法測(cè)定血漿中靛藍(lán)的濃度，繪制藥-時(shí)曲線。各組大鼠體內(nèi)靛藍(lán)的藥-時(shí)曲線見(jiàn)圖3。

采用DAS 3.0軟件，按非房室模型測(cè)定靛藍(lán)的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。結(jié)果顯示，靛藍(lán)在大鼠體內(nèi)9 h左右達(dá)到峰濃度，t1/2約為15 h，cmax、AUC0-72h、AUC0-∞相對(duì)于給藥劑量呈近似線性的變化。各組大鼠體內(nèi)靛藍(lán)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表2。

圖3 各組大鼠體內(nèi)靛藍(lán)的藥-時(shí)曲線（n＝6）Fig 3 Concentration-time curves of indigo in rats in vivo in each group（n＝6）

表2 各組大鼠體內(nèi)靛藍(lán)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s，n＝6）Tab 2 Pharmacokinetic parameters of indigo in rats in vivo in each group（±s，n＝6）

表2 各組大鼠體內(nèi)靛藍(lán)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s，n＝6）Tab 2 Pharmacokinetic parameters of indigo in rats in vivo in each group（±s，n＝6）

參數(shù)tmax，h cmax，ng/mL t1/2，h MRT，h CL，L/h·kg AUC0-72h，ng·h/mL AUC0-∞，ng·h/mL低劑量組8.6±1.1 30.9±8.6 14.9±2.1 19.2±5.9 10.3±2.2 366.6±83.4 398.7±64.6中劑量組9.2±0.8 44.9±10.1 16.3±2.9 20.9±1.5 10.9±1.4 694.9±105.8 740.8±96.3高劑量組9.5±0.896.1±17.415.3±3.718.9±2.212.7±1.1 1 223.4±108.7 1 263.2±108.9

3 討論

3.1 色譜條件優(yōu)化

大鼠血漿中靛藍(lán)測(cè)定方法建立過(guò)程中，提高檢測(cè)的靈敏度是一個(gè)比較關(guān)鍵的問(wèn)題。本實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)[9-10]對(duì)方法建立過(guò)程的多個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行了優(yōu)化，使得定量下限為0.5 ng/mL。

筆者比較了水、乙腈、甲醇、甲醇-乙腈（1∶1，V/V）、甲醇-水（1∶1，V/V）、乙腈-水（1∶1，V/V）和甲醇-乙腈-水（1∶1∶1，V/V/V）、含0.1%甲酸的甲醇、含0.1%甲酸的乙腈、含0.1%甲酸的水、含0.1%甲酸的甲醇-乙腈（1∶1，V/ V）、含0.1%甲酸的甲醇-水（1∶1，V/V）、含0.1%甲酸的乙腈-水（1∶1，V/V）和含0.1%甲酸的甲醇-乙腈-水（1∶1∶1，V/V/V）對(duì)靛藍(lán)對(duì)照品的溶解效果，發(fā)現(xiàn)甲醇的溶解效果最好，且超聲（60 Hz，40℃）就能產(chǎn)生助溶效果。

筆者比較了乙腈和甲醇對(duì)待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)的洗脫效果，發(fā)現(xiàn)甲醇洗脫所得色譜峰更窄、峰形更好、靈敏度更高；比較了甲醇-水和甲醇-乙酸銨緩沖鹽體系，發(fā)現(xiàn)若體系中沒(méi)有乙酸銨，則有拖尾現(xiàn)象，而在流動(dòng)相中添加5 mmol/L乙酸銨后，對(duì)峰形有較大的改善。

筆者比較了等度洗脫[甲醇-5 mmol/L乙酸銨溶液（體積比依次為80∶20、85∶15、90∶10、95∶5）和甲醇]和梯度洗脫的效果，發(fā)現(xiàn)甲醇-5 mmol/L乙酸銨溶液（95∶5，V/V）洗脫時(shí)靈敏度最高，且出峰時(shí)間最短。

3.2 給藥劑量的設(shè)定

在前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)中，筆者進(jìn)行了給藥劑量的摸索，分別給予5、10、20、40、80 mg/kg，每個(gè)劑量組2只大鼠。結(jié)果發(fā)現(xiàn)5 mg/kg給藥劑量所測(cè)得的藥-時(shí)曲線上的點(diǎn)有1/3在本方法的定量下限以下，而80 mg/kg給藥劑量所得的藥-時(shí)曲線在tmax附近的點(diǎn)有超限的現(xiàn)象，在10～40 mg/kg的給藥劑量范圍內(nèi)所測(cè)定的血藥濃度都在工作曲線的線性范圍內(nèi)，故本實(shí)驗(yàn)采用10、20、40 mg/kg為給藥劑量。

3.3 取血時(shí)間點(diǎn)的設(shè)定

在前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)中，筆者通過(guò)每組2只大鼠所測(cè)定的血藥濃度，采用DAS 3.0軟件處理后獲得的tmax在8.5 h左右。根據(jù)采樣時(shí)間點(diǎn)的設(shè)計(jì)原則，即兼顧藥物的吸收相（吸收相至少需要2～3個(gè)采樣點(diǎn)）、平衡相（在cmax附近至少需要3個(gè)采樣點(diǎn)）和消除相（需要4～6個(gè)采樣點(diǎn)），整個(gè)采樣時(shí)間至少應(yīng)持續(xù)到3～5個(gè)半衰期，據(jù)此筆者設(shè)定了本研究的采血時(shí)間點(diǎn)。

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（編輯：鄒麗娟）

Concentration Determination of Indigo in Rats’Plasma by LC-MS/MS and Its Pharmacokinetics Study

KONG Shujia，LI Yanwen（Dept.of Pharmacy，the Third Affiliated Hospital of Kunming Medical University/ Yunnan Provincial Tumor Hospital，Kunming 650118，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the concentration determination of indigo in rats’plasma，and study the pharmacokinetic characteristics in rats in vivo.METHODS：18 rats were randomly divided into low-dose，medium-dose，high-dose＊主管藥師，碩士。研究方向：臨床藥物治療、藥事管理。電話：0871-68217128。E-mail：vampireicecream@163.com#通信作者：主治醫(yī)師。研究方向：腫瘤危重癥治療。電話：0871-68185656-2036。E-mail：liyw20008@163.comgroups，6 in each group，which were intragastrically administrated 10，20，40 mg/kg of indigo solution.The sample blood 0.3 mL was taken from eye socket before administration and 0.083，0.25，0.5，0.75，1，2，4，6，8，10，12，16，24，48，72 h after administration，separating the plasma，then LC-MS/MS was used to determine the plasma concentration of indigo after methanol precipitation.The column was Agilent Poroshell EC-C18with mobile phase consisting of methanol-5 mmol/L ammonium acetate solution（95∶5，V/V）at a flow rate of 0.4 mL/min；multiple reaction monitoring was conducted for the quantitative analysis，with ion pair of 263.1-218.8（indigo）and 237.2-194.1（carbamazepine，internal standard）.Pharmacokinetic parameters were calculated by DAS 3.0 software.RESULTS：The linear range of indigo was 0.5-100 ng/mL（r＝0.999 9），intra-day and inter-day RSDs were lower than 9%（n＝5）；matrix effects of low，medium and high does quality control samples were（98.25±3.71）%，（102.23± 2.64）%，（102.29±3.79）%（n＝5）.The pharmacokinetic parameters of indigo in low-dose，medium-dose，high-dose groups were tmaxof（8.6±1.1），（9.2±0.8）and（9.5±0.8）h；cmaxof（30.9±8.6），（44.9±10.1），（96.1±17.4）ng/mL；t1/2of（14.9±2.1），（16.3±2.9），（15.3±3.7）h；AUC0-72hof（366.6±83.4），（694.9±105.8），（1 223.42±108.7）ng·h/mL，respectively.CONCLUSIONS：The method shows high sensitivity，good specificity，and can be used for the content determination of indigo in plasma samples of rats.The pharmacokinetics of indigo in rats in vivo fits non-compartment model.

Indigo；LC-MS/MS；Rats；Plasma；Pharmacokinetics

R965

A

1001-0408（2017）07-0912-04

2016-07-25

2016-12-19）

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.07.14