阿苯達唑納米脂質(zhì)體凍干粉的制備及性質(zhì)考察Δ

陳 蓓，陳春燕，高惠靜，王建華，趙 軍（新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，烏魯木齊 830011）

阿苯達唑納米脂質(zhì)體凍干粉的制備及性質(zhì)考察Δ

陳 蓓＊，陳春燕，高惠靜，王建華，趙 軍#（新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，烏魯木齊 830011）

目的：制備阿苯達唑納米脂質(zhì)體凍干粉并對其性質(zhì)進行考察。方法：利用冷凍干燥法制備阿苯達唑納米脂質(zhì)體凍干粉，以粒徑、包封率聯(lián)合外觀、再分散性為指標，采用單因素試驗聯(lián)合正交試驗篩選凍干處方工藝。考察凍干前、后脂質(zhì)體的形態(tài)學(xué)變化、粒徑、Zeta電位、水分含量、4℃下12個月的穩(wěn)定性。結(jié)果：采用外加凍干保護劑的總量為10%，其中葡萄糖-海藻糖-甘露醇配比為1.0∶1.0∶3.0，以速凍的方式，于－35℃冰箱預(yù)凍18 h，冷凍干燥48 h獲得凍干粉。與凍干前比較，凍干后脂質(zhì)體形態(tài)未發(fā)生明顯變化，可見清晰的磷脂雙分子層膜結(jié)構(gòu)；凍干前、后脂質(zhì)體的粒徑分別為（208.63±1.04）、（223.04±2.02）nm，Zeta電位分別為 （－15.6±0.04）、（－19.4±0.06）mV，包封率分別為（94.62±0.49）%、（91.10±0.46）%（n＝3）；與脂質(zhì)體比較，脂質(zhì)體凍干粉在4℃下12個月較穩(wěn)定。結(jié)論：成功制得阿苯達唑納米脂質(zhì)體凍干粉，其穩(wěn)定性優(yōu)于阿苯達唑納米脂質(zhì)體，凍干工藝可行。

阿苯達唑；納米脂質(zhì)體；凍干粉；粒徑；包封率；穩(wěn)定性；正交試驗

包蟲病是一種嚴重危害人畜健康的寄生蟲病，新疆是包蟲病高發(fā)區(qū)。阿苯達唑（Albendazole，ABZ）是世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦抗包蟲的主要藥物之一，但是因其水溶性差、腸道吸收不好、生物利用度不高，嚴重影響了其療效[1]。ABZ納米脂質(zhì)體（NL-ABZ）是針對上述問題而研究的一種新型給藥系統(tǒng)。NL-ABZ的處方包含0.5%～1.0%阿苯達唑、1.0%～3.0%卵磷脂、0～0.3%苯甲酸鈉、0～0.02%抗氧劑和0.7%～0.9%氯化鈉溶液，平均粒徑為200 nm，制備工藝為微射流高壓均質(zhì)工藝。大鼠預(yù)實驗結(jié)果表明，與普通ABZ脂質(zhì)體（L-ABZ）相比，NL-ABZ的生物利用度顯著提高。然而液態(tài)的納米脂質(zhì)體混懸液的物理化學(xué)穩(wěn)定性差，磷脂也易水解氧化，并且藥物也容易泄漏，且粒子的聚集導(dǎo)致粒徑變大[2]，是其應(yīng)用于臨床的主要局限。真空冷凍干燥技術(shù)制備凍干脂質(zhì)體是目前解決液態(tài)脂質(zhì)體不能長期儲存、提高脂質(zhì)體穩(wěn)定性的最佳方法。凍干制劑特有的疏松多孔結(jié)構(gòu)，可以使藥物易于重新復(fù)溶而恢復(fù)活性；而且凍干制劑含水量低，易長期穩(wěn)定保存，可以有效避免脂質(zhì)體以水溶液方式貯存導(dǎo)致的易氧化、水解、聚集、分層、滲漏等問題[3-5]。本研究擬制備NL-ABZ凍干粉，優(yōu)化凍干處方工藝，并考察凍干制劑的理化性質(zhì)和穩(wěn)定性。

1 材料

1.1 儀器

FDU-1100冷凍干燥機（東京理化器械株式會社）；ZEN3690激光粒度分布儀（英國馬爾文公司）；JSM-1230透射電子顯微鏡（日本電子株式會社）；HS153梅特勒水分測定儀（瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2 藥品與試劑

ABZ原料藥（廣西桂林南藥股份有限公司，批號：M-D60605，純度：99%）；大豆磷脂Epikuron 200（德國Lucas Meyer Gmbh公司）；0.9%氯化鈉注射液（國藥集團新疆制藥有限公司，批號：20130122）；葡萄糖（天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司，批號：20120618）；麥芽糖（上海藍季科技發(fā)展有限公司，批號：20120812）；海藻糖（國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號：20120702）；蔗糖、乳糖（天津市天新精細化工開發(fā)中心，批號：20120710、20120909）；甘露醇（天津永晟精細化工有限公司，批號：20121001）；木糖醇、山梨醇（天津市光復(fù)精細化工研究所，批號：20121113、20120309）；以上試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 凍干粉評價指標

2.1.1 粒徑 測定復(fù)溶后的納米脂質(zhì)體凍干粉粒徑，與凍干前納米脂質(zhì)體粒徑變化不大者為佳。

2.1.2 包封率 測定復(fù)溶后的納米脂質(zhì)體凍干粉包封率[6]，比凍干前納米脂質(zhì)體包封率降低較少者為佳。

2.1.3 外觀 以保持原體積、飽滿、不皺縮、不塌陷、可整塊脫落但不散碎為佳。以“+++”表示松散、光滑、平整飽滿；“++”表示輕度皺縮、塌陷；“+”表示嚴重皺縮、塌陷；“-”表示不能成型。

2.1.4 再分散性 取納米脂質(zhì)體凍干粉，加入與凍干前同體積的0.9%氯化鈉注射液，振搖分散。振搖后能很快分散、無不溶顆粒或團塊，得到均勻的納米脂質(zhì)體混懸液者為佳。以“+++”表示振搖1 min內(nèi)能復(fù)溶成均勻混懸液，無不溶顆?；驁F塊；“++”表示振搖1～3 min內(nèi)能復(fù)溶成較均勻混懸液，肉眼可見少量不溶顆粒；“+”表示振搖5 min仍不能復(fù)溶成較均勻混懸液，黏壁，肉眼可見部分不溶顆?；驁F塊。

2.2 統(tǒng)計學(xué)方法

2.3 NL-ABZ的制備

取處方量的ABZ原料藥、大豆磷脂，按質(zhì)量比1∶2混合，加入至適量冰醋酸中溶解，快速攪拌下快速加入氫氧化鈉溶液中和，調(diào)pH至6～7。置于透析袋內(nèi)以0.9%氯化鈉注射液透析，冰水浴超聲40 min，4 000 r/min（離心半徑：6 cm）離心15 min。棄上清，加苯甲酸鈉和0.9%氯化鈉注射液制得脂質(zhì)體初品，再以微射流高壓均質(zhì)處理得到NL-ABZ，規(guī)格為10 g/L。

2.4 NL-ABZ凍干工藝的考察

凍干工藝一般分為預(yù)凍、升華干燥、解析干燥3步[7]。本試驗以10%甘露醇為凍干保護劑，以粒徑和包封率為主要評價指標，以凍干樣品外觀和再分散性為輔助參考指標，分別對預(yù)凍方式、預(yù)凍溫度、預(yù)凍時間及干燥時間進行單因素考察。

2.4.1 預(yù)凍方式 預(yù)凍方式分為慢凍和速凍2種。本試驗分別考察了速凍（直接于－35℃放置18 h）、慢凍（4℃放置1 h，－18℃放置12 h，－35℃放置5 h）條件對凍干產(chǎn)品的影響。結(jié)果顯示，速凍優(yōu)于慢凍。

2.4.2 預(yù)凍溫度 根據(jù)文獻[8]報道，預(yù)凍的最低溫度至少要低于樣品共熔點以下10℃。本試驗考察了預(yù)凍溫度分別為－18、－35、－80℃時對凍干產(chǎn)品的影響。結(jié)果顯示，最適預(yù)凍溫度為－35℃。

2.4.3 預(yù)凍時間 如果預(yù)凍時間過短，在干燥階段易導(dǎo)致噴瓶，影響包封率及外觀；預(yù)凍時間過長又會增加不必要的能耗[9]。本試驗考察了預(yù)凍時間分別為12、18、24 h時對凍干產(chǎn)品的影響。結(jié)果顯示，最適預(yù)凍時間為18 h。

2.4.4 干燥時間 干燥時間決定了樣品中的含水量，干燥時間不夠，樣品中含有較高的水分，外觀塌陷，復(fù)溶時極易黏壁，造成產(chǎn)品外觀和再分散性都不理想。本試驗考察了總干燥時間分別為24、36、48 h時對凍干產(chǎn)品的影響。結(jié)果顯示，最適干燥時間為48 h。

2.5 凍干保護劑的篩選

以粒徑和包封率為主要評價指標，以凍干樣品外觀和再分散性為輔助參考指標，對凍干保護劑進行篩選。2.5.1 加入方式 凍干保護劑的加入方式分為外加和內(nèi)加2種。本試驗以10%甘露醇為凍干保護劑，考察了內(nèi)加、外加對凍干產(chǎn)品的影響。結(jié)果顯示，內(nèi)加、外加方式制得的NL-ABZ凍干粉復(fù)溶后的粒徑分別為（255.30±3.32）、（251.71±2.61）nm，包封率分別為（75.90±1.18）%、（76.53±0.61）%，外觀分別為“++”“++”，再分散性分別為“++”“++”。這表明凍干保護劑的加入方式對該凍干制劑的上述指標無明顯影響（P＞0.05），但外加凍干保護劑的用量較少，便于清洗高壓均質(zhì)機，故確定采用外加方式。

2.5.2 單一凍干保護劑的篩選 固定凍干保護劑總量為10%，以不加任何凍干保護劑所制得的NL-ABZ凍干粉作為陰性對照，考察不同單一凍干保護劑（葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇）對凍干產(chǎn)品的影響，結(jié)果見表1。

由表1可知，各種凍干保護劑單獨使用均不能達到凍干制劑的要求。綜合考察，以甘露醇、葡萄糖、海藻糖三者合用作為凍干保護劑，以期達到滿意的效果。

2.5.3 正交試驗優(yōu)選凍干保護劑 以葡萄糖（A）、海藻糖（B）、甘露醇（C）3種凍干保護劑的質(zhì)量比為因素，每個因素設(shè)3個水平，以綜合評分[（最小粒徑/平均粒徑）× 50%+（平均包封率/最大包封率）×50%]為指標，按L9（34）表設(shè)計正交試驗。因素與水平見表2，正交試驗設(shè)計與結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。

由表3可知，對綜合評分的影響大小先后順序為A＞C＞B；由表4可知，A和C對綜合評分均有顯著影響（P＜0.05）。綜合考慮，確定最優(yōu)凍干保護劑處方為A1B1C1，即葡萄糖-海藻糖-甘露醇（1.0∶1.0∶3.0）。為驗證上述結(jié)果的重現(xiàn)性，保證納米脂質(zhì)體凍干粉制備工藝的穩(wěn)定可行，按上述條件制備3批凍干粉進行驗證試驗。結(jié)果顯示，3批凍干粉復(fù)溶后粒徑為（223.04± 2.02）nm，包封率為（91.10±0.46）%。

2.5.4 凍干保護劑總量的考察 固定葡萄糖-海藻糖-甘露醇質(zhì)量比為1.0∶1.0∶3.0，考察凍干保護劑總量分別為4%、8%、12%、16%、20%時對凍干產(chǎn)品的影響，結(jié)果見表5。

表1 不同單一凍干保護劑對凍干粉的影響（n＝3）Tab 1 Effects of different single freeze-dried protective agents on freeze-dried powder（n＝3）

表2 因素與水平Tab 2 Factors and levels

表3 正交試驗設(shè)計與結(jié)果Tab 3 Design and results of orthogonal test

表4 方差分析結(jié)果Tab 4 Result of variance analysis

表5 不同總量凍干保護劑對凍干粉的影響（n＝3）Tab 5 Effects of freeze-dried protective agents with different contents on freeze-dried powder（n＝3）

由表5可知，當凍干保護劑總量為10%、12%時，凍干產(chǎn)品粒徑、包封率、外觀和再分散性等指標均為最佳?？紤]到制備成本，最后確定凍干保護劑總量為10%。

綜上所述，取NL-ABZ，外加10%凍干保護劑[葡萄糖-海藻糖-甘露醇（1.0∶1.0∶3.0）]，－35℃預(yù)凍18 h，干燥48 h，制得NL-ABZ凍干粉。

2.6 NL-ABZ凍干粉的性質(zhì)考察

2.6.1 形態(tài)學(xué) 取適量NL-ABZ及NL-ABZ凍干粉，加入0.9%氯化鈉注射液稀釋。用1%醋酸雙氧鈾負染法制樣，干燥后置于透射電子顯微鏡下觀察形態(tài)，結(jié)果見圖1。

圖1 NL-ABZ和NL-ABZ凍干粉的電鏡圖（×7 000）Fig 1 Electron microscopy of NL-ABZ and NL-ABZ freeze-dried power（×7 000）

由圖1可見，NL-ABZ外觀圓整、大小均一，可清晰觀察到磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)。NL-ABZ凍干粉復(fù)溶后脂質(zhì)體形態(tài)未發(fā)生明顯改變，有清晰的磷脂雙分子層膜結(jié)構(gòu)。

2.6.2 粒徑和Zeta電位 取適量NL-ABZ及NL-ABZ凍干粉，加入0.9%氯化鈉注射液稀釋，混勻后采用激光粒度分布儀測定粒徑和Zeta電位。結(jié)果顯示，NL-ABZ（凍干前）的平均粒徑為（208.63±1.04）nm，Zeta電位為（－15.60±0.04）mV；NL-ABZ凍干粉（凍干后）復(fù)溶后的平均粒徑為（223.04±2.02）nm，Zeta電位為（－19.40±0.06）mV，表明凍干前后粒徑及Zeta電位無顯著變化。NL-ABZ凍干前、后的粒徑分布見圖2，Zeta電位見圖3。

2.6.3 水分含量 采用梅特勒水分測定儀測定NL-ABZ凍干粉的含水量為3.12%（＜5%），說明處方工藝可行。

2.6.4 穩(wěn)定性 以粒徑、包封率、磷脂氧化指數(shù)、ABZ含量為指標，分別考察4℃條件下NL-ABZ（凍干前）和NL-ABZ凍干粉（凍干后）12個月內(nèi)的穩(wěn)定性，結(jié)果見表6。

圖2 NL-ABZ凍干前、后的粒徑分布Fig 2 Particle size distributions of NL-ABZ before and after freeze-drying

圖3 NL-ABZ凍干前、后的Zeta電位Fig 3 Zeta potentials of NL-ABZ before and after freeze-drying

表6 4℃下12個月內(nèi)的穩(wěn)定性試驗結(jié)果（n＝3）Tab 6 Results of stability test within 12 months at 4℃（n＝3）

由表6可知，NL-ABZ在4℃下貯存，隨放置時間的延長，其外觀逐漸變黃，粒徑增大的幅度較大；6個月時磷脂氧化指數(shù)略超過0.2，磷脂被氧化；9個月時包封率已下降至70%以下；12個月時ABZ含量與0個月時比較顯著下降（P＜0.05）。NL-ABZ凍干粉于4℃下貯存，放置12個月的外觀、粒徑、包封率、磷脂氧化指數(shù)及ABZ含量與0個月時比較均無明顯變化（P＞0.05）。由此可見，凍干工藝能明顯延長NL-ABZ在4℃下的穩(wěn)定性。

3 討論

糖類凍干保護劑能夠有效防止脂質(zhì)體在冷凍干燥過程中的破壞，目前主要認為有兩大機制：玻璃化和水取代機制[10]。預(yù)凍過程中，糖類溶液作為保護劑能誘導(dǎo)玻璃態(tài)的生成，使磷脂膜免受冰晶的機械破壞，減小冰晶嵌入脂質(zhì)體雙分子層膜的概率，防止膜破裂；同時可以作為間隔基質(zhì)，阻礙脂質(zhì)體粒子之間的相互融合和聚集，但本身屬于無定形保護劑，在凍干時不會有良好的外觀[11]。另一個保護機制是水取代機制。糖類作為凍干保護劑可與脂質(zhì)體中磷脂的頭部基團形成氫鍵，脫水后代替水分作為脂質(zhì)體的保護劑，保持脂質(zhì)體雙分子膜的完整性，避免包封藥物的泄漏[12]。

醇類凍干保護劑甘露醇由于自身結(jié)晶的支撐能力，容易獲得飽滿的外觀，但是結(jié)晶的形成又會對脂質(zhì)體膜造成機械破壞，導(dǎo)致脂質(zhì)體的包封率下降和粒徑的增大。

然而一個合格的脂質(zhì)體凍干粉制劑應(yīng)同時滿足兩個條件：（1）需要有玻璃態(tài)（無定形）存在，能保護脂質(zhì)體膜不受到冰晶的機械破壞作用；（2）外觀飽滿、平整、致密，有一定硬度，在升華干燥階段不會塌陷。這是兩個相互制約的方面。而本文考察的各種保護劑單獨使用也均不能同時滿足上述兩個條件，因此對所有納入的凍干保護劑進行了兩兩搭配。結(jié)果表明，將糖類與醇類聯(lián)用時，不僅能獲得良好的外觀和再分散性，復(fù)溶后的脂質(zhì)體粒徑和包封率較凍干前也無明顯變化（P＞0.05），能夠獲得滿意的凍干保護效果。

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Preparation and Properties Study of Albendazole Nanoliposomes Freeze-dried Powder

CHEN Bei，CHEN Chunyan，GAO Huijing，WANG Jianhua，ZHAO Jun（Dept.of Pharmacy，the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，Urumqi 830011，China）

OBJECTIVE：To prepare the Albendazole nanoliposomes freeze-dried power and study its properties.METHODS：Freeze-drying method was conducted to prepare Albendazole nanoliposomes freeze-dried power，using the particle size，encapsulation efficiency，appearance，redispersibility as indexes，single factor test was combined with orthogonal test to screen freeze-drying preparation technology.The morphological changes，particle size，Zeta potential，moisture content，12 months stability at 4℃before and after freeze-drying were detected.RESULTS：Plus a total content of freeze-dried protective agent was 10%，the ratio of glucose-trehalose-mannitol was 1.0∶1.0∶3.0，using quick-freeze，pre-freezing 18 h in－35℃refrigerator，dry-freezing 48 h to obtain freeze-dried powder.Compared with before freeze-drying，the freeze-dried liposomal morphology had no obvious changes，showing clear phospholipid bilayer membrane structure；the particle sizes before and after freeze-drying were（208.63±1.04）nm and（223.04±2.02）nm，Zeta potentials were（－15.6±0.04）mV and（－19.4±0.06）mV，encapsulation efficiencies were（94.62±0.49）%and（91.10±0.46）%（n＝3），respectively.Compared with liposomes，liposomes freeze-dried power had good stability in 12 months at 4℃.CONCLUSIONS：Albendazole nanoliposomes freeze-dried power is prepared successfully，its stability is superior to albendazole nanoliposomes，and the freeze-drying technology is feasible.

Albendazole；Nanoliposomes；Freeze-dried powder；Particle size；Encapsulation efficiency；Stability；Orthogonal test

R943

A

1001-0408（2017）07-0967-04

2016-07-29

2016-09-15）

（編輯：鄒麗娟）

新疆重大疾病醫(yī)學(xué)重點實驗室——省部共建國家重點實驗室培育基地開放項目（No.SKLIB-XJMDR-2014-10）

＊主管藥師，碩士。研究方向：藥物新制劑。電話：0991-4363438。E-mail：chenbei_lisa@163.com

#通信作者：主任藥師，碩士。研究方向：新藥研發(fā)。電話：0991-4363438。E-mail：1184888385@qq.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.07.30