紫薯花青素超聲波輔助酶法提取工藝優(yōu)化及其抗氧化性研究

徐 穎樊 凡 陰鵬濤 董 梅

(1. 陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，陜西 西安 710021；2. 渭南市食品藥品檢驗(yàn)所，陜西 渭南 714000)

紫薯花青素超聲波輔助酶法提取工藝優(yōu)化及其抗氧化性研究

徐 穎1樊 凡1陰鵬濤1董 梅

(1. 陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，陜西 西安 710021；2. 渭南市食品藥品檢驗(yàn)所，陜西 渭南 714000)

采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)研究超聲波輔助酶法提取紫薯花青素，確定最佳工藝條件為：以95%乙醇—0.1% HCl(體積比4∶6)為提取劑，液料比36∶1(mL/g)，60 ℃ 下超聲提取35 min，纖維素酶添加量2.50 mg/g·紫薯粉。在該條件下紫薯花青素得率達(dá)到2.003 mg/g。紫薯花青素還原力和對?OH清除率隨濃度增大而增強(qiáng)。在30.00 mg/L時(shí)，紫薯花青素對?OH清除率達(dá)到80.2%。研究初步揭示了紫薯花青素具有很高的體外抗氧化活性，可以作為天然抗氧化劑進(jìn)行開發(fā)。

紫薯；花青素；提取；超聲波；纖維素酶；抗氧化性

目前食品工業(yè)上所用的色素大多數(shù)是合成色素，幾乎都有不同程度的毒性[1]，長期食用會(huì)危害健康?；ㄇ嗨厥且环N類黃酮類的水溶性色素，屬于天然食用色素，安全無毒，具有抗氧化[2]、清除自由基功能[3]、抗突變[4]、增進(jìn)視力[5]、預(yù)防心腦血管疾病[5]及保護(hù)肝臟[6]等功能，在食品、醫(yī)藥、化妝等行業(yè)有著巨大的應(yīng)用潛力。紫薯花青素與紫葡萄、紫米和櫻桃等其它來源的花青素相比，其熱穩(wěn)定性與紫米相似，但優(yōu)于其它來源且光穩(wěn)定性最強(qiáng)[7]。中國提取花青素的傳統(tǒng)方法多采用檸檬酸水溶液或乙醇等溶劑浸提法[7]，國外多采用鹽酸化甲醇、乙酸或鹽酸水溶液等低溫或常溫提取[8]，這些方法耗時(shí)長，而超聲波提取法利用空化作用和強(qiáng)烈振動(dòng)可以破壞植物細(xì)胞壁，使溶劑易于滲透到細(xì)胞內(nèi)，溶解其中的化學(xué)成分。另外，纖維素酶能降解植物細(xì)胞壁中的纖維素，提高花青素的得率。目前將二者結(jié)合用于花青素提取的報(bào)道較少，本試驗(yàn)結(jié)合兩者的優(yōu)勢，采用超聲波輔助纖維素酶法提取紫薯花青素，能大大提高其得率。利用響應(yīng)面法優(yōu)化獲得提取紫薯花青素的最佳工藝參數(shù)，并進(jìn)行抗氧化性研究。為紫薯花青素的工業(yè)化生產(chǎn)提供基礎(chǔ)理論，以便于對紫薯資源的進(jìn)一步利用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

紫薯：市售；

纖維素酶：酶活 50 000 U/g，天津諾奧科技發(fā)展有限公司；

抗壞血酸、茶多酚：≥98%，上海源葉生物科技有限公司；

其他試劑均為分析純。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

高速萬能粉碎機(jī)：FW80型，天津市泰斯特儀器有限公司；

數(shù)控超聲波清洗器：KH-250DE型，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；

紫外可見分光光度計(jì)：UV-2800型，上海尤尼克柯儀器有限公司；

高速冷凍離心機(jī)：HC-3018R型，安徽中科中佳科學(xué)儀器公司。

1.2 方法

1.2.1 紫薯粉的制備 將紫薯洗凈、切成小塊，45 ℃烘干至恒重，粉碎過60目篩，干燥器中避光保存，備用。

1.2.2 花青素濃度及得率的測定 參照文獻(xiàn)[9]，略作改進(jìn)。精確稱取紫薯粉2.00 g，按液料比加入一定量的提取劑A(95%乙醇∶0.1% HCl體積比為40∶60)，按2.5 mg/g·紫薯粉加入纖維素酶，在一定溫度下超聲波提取，4 500 r/min離心5 min，取出上清液用提取液定容至100 mL。各取5 mL樣液，分別用pH 1.0鹽酸-氯化鉀和pH 4.5鹽酸-乙酸鈉緩沖液定容至100 mL，用蒸餾水作參比，分別測定A530和A700。采用pH示差法[10]計(jì)算花青素濃度。

A=(A530-A700)pH 1.0-(A530-A700)pH 4.5，

(1)

(2)

式中：

A——吸光度差值；

(A530-A700)pH 1.0——pH 1.0的樣液在兩波長(530，700 nm)的吸光度差；

(A530-A700)pH 4.5——pH 4.5的樣液在兩波長(530，700 nm)的吸光度差。

C——花青素濃度(以矢車菊素-3-葡萄糖苷計(jì))，mg/mL；

f——稀釋倍數(shù)；

M——矢車菊素-3-葡萄糖苷的分子量，449.2；

E——矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾吸光常數(shù)，26 900；

L——比色皿厚度，1 cm。

(3)

式中：

W——紫薯花青素得率，mg/g；

C——樣品溶液的花青素濃度，mg/mL；

V——樣品溶液的體積，mL；

m——樣品的質(zhì)量，g。

1.2.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

(1) 提取溫度：準(zhǔn)確稱取2.00 g紫薯粉，按照液料比為20∶1(mL/g)加入提取劑A，再加入5 mg纖維素酶，分別于40，45，50，55，60，65 ℃超聲輔助提取20 min，4 500 r/min離心5 min，取上清液并用提取劑定容至100 mL，測定其吸光度，每組試驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

(2) 提取時(shí)間：準(zhǔn)確稱取2.00 g紫薯粉，按照液料比為20∶1(mL/g)加入提取劑A，再加入5 mg纖維素酶，進(jìn)行超聲輔助提取，超聲波浸提溫度為50 ℃，提取時(shí)間分別為10，15，20，25，30，35，40 min，4 500 r/min離心5 min，取上清液并用提取劑定容至100 mL，測定其吸光度，每組試驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

(3) 液料比：準(zhǔn)確稱取2.00 g紫薯粉，液料比分別為10∶1，15∶1，20∶1，25∶1，30∶1，35∶1，40∶1，45∶1(mL/g)，加入提取劑A，再加入5 mg纖維素酶，50 ℃超聲輔助提取20 min，4 500 r/min離心5 min，取上清液用提取劑定容至100 mL，測定其吸光度，每組試驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

(4) 纖維素酶添加量：準(zhǔn)確稱取2.00 g紫薯粉，按照液料比為20∶1(mL/g)加入提取劑A，再按1.50，2.00，2.50，3.00，3.50 mg/g·紫薯粉加入纖維素酶，50 ℃超聲輔助提取20 min，4 500 r/min離心5 min，取上清液并用提取劑定容至100 mL，測定其吸光度，每組試驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

1.2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波提取工藝 綜合考慮單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取提取溫度、提取時(shí)間和料液比3個(gè)因素為自變量，采用Design-Expert 8.0軟件回歸分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，得最優(yōu)提取參數(shù)。

1.2.5 花青素的抗氧化活性分析 將提取得到的紫薯花青素粗提液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后，用冷凍干燥機(jī)干燥成粉狀物，再用95%乙醇溶解。分別制成30.00，15.00，7.50，5.00，3.75，3.00 mg/L(以花青素計(jì))的紫薯花青素溶液，用于抗氧化活性分析。以抗壞血酸和茶多酚作為陽性對照。還原能力測定方法參照文獻(xiàn)[11]，羥自由基(?OH)清除能力測定方法參照文獻(xiàn)[12]。

2 結(jié)果分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 提取溫度對得率的影響 由圖1可知，得率隨溫度的升高而出現(xiàn)先增加后減小的趨勢，可能是花青素隨溫度的升高而不斷被提取出，但隨溫度升高花青素穩(wěn)定性降低，當(dāng)溫度高于60 ℃時(shí)，花青素開始部分分解而導(dǎo)致含量降低，得率下降。因此提取溫度為55～60 ℃時(shí)效果較好。

2.1.2 提取時(shí)間對得率的影響 由圖2可知，得率隨時(shí)間的延長出現(xiàn)先增加后減小的趨勢，可能是隨超聲時(shí)間延長，產(chǎn)生的熱量促使部分花青素分解而導(dǎo)致含量降低，得率下降。因此提取時(shí)間為30～35 min 時(shí)效果較好。

2.1.3 液料比對得率的影響 由圖3可知，得率隨液料比的增大而增大，當(dāng)液料比大于35∶1(mL/g)時(shí)，隨著液料比的增加得率也有增大的趨勢，但增加幅度很小。隨提取劑添加量的增加，花青素逐漸溶解到提取劑中，當(dāng)提取劑超過一定量時(shí)，花青素溶解趨于飽和，得率趨于穩(wěn)定。因此液料比為35∶1(mL/g)時(shí)得率較高。

2.1.4 纖維素酶添加量對得率的影響 由圖4可知，得率隨纖維素酶添加量的增大而增大，在2.50 mg/g·紫薯粉時(shí)達(dá)到高峰，當(dāng)大于2.50 mg/g·紫薯粉時(shí)，隨纖維素酶添加量的增加得率基本保持不變，是由于纖維素酶對紫薯細(xì)胞壁的降解作用趨于飽和，因此，每克紫薯添加2.50 mg纖維素酶為宜。后續(xù)試驗(yàn)纖維素酶添加量固定為2.50 mg/g·紫薯粉。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝結(jié)果分析

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因子水平見表1。根據(jù)中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)Box-Behnken，對超聲波輔助酶法進(jìn)行優(yōu)化，對提取溫度、提取時(shí)間、液料比3個(gè)因素進(jìn)行考察。試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表2。

2.2.1 回歸模型的建立及顯著性檢驗(yàn) 利用Design-Expert 8.0軟件，對多項(xiàng)式回歸分析，得到的二次回歸方程為：

Y= 2.00-0.014A+5.0×10-3B+0.064C+0.023AB-0.010AC+0.018BC-0.19A2-0.082B2-0.12C2。

(4)

從式(4)可看出，在試驗(yàn)范圍內(nèi)，回歸方程一次項(xiàng)系數(shù)的絕對值C>A>B，說明在3個(gè)因素中液料比對紫薯花青素得率影響最大，其次是溫度，提取時(shí)間影響最小。

由表3可知，回歸得到的二次多項(xiàng)式模型極顯著(PModel<0.000 1)，相關(guān)系數(shù)R2為0.998 4，失擬項(xiàng)不顯著(P=0.058 1>0.05)，說明該模型擬合程度較好，應(yīng)用此模型可對紫薯花青素提取得率進(jìn)行分析和預(yù)測。

2.2.2 交互作用對紫薯花青素得率的影響 由圖5(a)可知，提取時(shí)間的最佳水平范圍為34～36 min，提取溫度的最佳水平范圍為59～60 ℃。由圖5(b)可知，提取時(shí)間的最佳水平范圍為34～36 min，液料比的最佳水平范圍為35∶1～37∶1(mL/g) 。由圖5(c)可知，提取溫度的最佳水平范圍為58～60 ℃，液料比的最佳水平范圍為35∶1～37∶1(mL/g)

2.2.3 提取工藝優(yōu)化結(jié)果 通過響應(yīng)面分析得到提取溫度59.70 ℃，提取時(shí)間35.25 min，液料比36.30∶1(mL/g)，回歸方程的得率最大，預(yù)期的得率為2.013 7 mg/g。將提取工藝條件修正為：提取溫度60 ℃，提取時(shí)間35 min，液料比36∶1(mL/g)，預(yù)期的得率為2.01 mg/g。在此優(yōu)化工藝條件下平行實(shí)驗(yàn) 3次得到花青素得率為2.003 mg/g。與理論預(yù)測值的相對誤差約為0.35%。將提取得到的紫薯花青素粗提液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后用冷凍干燥機(jī)干燥成粉狀物，檢測其花青素的含量為86.7%。紫薯花青素在酸性條件下比中性和堿性條件下穩(wěn)定，pH 2～3最穩(wěn)定。60 ℃加熱1 h，花青素存留率達(dá)到96%，70 ℃加熱1 h，花青素存留率僅為56%。

? Prob>F的值小于0.05為影響顯著，Prob>F的值小于0.01為影響極顯著，Prob>F的值大于0.05為影響不顯著。

2.3 紫薯花青素抗氧化活性結(jié)果分析

2.3.1 還原力測定 由圖6可知，在相同濃度條件下紫薯花青素還原力明顯高于抗壞血酸和茶多酚。在3.00～30.00 mg/L時(shí)，隨著濃度的增大，各物質(zhì)的還原力均有所提高，但是紫薯花青素的還原力提高顯著(P<0.05)，而抗壞血酸的還原力提高并不顯著。

2.3.2 羥自由基(?OH)的清除能力 由圖7可知，在3.00～30.00 mg/L時(shí)，隨著濃度的增大，各物質(zhì)對?OH的清除能力均有所提高，但是紫薯花青素的清除能力不如抗壞血酸和茶多酚的清除能力提高顯著(P<0.05)，在3.00～3.75 mg/L時(shí)，紫薯花青素清除?OH的能力高于抗壞血酸和茶多酚的清除能力，在5.00～30.00 mg/L時(shí)，抗壞血酸的清除能力高于紫薯花青素和茶多酚的清除能力，紫薯花青素和茶多酚的清除能力基本相當(dāng)。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用超聲波輔助纖維素酶對紫薯花青素的提取進(jìn)行了研究，分析影響紫薯花青素得率的影響因素，對超聲波輔助酶法進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，得出其最佳工藝為：提取時(shí)間35 min，提取溫度60 ℃，液料比36∶1(mL/g)，纖維素酶添加量2.50 mg/g·紫薯粉，在此條件下花青素得率達(dá)到2.003 mg/g。在超聲和纖維素酶的雙重作用下，紫薯花青素溶出速度很快，本工藝所需提取時(shí)間較短，有利于產(chǎn)業(yè)化推廣。紫薯花青素在酸性條件下比較穩(wěn)定，其還原力明顯高于抗壞血酸和茶多酚，對羥自由基清除能力與茶多酚基本相當(dāng)。紫薯花青素可以作為天然抗氧化劑進(jìn)行開發(fā)。在后續(xù)研究中，可以添加果膠酶，考察雙酶對紫薯花青素提取的效果。

[1] WROLSTAD R, CULVER C. Alternatives to those artificial FD&C food colorants[J]. Annual Review of Food Science and Technology, 2012, 3(1): 59-77.

[2] YONG P H，CHOI J H, CHOI J M, et al．Protective mechanisms of anthocyanins from purple sweet potato against tertbutyl hydroperoxide-induced hepatotoxicity[J]. Food and Chemical Toxicology, 2011, 49(9): 2 081-2 089.

[3] 孫傳范. 原花青素的研究進(jìn)展[J]. 食品與機(jī)械, 2010, 26(4): 146-148, 152.

[4] 趙宇瑛, 張漢鋒. 花青素的研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2005, 33(5): 904-905, 907.

[5] 李彥青, 盧森權(quán), 黃詠梅, 等. 紫色甘薯花青素的應(yīng)用前景[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008, 36(29): 12 641-12 642, 12 646.

[6] 呂昱, 嚴(yán)敏. 紫薯花色苷的生理功能及分離純化研究進(jìn)展[J]. 食品與機(jī)械, 2013, 29(4): 250-253.

[7] 陸國權(quán), 李秀玲. 紫甘薯紅色素與其他同類色素的穩(wěn)定性比較[J]. 浙江大學(xué)學(xué)報(bào): 農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版, 2001, 27(6): 635-638.

[8] BYAMUKAMA R, KIREMIRE B T, ANDERSEN O M, et al. Anthocyanins from fruits of Rubus pinnatus and Rubus rigidus[J]. Journal of Food Composition & Analysis, 2005, 18(6): 599-605.

[9] 陽翠, 秦廷豪, 李曉梅, 等. 紫甘薯花青素提取工藝參數(shù)優(yōu)化[J]. 西南師范大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2013, 38(7): 69-72.

[10] 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部. NY/T 1320-2007 農(nóng)作物種質(zhì)資源鑒定技術(shù)規(guī)程 甘薯[S]. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2007: 23-24.

[11] 謝思蕓, 鐘瑞敏, 肖仔君, 等. 楊梅果醋體外抗氧化活性的研究[J]. 食品與機(jī)械, 2012, 28(6): 125-128.

[12] 羅春麗, 王林, 李杏, 等. 紫薯花青素體外抗氧化及對H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用[J]. 食品科學(xué), 2015, 36(17): 225-230.

Study on Ultrasonic-enzyme Combined Extraction and Antioxidant Activity of Anthocyanins from Purple Sweet Potato by Response Surface Methodology

XU Ying1FANFan1YINPeng-tao12DONGMei2

(1.SchoolofFoodandBiologicalEngineering,ShaanxiUniversityofScience&Technology,Xi’an,Shaanxi710021,China; 2.WeinanInstituteforFoodandDrugControl,Weinan,Shaanxi714000,China)

The anthocyanins were extracted from purple sweet potato (PSP) tuber. Influencing factors of ultrasonic-enzyme combined extraction of anthocyanins were studied by single factor experiments. On the basis of this, the extraction process was optimized by three factors and three levels of response surface analysis method, using yield rate as response value. The optimal process parameters of the extraction process were: extraction temperature 60 ℃, extraction time 35 min, liquid to solid ratio 36∶1(mL/g). Under these conditions, the yield of anthocyanins from purple sweet potato was 2.003 mg/g. The results showed that the determination of reducing power of purple sweet potato anthocyanins and the scavenging rate of ·OH increased with the increase of concentration. The scavenging rate of ·OH was 80.2% at the concentration of 30.00 mg/L. The study revealed that the anthocyanins from purple sweet potato have high antioxidant activity in vitro and can be used as a natural antioxidant.

purple sweet potato; anthocyanins; extraction; ultrasonic; cellulase; antioxidation

陜西科技大學(xué)科研啟動(dòng)金—自然科學(xué)預(yù)研基金(編號(hào)：2016BJ-21)；陜西省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：1348)

徐穎(1978—)，女，陜西科技大學(xué)講師，博士。 E-mail：xuying@sust.edu.cn

2016—12—02

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.03.031