黃芪莖葉對斷奶仔豬盲腸微生物區(qū)系的影響

孔祥杰，姜海龍*，蔡維北，蒙洪嬌，惠鑠智，相 冬，楊海天

（1．吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長春130118；2．中糧加家康（吉林）有限公司，吉林省長春市，132000）

黃芪莖葉對斷奶仔豬盲腸微生物區(qū)系的影響

孔祥杰1，姜海龍1*，蔡維北2，蒙洪嬌1，惠鑠智1，相 冬1，楊海天1

（1．吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長春130118；2．中糧加家康（吉林）有限公司，吉林省長春市，132000）

本試驗旨在探討日糧中添加不同比例黃芪莖葉對斷奶仔豬盲腸微生物區(qū)系的影響。選用24頭健康的長×大二元雜交仔豬，按體重隨機(jī)分成對照組、2．5%黃芪莖葉組、5%黃芪莖葉組和7．5%黃芪莖葉組4組，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)2頭仔豬，試驗期為28 d。試驗結(jié)束后，采用高通量測序方法對仔豬盲腸內(nèi)容物進(jìn)行分析。結(jié)果表明：斷奶仔豬盲腸微生物的多樣性隨黃芪莖葉的添加量不同發(fā)生改變，其中2．5%組的微生物多樣性最高，盲腸內(nèi)容物中微生物菌群以Firmicutes（厚壁菌門）和Bacteroidetes（擬桿菌門）為主，占總含量92%以上；在屬水平上，2．5%黃芪莖葉組與7．5%黃芪莖葉組的優(yōu)勢菌屬數(shù)量最高為11種，其中Prevotella菌屬的豐度最高。綜上所述，在仔豬日糧中添加適量的黃芪莖葉，可降低盲腸pH及提高微生物多樣性，有利于斷奶仔豬的健康生長。

黃芪莖葉；斷奶仔豬；盲腸微生物區(qū)系

國內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，斷奶仔豬腸道內(nèi)微生態(tài)的穩(wěn)定性與腸道菌群多樣性相關(guān)。仔豬腸道內(nèi)菌群多樣性含量越高，腸道微生態(tài)平衡就越穩(wěn)定，仔豬的生長狀態(tài)就越好。仔豬斷奶后由于免疫系統(tǒng)不健全，腸道功能發(fā)育不完善，抗病能力比較差[1]，會使動物腸道微生態(tài)平衡受到破壞，使斷奶后的仔豬易患疾病。有研究表明，中草藥可以調(diào)整動物腸道菌群結(jié)構(gòu)，改善動物的健康狀況[2]。我國中草藥不但種類繁多、來源廣、產(chǎn)量高、價格低廉，長期使用無殘留、無毒副作用，并且中草藥還具有抗應(yīng)激、抗氧化、抑菌抗病毒、促消化等功能[3]，因此中草藥作為綠色添加劑應(yīng)用于動物飼料中成為近幾年的研究熱點(diǎn)。但人們關(guān)注中草藥的同時忽略了中草藥的副產(chǎn)品，如黃芪、人參莖葉的利用，造成了資源浪費(fèi)。中草藥副產(chǎn)品中同樣含有與中草藥相似的成分，如多糖、皂苷等有效物質(zhì)。在豬的基礎(chǔ)飼糧中添加黨參的莖葉，可提高仔豬的成活率和日增重，不但降低了飼養(yǎng)成本還提高了仔豬的免疫力和對飼料的轉(zhuǎn)換率[4]。本試驗主要利用高通量測序技術(shù)，分析斷奶仔豬日糧中添加黃芪莖葉對盲腸微生物區(qū)系的影響，為黃芪莖葉在仔豬生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 試驗材料 試驗采用的黃芪莖葉來自吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院黃芪種植園，采集到的黃芪莖葉經(jīng)過風(fēng)干、粉碎制樣。

1．2 試驗方法 采用單因子試驗設(shè)計，根據(jù)黃芪莖葉的添加量，將試驗用的斷奶仔豬分成4組，分別是對照組、2．5%黃芪莖葉組、5%黃芪莖葉組和7．5%黃芪莖葉組。每個處理組3個重復(fù)，每個重復(fù)2頭仔豬。

1．3 試驗日糧和飼養(yǎng)管理 試驗日糧按照NRC（1998）豬營養(yǎng)需要標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行配制，每組日糧分別添加0%、2．5%、5%和7．5%的黃芪莖葉。試驗日糧組成和營養(yǎng)成分如表1所示。飼養(yǎng)試驗于2015年7月9日—2015年8月10日在吉林省長春市梨樹縣東北養(yǎng)殖繁育基地進(jìn)行。試驗預(yù)試期5 d，正試期28 d。試驗仔豬在同一豬舍內(nèi)，同一管理員統(tǒng)一飼喂。試驗仔豬采用網(wǎng)床飼養(yǎng)，且通風(fēng)良好。仔豬自由采食，采用壓嘴式飲水器飲水，按豬場免疫程序進(jìn)行免疫，及時收集槽外廢棄飼料，記錄采食量，觀察仔豬采食和健康情況。預(yù)試期結(jié)束后，仔豬空腹12 h后稱重作為試驗初重，采用逐日計算方法計算采食量及平均日增重。

表1 試驗日糧組成和營養(yǎng)成分

1．4 樣品采集 試驗結(jié)束后，對每頭豬逐個進(jìn)行稱重，結(jié)束后每個試驗組隨機(jī)選取3頭（即每個重復(fù)選取1頭豬）仔豬進(jìn)行屠宰試驗。前腔放血后，迅速打開腹腔，找出盲腸后迅速結(jié)扎，取出，將盲腸食糜混勻后裝入5 mL凍存管中，立即投入液氮內(nèi)進(jìn)行速凍，供盲腸食糜中微生物的類別及豐度測定，并迅速用pH計現(xiàn)場測定盲腸內(nèi)pH。

1．5 樣品處理

1．5．1 腸道pH測定 屠宰結(jié)束后，用pH測定儀測定盲腸內(nèi)容物的pH。

1．5．2 盲腸內(nèi)容物微生物區(qū)系測定 采用QIAamp DNA Stool Mini Kit提取仔豬盲腸內(nèi)容物的總DNA，將干燥好的DNA樣品溶于100 μL去離子水中。采用Thermo公司的Scientific NanoDrop 2000C測定DNA的純度，并以O(shè)D260/OD280評價DNA的純度，要求純度在1．7～1．9，將提取的DNA送至上海銳意生物公司，利用Qubit2．0 DNA試劑盒對基因組DNA精確定量，以確定再做PCR反應(yīng)時DNA的加入量。對微生物基因組16S rDNA V3～V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，引物為341F（5′-CCTACACGACGCTCTTCCGATCTN-3′和805R（5′-GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGA GAATTCCA-3′）。每個樣品引物加barcode序列。PCR結(jié)束后，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，采用瓊脂糖回收試劑盒對DNA進(jìn)行回收。利用Qubit2．0 DNA檢測試劑盒對PCR產(chǎn)物精確定量，以確定測序反應(yīng)加入的PCR產(chǎn)物量，最后采用高通量測序方法對盲腸微生物區(qū)系進(jìn)行分析。

1．5．3 高通量測序 設(shè)計16S/ITS特定引物擴(kuò)增特異區(qū)域，得到425/320 bp左右擴(kuò)增片段。并采用Miseq平臺，對2×300 bp的paired-end數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接，從而進(jìn)行16S/ITS分析。對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行QC后，用Usearch軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行去嵌合體和聚類的操作。對每個樣品的tags進(jìn)行隨機(jī)抽平處理，并提取對應(yīng)的OTU序列。然后使用QIIME軟件，做Alpha多樣性指數(shù)的稀釋曲線，根據(jù)稀釋曲線選擇合理的抽平參數(shù)，利用QIIME軟件對得到的抽平后的OTU進(jìn)行分析，對每個OTU進(jìn)行物種分類。歸類后，根據(jù)每個OTU中序列的條數(shù)，從而得到OTU豐度表，最后根據(jù)該OTU豐度表進(jìn)行后續(xù)分析。

1．5．4 統(tǒng)計分析 試驗結(jié)果用Excel軟件進(jìn)行整理后，用SPSS20．0軟件進(jìn)行單因素的方差分析，用Duncan′s方法進(jìn)行多重比較，以P＜0．05作為顯著判斷標(biāo)準(zhǔn)，以P＜0．01作為極顯著判斷標(biāo)準(zhǔn)，試驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

高通量測序采用軟件Usearch進(jìn)行OUT聚類，序列相似性定為0．97；采用RDP方法進(jìn)行物種分析，利用QIIME計算微生物的Alpha多樣性指數(shù)的值，并做出相應(yīng)的稀釋曲線，包括OUT數(shù)、Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2．1 黃芪莖葉多糖含量 本試驗采用國際法對黃芪莖葉中多糖含量進(jìn)行測定，制得標(biāo)準(zhǔn)曲線為Abs=0．0083c+0．1389 R2=0．9997，將黃芪莖葉所得結(jié)果帶入X=m1×v1/(m2×v2) ×0．9×10-4，結(jié)果顯示黃芪莖葉中多糖含量為0．0429 g/g。

2．2 黃芪莖葉對仔豬盲腸微生物pH的影響 如表2所示，隨著日糧中黃芪莖葉添加量的提高，仔豬盲腸內(nèi)pH呈現(xiàn)先低后高的趨勢，其中2．5%黃芪莖葉組的pH最低，但與對照組相比差異不顯著（P＞0．05）。2．3 仔豬盲腸微生物群落在門水平上的組成成分分析 對門水平等級top10的物種豐度進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)各黃芪莖葉添加組盲腸微生物群落的門水平分類上組成相同，但豐度有所變化。如圖1所示，對照組與試驗組仔豬盲腸內(nèi)容物中微生物均由放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、藍(lán)藻菌門（Cyanobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）和螺旋體門（Spirochaetes）這幾種菌門組成，其中Bacteroidetes和Firmicutes的所占比例較高，為優(yōu)勢菌群。其中，2．5%組的Bacteroidetes含量最高，5%組Bacteroidetes的含量最低，但5%組的Firmicutes含量最高，對照組Proteobacteria和Chloroflexi的含量均高于各試驗組。

表 2 黃芪莖葉對仔豬盲腸pH的影響

圖1 在門分類水平上各個樣品的菌群構(gòu)成

2．4 仔豬盲腸微生物群落在屬水平上的組成成分分析 以盲腸微生物的豐度＞1%為優(yōu)勢菌群來分析。如表3所示，對照組和各試驗組的優(yōu)勢菌群數(shù)分別為9、13、8、9種，其中2．5%組優(yōu)勢菌群數(shù)相對較多。Bacteroidales、Prevotella和Lachnospiraceae在不同試驗組的盲腸微生物中的豐度均＞1%，所以這3種菌群為優(yōu)勢菌群。

2．5 仔豬盲腸微生物Alpha多樣性的變化 Alpha多樣性分析主要包括observed species指數(shù)、chao1指數(shù)及shannon指數(shù)等。observed species指數(shù)和chao1指數(shù)反映樣品中群落的豐富度（species richness），即簡單指群落中物種的數(shù)量，observed species指數(shù)和chao1指數(shù)值與群落的豐富度呈正比。shannon指數(shù)反映群落的多樣性（species diversity），受樣品群落中物種豐富度（species richness）和物種均勻度（species evenness）的影響。相同物種豐富度的情況下，群落中各物種具有越大的均勻度，則認(rèn)為群落具有越大的多樣性。shannon指數(shù)值越大，說明個體分配越均勻。在僅考慮群落中物種的數(shù)量、不考慮每個物種豐度情況下，observed species指數(shù)曲線可以反映樣品測序量是否足夠，本試驗中observed species曲線已趨于平定，表示樣品測序量合理，已包括了所有物種。shannon指數(shù)反映樣品群落中物種豐富度（species richness），shannon指數(shù)曲線趨于平坦時，說明測序量已經(jīng)足夠大，可以反映所測樣品中大多數(shù)的微生物物種信息，測序結(jié)果表明曲線已經(jīng)平坦，所測數(shù)據(jù)量較為合理。

由表4可知，隨著日糧中黃芪莖葉含量的增加，各指數(shù)均呈先升高后降低的趨勢，其中2．5%組的各指數(shù)最高。說明在日糧中添加黃芪莖葉會使仔豬盲腸微生物多樣性發(fā)生改變，2．5%組的盲腸微生物多樣性最大。

表3 各樣品間菌群豐度＞1%的細(xì)菌種屬組成 %

表4 所有樣品盲腸內(nèi)微生物多樣性指數(shù)分析

3 討 論

動物腸道內(nèi)的微生物種類繁多，數(shù)量巨大，構(gòu)成了動物生存的必要條件微生態(tài)系統(tǒng)，穩(wěn)定的微生態(tài)系統(tǒng)可以對病原菌的侵入起到屏障作用，并促進(jìn)機(jī)體對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收[5]。由于斷奶仔豬腸道微生物區(qū)系不穩(wěn)定，其生理、環(huán)境、營養(yǎng)等斷奶應(yīng)激條件都可以對仔豬腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)變化產(chǎn)生影響，導(dǎo)致疾病的發(fā)生[6]。腸道不同部位具有不同的細(xì)菌類群，盲腸是微生物大量生長和繁殖的重要場所，因此本文采用高通量16S-rDNA測序技術(shù)檢測仔豬日糧中添加不同含量的黃芪莖葉對仔豬盲腸微生物豐度和多樣性的影響。本試驗結(jié)果表明，各試驗組仔豬盲腸內(nèi)Actinobacteria、Bacteroidetes、Firmicutes和Spirochaetes等均為優(yōu)勢菌門，其中Bacteroidetes、Firmicutes占90%以上。Pajarillo等[7]研究發(fā)現(xiàn)，Bacteroidetes和Firmicutes是斷奶仔豬糞便中含量最高的菌門，這一結(jié)果與本試驗研究結(jié)果相符。說明黃芪莖葉不會影響仔豬盲腸微生物菌群的多樣性。但是，隨著日糧中黃芪莖葉含量的提高，各組中Firmicutes的含量均有不同程度的提高；仔豬日糧中纖維含量的增加導(dǎo)致Bacteroidetes的含量高于對照組。Ellison等[8]通過高通量測序方法對綿羊瘤胃內(nèi)容物進(jìn)行研究，結(jié)果表明飼喂纖維含量高的綿羊，瘤胃中的Bacteroidetes的含量顯著高于對照組。原因可能是腸道中Bacteroidetes和Firmicutes可對食糜中代謝碳水化合物發(fā)酵發(fā)揮作用[9]，所以當(dāng)試驗組中日糧纖維的含量升高，Bacteroidetes和Firmicutes含量也升高。

高通量測序結(jié)果顯示，Prevotella菌屬在所有菌屬中豐度最高。Pajarilla等[7]研究表明，健康的斷奶仔豬糞便中，Prevotella菌屬為主要的優(yōu)勢菌群。Hayashi等[10]與Lamendella等[11]在研究中指出，Prevotella可以將飼料中半纖維素與木聚糖等物質(zhì)降解。由于日糧中纖維含量增加，Prevotella發(fā)揮了降解半纖維素的優(yōu)勢，成為優(yōu)勢菌群。此外，日糧中添加黃芪莖葉后，可以提高Succinivibrio、Faecalibacterium及Ruminococcus等能分解纖維類物質(zhì)的菌屬豐度。Haenen等[12]在母豬日糧中添加抗性淀粉后，在母豬結(jié)腸食糜中發(fā)現(xiàn)Faecalibacterium及Ruminococcus2種菌屬豐度有所提高，同時提高了結(jié)腸中總揮發(fā)性脂肪酸（VFA）含量，降低了大腸桿菌的豐度，與本試驗的研究結(jié)果相似。本研究表明，Succinivibrio、Faecalibacterium、Ruminococcus可以利用日糧中的纖維物質(zhì)獲得能量用于維持自身的生長及繁殖。同時在微生物利用纖維物質(zhì)發(fā)酵過程中產(chǎn)生 VFA，可以被上皮細(xì)胞吸收，代謝為宿主提供能量[13]。

4 結(jié) 論

隨著日糧中黃芪莖葉添加量的提高，仔豬盲腸內(nèi)菌群多樣性無顯著性差異，呈先升高后降低的趨勢；高通量測序結(jié)果表明，2．5%黃芪莖葉組的chao1指數(shù)、shannon指數(shù)及observed species指數(shù)高于其他處理組，因此盲腸內(nèi)微生物的多樣性受黃芪莖葉添加量的影響。

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Ef f ect of Astragalus Stem Plant on the Microf l ora in Gut of Weaned Piglets

KONG Xiang-jie1, JⅠANG Hai-long1*, CAⅠ Wei-bei2, MENG Hong-jiao1, HUⅠ Shuo-zhi1, XⅠANG Dong1, YANG Hai-tian1
(1.College of Animal Science and Technology, Jilin Agricultural University, Jilin Changchun 130118, China)

The aim of this study was to investigate the ef f ects of dif f erent concentrations of Astragalus membranaceus on cecal microf l ora in weaned piglets. Twenty-four healthy crossbred piglets were randomly divided into the control group , 2.5%, 5% and 7.5% power of astragalus plant group, each group had 3 repeats and each repeat had 2 piglets. Test period 28d. Ⅰllumina Genome Analyzer ⅠⅠx method adopted to determine Cecum microf l ora in piglets. Ⅰt showed that the diversity of micro-organisms in aecum of piglets changed with the added amount of Astragalus plant, however, among them, the highest microbial diversity was 2.5% groups, which was mainly composed ofFirmicutesandBacteroidetes, the content could reach 92%; at the genus level, the number of dominant species in the stems and leaves of Astragalus 2.5% and 7.5% were the highest. Ⅰn conclusion, adding Astragalus plant in feed of weaned piglets could reduce the pH and and increase microbial diversity, which is benef i cial to the healthy growth of weaned piglets.

Astragalus plant; Weaned piglets; Cecum microf l ora

S828.5

A

10.19556/j.0258-7033.2017-03-117

2016-08-18；

2016-09-29

吉林省科技發(fā)展計劃項目（20140203015NY）；吉林省科技發(fā)展計劃產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新戰(zhàn)略聯(lián)盟項目（20140309013 NY）；吉林省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（201633）

孔祥杰（1992-），女，吉林省吉林市人，碩士，研究方向為動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)，E-mail：592872889@ qq．com

*通訊作者：姜海龍（1971-），E-mail：hljiang@jau．edu．cn