厚樸麻黃湯對哮喘小鼠血清IgE、IL-4、IL-13及半胱氨酰白三烯水平的影響*

孟 泳，崔應(yīng)麟，李 彬

河南省中醫(yī)院呼吸科 鄭州 450002

厚樸麻黃湯對哮喘小鼠血清IgE、IL-4、IL-13及半胱氨酰白三烯水平的影響*

孟 泳，崔應(yīng)麟#，李 彬

河南省中醫(yī)院呼吸科 鄭州 450002

#通信作者，男，1963年10月生，碩士，主任醫(yī)師，教授，研究方向：內(nèi)科疾病的中醫(yī)藥防治，E-mail：mywd1966@sina.com

支氣管哮喘；厚樸麻黃湯；IgE；IL-4；IL-13；CysLTs；小鼠

目的：觀察厚樸麻黃湯對哮喘小鼠肺組織病理學(xué)改變及血清IgE、IL-4、IL-13、半胱氨酰白三烯(CysLTs)水平的影響。方法：60只小鼠分為空白組、模型組、西藥組、中藥低劑量組、中藥中劑量組和中藥高劑量組，每組10只。制備哮喘小鼠模型，中藥各治療組分別給予厚樸麻黃湯(16、32、64 g/kg)進(jìn)行干預(yù)。西藥組給予地塞米松(0.3 mg/kg)進(jìn)行干預(yù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，光鏡下觀察各組小鼠肺組織病理學(xué)改變，ELISA法檢測血清IgE、IL-4、IL-13及CysLTs的水平。結(jié)果：中藥各治療組可不同程度地減輕哮喘小鼠的肺組織病理學(xué)改變。與模型組相比，中藥低、中、高劑量組血清IgE、IL-4、IL-13及CysLTs水平均降低(P均<0.05)；與西藥組相比，中藥低、中劑量組上述各指標(biāo)均升高(P均<0.05)。結(jié)論：厚樸麻黃湯能夠減輕哮喘小鼠肺組織病理學(xué)改變，降低血清IgE、IL-4、IL-13及CysLTs水平，抑制炎癥因子產(chǎn)生，從而減輕氣道炎癥。

支氣管哮喘是一種以慢性氣道炎癥為特征的異質(zhì)性疾病[1]。該病的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，研究[2]發(fā)現(xiàn)免疫-炎癥反應(yīng)與該病的發(fā)病密切相關(guān)，以IgE介導(dǎo)的Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)在該病的發(fā)病過程中起重要作用；由T淋巴細(xì)胞分泌產(chǎn)生的Th1、Th2比值失衡及Th2細(xì)胞活化亢進(jìn)是該病重要的發(fā)病機(jī)制[3-4]，而Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-13等。半胱氨酰白三烯(cysteinyl leukotrienes，CysLTs)是一類重要的炎性介質(zhì)，在其特異性受體介導(dǎo)下能增加嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤，使氣道壁水腫，分泌物增多，導(dǎo)致支氣管收縮，在哮喘的發(fā)病過程中起重要作用[5]。該實(shí)驗(yàn)中作者采用不同劑量厚樸麻黃湯灌胃哮喘小鼠，觀察其對哮喘小鼠肺組織病理學(xué)改變及血清IgE、IL-4、IL-13、CysLTs 水平的影響。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 SPF級雌性昆明小鼠60只，7～8周齡，體重(20±2) g，購于河南省實(shí)驗(yàn)動物中心[SCXK(豫)2015-0004]。小鼠飼養(yǎng)于河南省中醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心[SYXK(豫)2011-0002]，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)相對濕度為30%～60%，溫度為(22±2) ℃，維持12 h光照/12 h黑暗。60只小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為6組，每組10只。A組：空白組；B組：模型組；C組：西藥組；D組：中藥低劑量組；E組：中藥中劑量組；F組：中藥高劑量組。

1.2 藥物及試劑 厚樸麻黃湯：厚樸15 g，細(xì)辛6 g，杏仁9 g，麻黃12 g，五味子6 g，干姜6 g，半夏9 g，生石膏30 g，小麥30 g。飲片由河南省中醫(yī)院門診藥房提供并煎煮，分為高、中、低劑量組，分別相當(dāng)于原中藥飲片4、2、1 kg/L的藥液。地塞米松片(0.75 mg/片，廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司)，配成0.02 g/L藥液。雞卵白蛋白(OVA，Sigma公司)，氫氧化鋁(上海恒斐生物科技有限公司)，IgE、IL-4、IL-13及CysLTs檢測試劑盒(上海恒盛醫(yī)療器械有限公司)。

1.3 主要設(shè)備 IVC獨(dú)立送風(fēng)隔離籠具及超凈工作臺 (蘇州馮氏實(shí)驗(yàn)動物設(shè)備有限公司)，日本Nikon細(xì)胞工作站，美國Thermo Multiskan FC型酶標(biāo)儀，魚躍402B超聲霧化器(上海龐馳醫(yī)療器械有限公司)。

1.4 模型制備及藥物干預(yù) 參考文獻(xiàn)[6-7]，采用OVA和氫氧化鋁致敏并用OVA激發(fā)的方法制備哮喘小鼠模型，模型成功標(biāo)準(zhǔn)包括行為改變和肺組織病理學(xué)改變：出現(xiàn)煩躁不安、抓耳撓鼻、呼吸深快、口鼻發(fā)紺等癥狀；肺組織光鏡下見各級支氣管及管壁周圍有大量炎癥細(xì)胞浸潤，支氣管黏膜水腫、增厚，管腔狹窄等。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，除A組外，其余5組小鼠分別于第0、7、14天腹腔注射致敏液0.2 mL(含 OVA 50 μg 和氫氧化鋁1 mg)。從第21天開始B、C、D、E、F組小鼠置于自制密閉透明容器內(nèi)給予10 g/L OVA霧化激發(fā)，30 min/次，1次/d，共10 d；A組小鼠給予等體積生理鹽水霧化。藥物干預(yù)：第21～30天，每次霧化吸入前30 min，D組按16 g/kg灌胃厚樸麻黃湯，0.5 mL/d；E組按32 g/kg灌胃厚樸麻黃湯，0.5 mL/d；F組按64 g/kg灌胃厚樸麻黃湯，0.5 mL/d；C組按0.3 mg/kg灌胃地塞米松，0.5 mL/d；A、B組每天均給予0.5 mL生理鹽水灌胃。

1.5 血清IgE、IL-4、IL-13及CysLTs 水平的檢測

藥物干預(yù)結(jié)束后，用水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，摘眼球取血，無菌干燥管收集標(biāo)本，靜置1 h，4 ℃ 2 000 r/min離心10 min分離血清，用ELISA法檢測血清IgE、IL-4、IL-13及CysLTs 水平。

1.6 肺組織HE染色 打開胸腔取出左側(cè)肺組織，石蠟包埋，切片，HE染色。主要步驟：切片脫蠟至水；蘇木素染色3 min；水洗，體積分?jǐn)?shù)1%鹽酸乙醇分色10 s；水洗，伊紅染色10 min；水洗，梯度乙醇脫水；二甲苯透明，中性樹膠封片；顯微鏡下觀察。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組小鼠血清IgE、IL-4、IL-13及CysLTs 水平的比較均采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 小鼠行為觀察 隨著霧化次數(shù)的增加，B組小鼠皮毛逐漸失去光澤，口鼻發(fā)紺，煩躁不安，呼吸深快，抓耳撓鼻等；C、D、E、F組小鼠在激發(fā)的過程中，隨著藥物的干預(yù)，上述癥狀逐漸減輕；A組小鼠無異常。

2.2 小鼠肺組織HE染色觀察 A組小鼠各級支氣管及肺泡的結(jié)構(gòu)完整，無明顯炎癥細(xì)胞浸潤。B組小鼠各級支氣管及管壁周圍有大量炎癥細(xì)胞浸潤，以嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞為主,支氣管黏膜水腫、增厚,管腔狹窄，黏液分泌增多。其余各組與B組相比，肺組織病理學(xué)改變均有不同程度的減輕，其中C組與F組病理學(xué)改變減輕最明顯。見圖1。

A～F:分別為A～F組。圖1 各組小鼠肺組織HE染色結(jié)果(×400)

2.3 各組小鼠血清IgE、CysLTs水平比較 結(jié)果見表1。

表1 各組小鼠血清IgE、CysLTs水平比較 ng/L

*：與A組相比，P<0.05；#：與B組相比，P<0.05；△：與C組相比，P<0.05。

2.4 各組小鼠血清IL-4、IL-13水平比較 結(jié)果見表2。

表2 各組小鼠血清IL-4、IL-13水平比較 ng/L

*：與A組相比，P<0.05；#：與B組相比，P<0.05；△：與C組相比，P<0.05。

3 討論

哮喘屬于祖國醫(yī)學(xué)“哮病”范疇，其基本病理變化為外邪引動“伏痰”，痰隨氣升，氣因痰阻，痰氣互結(jié)，壅塞氣道，肺氣宣降功能失常，而見痰鳴如吼、氣急喘促[8]。常見證型有寒哮、熱哮、寒包熱哮等；其中，寒包熱哮證多為痰熱內(nèi)蘊(yùn)，復(fù)感風(fēng)寒，治療應(yīng)解表散寒、清化痰熱。厚樸麻黃湯出自《金匱要略》，正具此作用。方中麻黃解表散寒、宣肺平喘，厚樸燥濕消痰、利氣平喘，共為君藥。半夏、杏仁降氣化痰止咳，共為臣藥。五味子生津益氣，扶正以祛邪外出，并可防諸藥辛散耗氣傷陰；干姜、細(xì)辛溫肺化飲，痰飲內(nèi)停，郁久生熱；生石膏可瀉肺中邪熱，四藥共為佐藥。小麥甘涼，既能調(diào)和脾胃，又可助生石膏清除郁熱，為使藥。諸藥配伍，共奏解表散寒、宣肺祛痰、利氣平喘之效。

IgE介導(dǎo)的Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)在哮喘的發(fā)病過程中起重要作用，Th2細(xì)胞亞群主要分泌IL-4、IL-5、IL-13等細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞的聚集，輔助B細(xì)胞產(chǎn)生IgE等，介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答及Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)。CysLTs是參與哮喘發(fā)病過程最重要的炎癥介質(zhì)之一[9]，其可促使嗜酸性粒細(xì)胞聚集，引起氣道黏液分泌、支氣管收縮和氣體交換障礙，最終引起氣道重塑[10-11]。該研究結(jié)果顯示，與A組相比，B組小鼠肺組織有大量炎癥細(xì)胞浸潤，血清IgE、IL-4、IL-13及CysLTs水平均明顯升高；不同劑量厚樸麻黃湯干預(yù)后，與B組相比，中藥各治療組肺組織病理學(xué)改變有不同程度的減輕，小鼠一般狀態(tài)好轉(zhuǎn)，血清IgE、IL-4、IL-13及CysLTs水平均明顯下降，其中F組下降最明顯；且D、E組與C組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示F組與C組作用類似，D、E組療效弱于C組。因此探索最佳濃度是下一步研究的方向之一。

綜上，厚樸麻黃湯能夠改善哮喘小鼠的一般狀態(tài)，減輕肺組織的病理學(xué)改變，降低血清IgE、IL-4、IL-13及CysLTs水平，抑制炎癥因子產(chǎn)生，從而減輕氣道炎癥。

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(2016-08-04收稿 責(zé)任編輯姜春霞)

Effects of Houpu Mahuang Decoction on serum levels of IgE, IL-4, IL-13 and cysteinyl leukotrienes in asthmatic mice

MENGYong，CUIYinglin，LIBin

DepartmentofRespiratoryMedicine,HenanTraditionalChineseMedicineHospital，Zhengzhou450002

bronchial asthma；Houpu Mahuang Decoction；IgE；IL-4；IL-13；CysLTs;mouse

Aim: To observe the effects of Houpu Mahuang Decoction on asthmatic mice′s lung pathological changes and serum IgE, IL-4, IL-13, cysteinyl leukotrienes(CysLTs) levels. Methods: A total of 60 mice were allocated into control group,model group,western medicine group,low dose Chinese medicine group,middle dose Chinese medicine group,and high dose Chinese medicine group. The mice model of asthma was prepared. The mice in Chinese medicine groups were given Houpu Mahuang Decoction at high, middle and low doses(16, 32, 64 g/kg), and those in western medicine group was given dexamethasone solution(0.3 mg/kg).The pathological changes of the lung tissue of the mice were observed. The serum IgE, IL-4, IL-13 and CysLTs levels were determined by ELISA. Results: The pathological changes of lung tissue of mice in 3 Chinese medicine groups improved in different degrees. Compared with the model group, serum IgE, IL-4, IL-13 and CysLTs levels of the Chinese medicine groups significantly decreased(P<0.05). Compared with the western medicine group, the above indexes of the low and middle Chinese medicine groups significantly increased(P<0.05).Conclusion: Houpu Mahuang Decoction could alleviate the pathological changes in lung tissue of asthmatic mice, reduce serum IgE, IL-4, IL-13 and CysLTs, inhibit inflammatory cytokine production, thereby reducing the airway inflammation.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.02.022

*河南省重點(diǎn)科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目 152102310107

R562.25