敲低RACK1基因抑制C2C12細胞中MyoG和MHC基因表達

張 晶，王勝軍，劉 妍，汪文俊，劉玉蘭

（1．武漢輕工大學(xué)，動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點實驗室，湖北武漢 430023；2．中南民族大學(xué)，生命科學(xué)學(xué)院，湖北武漢 430074）

敲低RACK1基因抑制C2C12細胞中MyoG和MHC基因表達

張 晶1*，王勝軍1,2，劉 妍1,2，汪文俊2，劉玉蘭

（1．武漢輕工大學(xué)，動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點實驗室，湖北武漢 430023；2．中南民族大學(xué)，生命科學(xué)學(xué)院，湖北武漢 430074）

本實驗旨在研究RNA干擾（RNAi）RACK1基因?qū)2C12成肌細胞中肌分化標志基因MHC和MyoG表達的影響。將人工合成的靶向RAKC1基因的3條siRNA（1，2，3）轉(zhuǎn)染C2C12細胞，用RT-qPCR方法檢測并篩選干擾效率最高的1條siRNA。將篩選出的siRNA轉(zhuǎn)染C2C12成肌細胞并誘導(dǎo)細胞分化，通過RT-qPCR、Western blot和免疫熒光方法在mRNA及蛋白水平檢測RACK1基因沉默后對MHC和MyoG表達的影響。此外，Western blot方法檢測RACK1基因沉默后對PI3K/Akt和Erk/MAPK通路激活的影響。結(jié)果表明：RACK1-siRNA-2干擾效率最高，轉(zhuǎn)染48 h后抑制率可達70%。隨后，C2C12細胞轉(zhuǎn)染siRNA-2，誘導(dǎo)分化48h后RT-qPCR表明，MHC和MyoG的mRNA表達均顯著性下調(diào)（P＜0．05）；誘導(dǎo)分化72 h后，Western blot和免疫熒光結(jié)果表明MHC和MyoG的蛋白表達明顯低于對照組,但AKT和Erk磷酸化水平未見明顯變化。上述結(jié)果表明，干擾RACK1能顯著抑制MHC和MyoG的表達，提示RACK1正向調(diào)控C2C12成肌細胞的分化。

成肌細胞；激活性蛋白激酶C受體l；肌細胞生成素；肌球蛋白重鏈；RNA干擾

RACK1（激活性蛋白激酶C受體l）是含7個色氨酸-天冬氨酸（WD40）重復(fù)序列結(jié)構(gòu)的蛋白。它由GNB2Ll基因編碼，與G蛋白β亞基顯著同源，并在所有真核細胞生物中高度保守[1]。RACK1是一種多功能支架蛋白，介導(dǎo)多條胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)控細胞增殖、凋亡、遷移、轉(zhuǎn)錄和蛋白合成等過程[1-3]。RACK1基因敲除小鼠的原腸胚無法正常形成，揭示其在胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要作用[4]。Tang等[5]研究發(fā)現(xiàn)，RACK1在通城豬和長白豬胚胎期65 d骨骼肌中顯著差異表達，提示其在骨骼肌發(fā)育中發(fā)揮作用，但具體功能和調(diào)控機制仍然未知。

骨骼肌分化是一個復(fù)雜的過程，包括成肌細胞增殖、退出細胞周期、遷移、融合以及最后多核肌管的形成[6]。在肌分化的過程中，一系列骨骼肌特異性基因開始表達，肌細胞生成素（myogenin，MyoG）和肌球蛋白重鏈（Myosin heavy chain，MHC）是其中比較關(guān)鍵的基因。MyoG是骨骼肌分化的決定因子，調(diào)控成肌細胞融合和肌纖維形成[7-9]MyoG敲除小鼠因無肌肉形成，在出生前后致死[10]MHC是構(gòu)成骨骼肌纖維內(nèi)粗肌絲的主要成分。肌纖維類型主要由肌纖維內(nèi)表達的MHC類型來決定[11]。

本研究將C2C12成肌細胞作為研究模型，將細胞內(nèi)源性RACK1用RNAi進行敲低表達，研究RACK1對C2C12細胞分化基因MHC和MyoG表達的影響，從而揭示RACK1基因表達變化對胚胎骨骼肌生長發(fā)育的影響。

1 材料與方法

1．1 主要試劑 C2C12細胞（小鼠成肌細胞）由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)趙書紅教授惠贈；胎牛血清、馬血清、DMEM高糖培養(yǎng)基、胰酶、TRIzol試劑、liPofecta mine 2 000 Transfection Reagent均購自Invitrogen公司；3條RACK1siRNA由Invitrogen公司設(shè)計合成；PrimeScript RT reagent Kit WithgDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試盒和SYBR Premix Ex TaqTMRT-PCR試劑盒均購自寶生物工程（大連）有限公司；全蛋白提取試劑盒KGP2100購自南京凱基生物發(fā)展有限公司；MyoG抗體、Akt抗體、P-Akt抗體、Erk1/2抗體、P-Erk1/2抗體、β-action抗體、HRP-goat Anti-Mouse IgG均購自Cellsignaling公司；MF-20（MHC抗體）購自DHSB公司。

1．2 主要儀器設(shè)備 RT-PCR儀（7500 Real-time PCRsystem，ABI公司）；NanodroP2 000超微量分光光度計（Thermo）；電泳儀、電泳槽及轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad）；熒光顯微鏡（Nikon）。

1．3 C2C12成肌細胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化 C2C12 成肌細胞株常規(guī)復(fù)蘇后，用DMEM高糖培養(yǎng)基（含10%的胎牛血清，1%谷氨酰胺，1%雙抗），在體積分數(shù)5% CO2，37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞增殖融合至 70% ～ 80% 時，更換為含2%馬血清的DMEM分化培養(yǎng)基進行誘導(dǎo)分化。

1．4 RACK1siRNA轉(zhuǎn)染C12C12細胞 3條RACK 1siRNA序列見表1。用liPofectamine 2 000轉(zhuǎn)染試劑將RACK1siRNA及陰性對照siRNA轉(zhuǎn)染細胞。轉(zhuǎn)染前24 h，將細胞接種到培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿中，當細胞達到大概80%左右時進行轉(zhuǎn)染。根據(jù)lipofecta mine 2 000的操作說明進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染5 h后更換新鮮培養(yǎng)基。其中siRNA用量為50 nmoL/L。

1．5 基因mRNA表達測定 細胞總RNA提取、cDNA 合成、Real-time PCR均參照劉妍等[12]的方法。Real-time PCR引物見表2。基因mRNA相對表達量計算采用Livak等[13]的2-ΔΔCt法，以β-actin為內(nèi)參基因。采用SPSS17．0統(tǒng)計軟件進行t檢驗，以P＜0．05表示差異顯著性標準，P＜0．01表示差異極顯著性標準。

1．6 Western blot 本實驗參照劉妍等[12]的方法。用凱基全蛋白提取試劑盒提取細胞總蛋白，測定濃度后，進行SDS-PAGE電泳。電泳后，采用BIORAD轉(zhuǎn)膜儀將樣品轉(zhuǎn)移至PVDF膜，將膜置于封閉液（5%脫脂乳的PBST）室溫封閉3 h，加一抗4℃冰箱過夜。洗膜后將膜孵育在含二抗的PBST溶液中，室溫下孵育3 h，用ECl試劑進行熒光顯色，于AlPha Innotech成像系統(tǒng)中檢測及分析條帶強度。

1．7 免疫熒光 4%多聚甲醛固定細胞爬片20 min，DPBS洗3次，每次10 min；用0．2% Triton×-100透化10 min，DPBS洗3次；5% BSA室溫封閉30 min，DPBS洗3次；加一抗（用1%BSA按1∶40稀釋）放在濕盒里，4℃孵育過夜；棄去一抗，DPBS洗3次，加入FITC標記二抗（用1%BSA按1∶100稀釋），濕盒內(nèi)37℃避光孵育2 h，DPBS洗3次；DAPI避光孵育10 min，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

2 結(jié) 果

2．1 RACK1siRNA干擾效率檢測及篩選 為了研究RACK1對C2C12細胞分化的影響，設(shè)計靶向RACK1基因的3條siRNA序列并轉(zhuǎn)染細胞，實現(xiàn)細胞內(nèi)源性RACK1的低表達。用脂質(zhì)體分別將3條RACK1siRNA和Cy3標記的陰性對照轉(zhuǎn)染C2C12細胞，轉(zhuǎn)染5 h后，通過觀察陰性對照的紅色熒光強度，以確定siRNA的轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染48 h后，通過RT-qPCR檢測RACK1mRNA的表達，篩選出干擾效率最高的1條siRNA。由圖1A結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染5 h后C2C12細胞中出現(xiàn)的紅色熒光較強，且轉(zhuǎn)染效率達80%以上。RT-qPCR結(jié)果顯示，3條siRNA均能顯著地抑制細胞內(nèi)RACK1基因的表達（P＜0．05，圖1B），其中siRNA-2的干擾效率最高（抑制率約70%），因此選擇RACK1siRNA-2進行后續(xù)的干擾實驗。

表1 3條RACK1siRNAs序列

表2 Real-time PCR引物序列

圖2 干擾RACK1對MyoG、MHC基因mRNA表達的影響

2．2 干擾RACK1對MyoG和MHC基因mRNA表達的影響 分別將RACK1siRNA-2和陰性對照轉(zhuǎn)染C2C12細胞，轉(zhuǎn)染12 h后，將細胞的生長培養(yǎng)基換成分化培養(yǎng)基。在誘導(dǎo)分化48 h后，采用RT-qPCR檢測RACK1、MHC、MyoG的基因轉(zhuǎn)錄情況。結(jié)果顯示，與對照組相比，RACK1siRNA-2組細胞內(nèi)源性RACK1mRNA的表達顯著受到抑制（P＜0．01，圖2）,其抑制率約為70%。此外，在對RACK1基因進行干擾后，分化標志基因MHC和MyoG的mRNA表達均顯著性下調(diào)（P＜0．05，圖2）。

2．3 干擾RACK1對MyoG和MHC基因蛋白表達的影響 別將RACK1siRNA-2和陰性對照轉(zhuǎn)染C2C12細胞，轉(zhuǎn)染12 h后，將細胞的生長培養(yǎng)基換成分化培養(yǎng)基。在誘導(dǎo)分化72 h后，采用western blot和免疫熒光檢測MHC和MyoG的蛋白表達情況。Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，RACK1siRNA-2組的MHC和MyoG的蛋白明顯下調(diào)（圖 3A）。免疫熒光結(jié)果顯示，與對照組相比，RACK1siRNA-2組的MHC陽性細胞明顯減少，而MyoG陽性細胞的數(shù)目雖無明顯增多，但部分細胞的綠色熒光強度明顯減弱。這些結(jié)果表明，干擾RACK1能有效抑制C2C12分化過程中MHC和MyoG的表達。

2．4 干擾RACK1對Akt和Erk磷酸化水平的影響分別將RACK1siRNA-2和陰性對照轉(zhuǎn)染C2C12細胞，轉(zhuǎn)染12 h后，將細胞的生長培養(yǎng)基換成分化培養(yǎng)基。在誘導(dǎo)分化72 h后，采用western blot檢測Akt和Erk磷酸化水平。Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，RACK1siRNA-2組的Akt和Erk磷酸化水平均無明顯差異（圖4）。

圖 3 干擾RACK1對MHC和MyoG蛋白表達的影響

圖 4 干擾RACK1對Akt和Erk磷酸化水平的影響

3 討 論

哺乳動物骨骼肌生長發(fā)育是一個復(fù)雜的過程，主要包括骨骼肌成肌細胞增殖、分化和多核肌管的形成。而這一過程是在生肌調(diào)節(jié)因子（MRFs）的精密調(diào)節(jié)下有序地進行。MRFs包括Myf5、MyoD、myogenin、Myf6，且這4個成員都具有一個相似的結(jié)構(gòu)特征,即堿性螺旋-環(huán)-螺旋 （basic helixloop-helix, bHLH） 結(jié)構(gòu)域。其中MyoG在分化早期被激活，其表達象征成肌細胞的開始。成肌細胞分化后相互融合為多核肌管，最后形成肌纖維。成熟肌纖維主要有肌球蛋白重鏈（MHC）組成，并且MHC決定肌纖維的類型。在骨骼肌生長發(fā)育的過程中，多種肌生成相關(guān)基因都發(fā)揮著各自的功能，構(gòu)成一個復(fù)雜而精確的正負調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。目前已發(fā)現(xiàn)大量重要基因參與成肌分化過程，但成肌分化的調(diào)控機理尚未完成闡明。

RACK1在組織中廣泛表達，但在不同組織和細胞中，由于結(jié)合不同信號蛋白，則發(fā)揮不同的生物功能。主要參與調(diào)控胚胎發(fā)育、細胞生長、細胞分化、增殖、凋亡、遷移等多種生物活動等[14-16]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)RACK1所結(jié)合的重要信號蛋白與結(jié)構(gòu)蛋白已達到數(shù)10種，如PKC、Src、integrinβ、PDE4D5、FAK、STATs、P85、IGF-I等[1-3]。Tang等[5]研究發(fā)現(xiàn)，通城豬和長白豬骨骼肌發(fā)育的重要時間點為胚胎期65 d，而在此關(guān)鍵時間點RACK1在通城豬中的表達量急劇下調(diào)。這暗示RACK1在骨骼肌發(fā)育中發(fā)揮作用，但具體功能和調(diào)控機制仍然未知。

本文研究結(jié)果顯示，3條siRNA均能顯著地抑制細胞內(nèi)RACK1基因的表達，其中siRNA-2的干擾效率最高。通過基因干擾敲低C2C12細胞中RACK1表達后，成肌標志基因MyoG和MHC的表達在mRNA和蛋白水平均明顯受到抑制，表明下調(diào)RACK1表達阻止C2C12成肌細胞分化，提示RACK1可能參與正向調(diào)控骨骼肌分化過程。

癌癥相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)RACK1能結(jié)合IGF-1R，影響IGFs下游PI3K/Akt、Erk/MAPK通路的激活調(diào)控細胞增殖和凋亡[17-18]。PI3K/Akt途徑調(diào)控肌肉特異性基因的表達，誘導(dǎo)和維持肌細胞分化[19-20]。Erk1/2 MAPK信號通路促進肌細胞的增殖并抑制分化[21-22]。本研究表明，RACK1干擾組與對照組相比，成肌細胞分化后Akt和Erk1/2的磷酸化水平未見明顯差異，推測RACK1可能不是通過影響PI3K/Akt和Erk/MAPK通路激活調(diào)控C2C12細胞分化。

4 結(jié) 論

綜上所述，本研究通過基因干擾敲低C2C12成肌細胞內(nèi)源性RACK1的表達，從而探究其對C2C12細胞分化的影響。研究結(jié)果表明，下調(diào)RACK1的表達能顯著抑制成肌標志基因MyoG和MHC的表達，表明RACK1可能促進骨骼肌分化過程，但其調(diào)控機制可能與PI3K/Akt和Erk/MAPK通路無關(guān)。

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Knock-down ofRACK1Ιnhibits the Expressions of Myog and MHC Genes in C2C12 Myoblast

ZHANG Jing1*,WANG Sheng-jun1,2,Liu Yan1,2, WANG Weng-jun2, LⅠU Yu-lan1
(1. Hubei Key laboratory of Animal Nutrition and Feedscience, Wuhan Polytechnic University, Hubei Wuhan 430023, China; 2. College of lifesciences,South-Central University for Nationalities, Hubei Wuhan 430074, China)

The purpose of the study was to investigate the inf l uence of RACK1genesilencing by RNA interference (RNAi) on the expressions of two myogenic dif f erentiation markgenes (MHC and MyoG) in C2C12 myoblast. We transfected three chemically synthesized RACK1siRNA (siRNA-1,2,3) into C2C12 myoblasts, and detected the interference efficiency with RT-qPCR in order toselect thesiRNA with the highest interference efficiency. Then, we transfected the selected siRNA into C2C12 cells and induced C2C12 dif f erentiation. Ⅰn order to study the ef f ect ofRACK1gene silencing on the expressions of MHC and MyoG, we examined MHC and MyoG mRNA and protein expressions by using RT-qPCR, Western blot and immunof l uorescence methods. Ⅰn addition, the ef f ect of theRACK1silencing on the activation of pⅠ3K/Akt and Erk/MApK pathway was detected by Western blot analysis. The result showed thatRACK1-siRNA-2 had the highest interference efficiency, and its interference efficiency was approximately 70% at 48 h after the transfection. C2C12 myoblasts were transfected with siRNA-2 and induced into differentiation for 48 h and 72 h respectively. RT-qPCR showed that MHC and MyoG mRNA were significantly decreased in siRNA-2 transfected cells after 48 h of differentiation; Western blot and immunof l uorescence showed that MHC and MyoG protein were decreased after 72 h of dif f erentiation. However, no signif i cant changes in phosphorylation levels of Akt and Erk were observed. We conclude that downregulation ofRACK1by RNAi signif i cantly inhibits the expressions of MHC and MyoG, indicating thatRACK1is involved in positive regulation of C2C12 dif f erentiation.

Myoblast;RACK1; Myogenin; Myosin heavy chain; RAN interference

S814.5

A

10.19556/j.0258-7033.2017-03-106

2016-04-12；

2016-05-24

湖北省自然科學(xué)資助項目（2015CFB514）；湖北省高等學(xué)校優(yōu)秀中青年科技創(chuàng)新團隊計劃項目（T201508）

張晶（1985-），女，武漢人，博士，講師，研究方向：骨骼肌發(fā)育和肌肉損傷的機制，E-mail:judyzhang1103@163．com

*通訊作者