張迪,張雅敏,劉子榮,崔子林,李陽(.天津市器官移植重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津009;.天津市第一中心醫(yī)院器官移植中心,天津市器官移植臨床醫(yī)學(xué)研究中心,天津 009;.衛(wèi)生部危重病急救醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 009)
自身免疫性肝?。╝utoimmune liver disease,AILD)是由自身免疫介導(dǎo)的肝膽系統(tǒng)慢性炎癥性疾病,根據(jù)其臨床表現(xiàn)、生化、免疫學(xué)、影像學(xué)和組織病理學(xué)特點(diǎn)可分為以肝細(xì)胞實(shí)質(zhì)損害為主、血清肝細(xì)胞炎癥指標(biāo)明顯升高的自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis, AIH)、以膽管病變?yōu)橹?、淤膽指?biāo)升高顯著的原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis, PBC)、 原 發(fā) 性 硬 化 性 膽 管 炎(primary sclerosing cholangitis, PSC)及重疊綜合征(overlap syndrome, OLS)4種類型。目前,臨床上主要以糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑等治療為主,但是對(duì)于部分AILD患者,其治療效果欠佳,而且容易引起骨質(zhì)疏松和惡性腫瘤等,且停藥后易復(fù)發(fā)[1]。
間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstem cell,MSC)是一種具有全能干細(xì)胞特點(diǎn)來源于中胚層發(fā)育的早期細(xì)胞,具有多向分化潛能,最初在骨髓中發(fā)現(xiàn),在特定的誘導(dǎo)條件下可擴(kuò)增為非造血組織干細(xì)胞[2-4],具有免疫調(diào)節(jié)功能[5-6]。MSC 在體內(nèi)外均可抑制T淋巴細(xì)胞的活化和增殖[7],并可用于治療多種疾病,均取得了較好的治療效果。MSC的分化及免疫調(diào)節(jié)功能為其治療AILD提供了可能性。
AILD 可分為AIH、 PBC、 PSC、 OLS 4種類型,其中前3種較為常見。對(duì)于AILD的發(fā)病機(jī)制目前尚不明確[8-9],學(xué)者們認(rèn)為感染及抗原的分子模擬機(jī)制、自身免疫紊亂、遺傳等因素相互作用,促進(jìn)了AILD不同程度的進(jìn)展[10]。
1.1 感染及抗原的分子模擬機(jī)制:抗原的分子模擬機(jī)制是指病原體上的抗原表位與人組織蛋白表位比較相似,當(dāng)病原體感染機(jī)體時(shí),機(jī)體激活淋巴細(xì)胞,產(chǎn)生抗體及組織抗原等物質(zhì),機(jī)體在抵抗病原體時(shí),將正常組織誤以為“異體”而進(jìn)行攻擊,導(dǎo)致正常組織器官受到一定程度的損傷[11]。研究結(jié)果顯示,細(xì)菌感染、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染、化學(xué)因素均與AILD的發(fā)病有關(guān)[12]。已有研究通過建立作用于DNA免疫的2型AIH鼠類動(dòng)物模型證實(shí)了分子模擬機(jī)制在AIH發(fā)病中的作用[13]。Liang等[14]進(jìn)行的一項(xiàng)Meta分析結(jié)果表明,泌尿系統(tǒng)感染與PBC發(fā)病有明顯的相關(guān)性。
1.2 遺傳因素:AILD有家族聚集現(xiàn)象,PBC及親屬的患病率比普通人群高100倍[15],AIH、PSC也存在顯著的家族成員集中發(fā)病現(xiàn)象。研究發(fā)現(xiàn),人類組織相容性抗原(human lecocyte antigen, HLA)與其遺傳易感密切相關(guān)[13]。由于遺傳差異,AILD患者受到外界抗原刺激時(shí)更容易導(dǎo)致基因的異常表達(dá),進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體免疫狀態(tài)紊亂,正常肝臟組織被識(shí)別為“異體”而發(fā)生免疫損傷。
1.3 自身免疫紊亂:AILD的免疫損傷主要有細(xì)胞免疫和體液免疫2種方式。細(xì)胞免疫是指特異性抗原刺激機(jī)體可激活CD4+T細(xì)胞,進(jìn)而釋放一系列免疫調(diào)控因子,活化細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞,釋放毒性因子直接破壞肝細(xì)胞;體液免疫是指抗原刺激機(jī)體,B細(xì)胞產(chǎn)生大量針對(duì)自身肝細(xì)胞或膽管細(xì)胞的抗體,與細(xì)胞膜上的蛋白成分結(jié)合,介導(dǎo)細(xì)胞毒性作用導(dǎo)致肝臟、膽管的損傷。AIH患者肝臟組織表現(xiàn)為淋巴細(xì)胞、效應(yīng)B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等浸潤,表明其發(fā)病與免疫有關(guān)[16]。Th17細(xì)胞/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例失衡導(dǎo)致患者免疫耐受機(jī)制被破壞,參與了AILD的發(fā)生[17]。Th17細(xì)胞分泌的主要細(xì)胞因子為白細(xì)胞介素 -17(interlenkin-17, IL-17),其在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用,IL-17在輔助性T細(xì)胞(Tfh)的產(chǎn)生中發(fā)揮重要作用,IL-17可以激活B細(xì)胞、促進(jìn)效應(yīng)B細(xì)胞分化,促進(jìn)CD8+T細(xì)胞及免疫細(xì)胞的活化,對(duì)免疫球蛋白也有一定作用。研究發(fā)現(xiàn),PBC患者中CXCR5+CD4+T細(xì)胞數(shù)量增加,IL-17因子水平提高[18]。此外,也有研究發(fā)現(xiàn),AILD患者體內(nèi)轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growing factor-β1, TGF-β1)水平下降,導(dǎo)致免疫負(fù)調(diào)控下降,免疫反應(yīng)亢進(jìn)促進(jìn)AIH和PBC的發(fā)展[19]。
MSC是具有多種分化潛能的非造血干細(xì)胞,它具有來源豐富、分化潛能高及免疫調(diào)節(jié)特性[20],現(xiàn)已引起干細(xì)胞治療領(lǐng)域?qū)<覞夂竦呐d趣[21]。MSC低度表達(dá)MHCⅠ,不表達(dá)MHCⅡ、CD40、CD40L、B71、B72等共刺激因子,這些特點(diǎn)使MSC可逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視,進(jìn)入體內(nèi),而不會(huì)遭受機(jī)體免疫系統(tǒng)的排斥[22]。MSC幾乎影響固有免疫系統(tǒng)和獲得性免疫系統(tǒng)的每個(gè)環(huán)節(jié)[23-25],它可以調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)、樹突狀細(xì)胞,在調(diào)節(jié)固有免疫及保護(hù)組織免受損傷中起到重要作用。另外,MSC還可以抑制B細(xì)胞及T細(xì)胞,在獲得性免疫中起到調(diào)節(jié)作用[26]。MSC主要通過細(xì)胞之間的相互接觸以及分泌的可溶性因子發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用[21,27-28]。MSC對(duì)T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞等抗原提呈細(xì)胞的增殖與分化有重要的調(diào)節(jié)作用,MSC可以促進(jìn)T細(xì)胞分化為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(T-regulatory lymphocytes,Tregs)和 Th2,抑制 Th17和 Tfh反應(yīng),并可以抑制單核細(xì)胞向抗原提呈樹突狀細(xì)胞分化[29]。MSC在體內(nèi)下調(diào)Th1和Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子γ-干擾素(interferon-γ, IFN-γ)和IL-17的表達(dá)水平,同時(shí)上調(diào)Th2和Treg細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子IL-10和TGF-β的表達(dá)水平。有研究表明,吲哚胺2,3-二加氧酶IDO,前列腺素PGE2,一氧化氮(NO)、人類白細(xì)胞抗原(HLA-DR)和趨化因子等因子也參與MSC的免疫調(diào)節(jié)作用[30-31]。建立T細(xì)胞和MSC的混合培養(yǎng)體系,MSC通過產(chǎn)生Treg細(xì)胞和分泌細(xì)胞因子TGF-β和PGE2抑制T 細(xì)胞的增殖和活化[30]。Kol等[32]將 MSC 靜脈注射至健康馬體內(nèi),觀察白細(xì)胞、脾臟淋巴細(xì)胞、血淋巴細(xì)胞以及各種細(xì)胞因子的變化情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)MSC可以上調(diào)血中CD8+T細(xì)胞及脾臟中FoxP3+Treg細(xì)胞的水平。MSC可產(chǎn)生和分泌多種細(xì)胞生長因子,如血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、纖維母細(xì)胞生長因子2(fibroblast growth factor 2,F(xiàn)GF-2)、胰島素樣生長因子 - 1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)和肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)等。另外,MSC具有組織修復(fù)能力,組織出現(xiàn)損傷后,MSC可以遷移到損傷部位,在局部環(huán)境的調(diào)控下,發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)及分化等功能,參與組織的修復(fù)過程中[33]。
隨著對(duì)MSC研究的深入,MSC已應(yīng)用于多種免疫性疾病的治療,尤其對(duì)失代償期肝硬化、AILD患者的臨床應(yīng)用及研究, 已成為時(shí)下的熱點(diǎn)問題。肝細(xì)胞具有一定的再生能力,肝細(xì)胞受到輕度損傷時(shí),可通過增殖進(jìn)行修復(fù);而肝細(xì)胞損傷較重或受到持續(xù)的損傷時(shí),肝臟干細(xì)胞被激活并參與到損傷修復(fù)中;當(dāng)損傷程度超過肝細(xì)胞和肝臟干細(xì)胞修復(fù)能力時(shí), 骨髓干細(xì)胞(包括造血干細(xì)胞、 MSC和內(nèi)皮祖細(xì)胞等)被募集至損傷部位并發(fā)揮重要的修復(fù)功能[34]。MSC可轉(zhuǎn)分化為肝細(xì)胞以增加功能肝細(xì)胞的數(shù)量,也可通過與肝細(xì)胞融合促進(jìn)損傷肝細(xì)胞的修復(fù)和功能的恢復(fù)[35]。鐘艷等[36]通過四氯化碳(CCl4)法建立大鼠肝損傷模型,分離肝損傷大鼠血清并誘導(dǎo)臍帶MSC分化,檢測培養(yǎng)液上清甲胎蛋白和白蛋白水平。肝損傷大鼠血清可使臍帶MSC向肝樣細(xì)胞分化,經(jīng)誘導(dǎo)后培養(yǎng)液上清中白蛋白水平增高。研究表明,MSC通過分泌多種細(xì)胞因子改變了肝臟局部的免疫微環(huán)境,進(jìn)而促進(jìn)了肝細(xì)胞的損傷修復(fù)和功能恢復(fù)[37]。低免疫原性MSC可用于異體移植并促進(jìn)受體肝的損傷修復(fù)。
3.1 MSC治療安全性研究:MSC的安全性是MSC治療各種免疫性疾病的基礎(chǔ)。Kol等[32]將MSC靜脈注射至正常馬體內(nèi),觀察其性情、體溫、脈搏、體溫等變化,發(fā)現(xiàn)靜脈注射MSC后隨訪1周,健康馬并未出現(xiàn)臨床異常,MSC不能導(dǎo)致炎癥反應(yīng),未見組織及器官毒性,MSC無明顯臨床不良反應(yīng)。在幾個(gè)臨床試驗(yàn)中,研究人員驗(yàn)證了異體或自體同源MSC的有效性和安全性[38-39]。de Windt 等[40]分離骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-drived mesenchymal stem cell, BM-MSC)用于治療軟骨缺損患者。Xu等[41]將臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord mesenchymal stem cell, UC-MSC)輸入干燥綜合征(sjogren's syndrome,SS)患者體內(nèi)。研究人員選取了10例熊脫氧膽酸(UDCA)治療無效的PBC患者給予MSC治療隨訪1年后均未發(fā)現(xiàn)明顯不良反應(yīng)[30]。隨著實(shí)驗(yàn)研究及臨床試驗(yàn)不斷證實(shí)MSC治療的安全性,研究MSC對(duì)AILD治療作用的障礙慢慢減少,MSC的特點(diǎn)、安全性促使學(xué)者們逐漸深入研究其在AIH中的免疫調(diào)節(jié)作用[26]。
3.2 MSC治療AILD的實(shí)驗(yàn)研究:MSC的免疫調(diào)節(jié)作用在很多免疫性疾病如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[42-43]、糖尿?。?4]、輻射誘導(dǎo)的肝損傷[45]的動(dòng)物模型中得到證實(shí)。有學(xué)者建立了大鼠CCl4肝纖維化模型后,肝纖維化大鼠的肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞,肝臟細(xì)胞的胞質(zhì)出現(xiàn)空泡和脂肪滴,丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase, ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(asparate transaminase, AST)水平明顯升高,α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA:檢測肌纖維母細(xì)胞樣細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)記)陽性細(xì)胞增多,而經(jīng)MSC治療的肝纖維化小鼠,其ALT、AST水平無明顯升高,肝小葉以肝中央靜脈為中心放射狀排列,僅少量肝臟細(xì)胞出現(xiàn)空泡及脂肪滴,α-SMA陽性細(xì)胞數(shù)與正常大鼠相比無明顯升高[46]。MSC能夠維持血清蛋白水平穩(wěn)定,抑制轉(zhuǎn)氨酶被激活,抑制損傷肝臟纖維化。MSC可以分化為類肝臟細(xì)胞修復(fù)受損的肝細(xì)胞及纖維化肝臟,進(jìn)而促進(jìn)肝功能的恢復(fù)。Chen等[47]建立小鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性肝炎(experimental autoimmune hepatitis, EAH)模型,并分為正常組、模型組、藥物治療組、MSC治療1組、MSC治療2組、MSC治療3組共6組,正常組不進(jìn)行造模,模型組在造模后僅腹腔注射1 ml生理鹽水,藥物治療組腹腔注射潑尼松龍及硫唑嘌呤,MSC治療1組、MSC治療2組、MSC治療3組分別給予1、2、3次MSC治療。42天后取動(dòng)物小鼠血液及肝組織,分析ALT、AST水平,蛋白免疫印跡試驗(yàn)(Western Blot)檢測細(xì)胞因子IL-17、IL-23水平,PCR檢測程序性死亡受體配體1(PD-L1)的mRNA水平,研究結(jié)果顯示,造模后血清中ALT、AST水平增高,而MSC治療組可明顯降低其水平。IL-17是CD4+T細(xì)胞如Th17細(xì)胞分泌的致炎因子之一,Th17細(xì)胞和IL-17在自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[48-49],與正常組相比,EAH小鼠IL-17的表達(dá)水平明顯增高,而經(jīng)MSC治療后,IL-17表達(dá)水平顯著下降,且隨治療次數(shù)增加下降更明顯,IL-17下降水平與PD-L1水平呈明顯負(fù)相關(guān),推測MSC通過激活PD-L1表達(dá)而抑制IL-17的表達(dá),進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng),起到治療EAH作用。Wang等[50]腹膜下注射聚肌胞苷酸建立小鼠PBC模型,經(jīng)MSC治療后,膽管周圍單核細(xì)胞浸潤減少,堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、ALT等血清轉(zhuǎn)氨酶及抗線粒體抗體(anti-mitochondrial antibody,AMA)、抗核抗體(anti-nuclear antibody,ANA)等自身抗體水平降低,外周血及淋巴結(jié)中CD4+Foxp3+T細(xì)胞數(shù)量增多,血清TGF-β1表達(dá)水平增高,而IFN-γ表達(dá)水平下降??梢姡琈SC可以調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答,抑制肝臟炎癥反應(yīng),這些研究預(yù)示MSC以后可能應(yīng)用于臨床治療AILD。
3.3 MSC治療AILD的臨床進(jìn)展:100所自身免疫性疾病研究試驗(yàn)基地中有22所基地研究了MSC的疾病治療作用[38-39]。初期臨床試驗(yàn)在激素難治性Crohn?。?1]、激素抵抗型移植物抗宿主病[52]、多發(fā)性硬化[53]、酒精性肝硬化[54]等疾病中體現(xiàn)了MSC的免疫調(diào)節(jié)作用,MSC對(duì)肝移植后急性排斥的調(diào)節(jié)作用正在研究中[26]。PBC是一種慢性進(jìn)行性膽汁淤積性AILD,目前主要治療為UDCA,對(duì)于UDCA治療無效的PBC患者,治療是臨床上較為棘手的問題。有研究選取了10例UDCA治療無效的PBC患者,給予MSC治療,隨訪1年,進(jìn)行PBC-40問卷分析患者生活質(zhì)量,檢測患者血清中ALT、AST、ALP、γ-轉(zhuǎn)肽酶(γ-glutamyltranspeptidase,γ-GT)、 總 膽 紅素(total bilirubin,TBiL)、間接膽紅素(indirect bilirubin,DBiL)、免疫球蛋白(IgM)水平及IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、IFN-γ、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF-α),TGF-β1 等因子變化,分析外周血淋巴細(xì)胞表型,研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),PBC患者經(jīng)MSC治療后,ALT、AST、γ-GT、IgM表達(dá)水平較治療前明顯降低[30]。外周血淋巴細(xì)胞中CD8+T細(xì)胞數(shù)量減少,與此同時(shí),CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞數(shù)量增多。IL-10表達(dá)水平升高,驗(yàn)證了MSC在UDCA難治性PBC患者中的免疫調(diào)節(jié)及治療作用。Wang等[55]用UC-MSC治療7例UDCA難治性PBC患者,發(fā)現(xiàn)經(jīng)治療后ALP、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶降低,Mayo風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分(mayo risk score, MRS)可以評(píng)估PBC患者生存率,同樣說明了MSC治療的安全性及有效性。呂勝祥等[56]從外周靜脈輸注MSC,觀察了6例AILD患者的肝功能變化及治療后的安全性情況,經(jīng)治療后6例患者均達(dá)到臨床病情緩解標(biāo)準(zhǔn),血清白蛋白水平較治療前明顯升高,ALT和AST水平低于治療前,治療后無嚴(yán)重并發(fā)癥發(fā)生。
AILD是由自身免疫介導(dǎo)的肝膽系統(tǒng)的慢性炎癥性疾病,目前,臨床上主要以糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑等治療為主,但是對(duì)于部分AILD患者,其治療效果欠佳,而且此類藥物易引起骨質(zhì)疏松和惡性腫瘤等,且停藥后易復(fù)發(fā)[1]。AILD與機(jī)體免疫紊亂有關(guān),而MSC的低免疫原性、免疫調(diào)節(jié)等生物特性及組織損傷修復(fù)功能為AILD治療提供了新途徑。但目前AILD的發(fā)病機(jī)制及MSC免疫調(diào)節(jié)及修復(fù)受損肝臟組織的機(jī)制還不明確。另外,實(shí)驗(yàn)研究及臨床試驗(yàn)相對(duì)缺乏,MSC治療AILD的劑量及遠(yuǎn)期安全性問題需要進(jìn)一步研究。隨著組織工程學(xué)的快速發(fā)展及細(xì)胞治療的不斷成熟,在不久的將來,上述問題將在研究中不斷解決。相信MSC將給難治性AILD患者帶來希望,也將更好地應(yīng)用于臨床,為患者服務(wù)。