丁苯酞對血管性癡呆大鼠海馬組織TNF—α和IL—1β表達(dá)的影響

毛西京　羅翔丹　于挺敏

[摘要] 目的 觀察丁苯酞（NBP）對不同時(shí)間點(diǎn)血管性癡呆大鼠海馬組織腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白介素1β（IL-1β）表達(dá)的影響。方法 將80只健康Wistar大鼠按隨機(jī)區(qū)組法分為血管性癡呆模型（VD）組、血管性癡呆模型+丁苯酞氯化鈉注射液（NBP+VD）組、假手術(shù)+丁苯酞氯化鈉注射液（NBP+Sham）組和假手術(shù)（Sham）組4個(gè)組，每組各20只。采用永久性雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎法制備VD大鼠模型。NBP+Sham組和NBP+VD組大鼠術(shù)后1 d開始給予丁苯酞氯化鈉注射液腹腔注射，劑量為5 mg/（kg·d），Sham組和VD組大鼠給予生理鹽水腹腔注射（0.2 mL/d），各組大鼠均連續(xù)腹腔注射給藥7 d，每組按時(shí)間分為術(shù)后1周、2周、4周和8周4個(gè)亞組，于不同時(shí)間點(diǎn)斷頭取腦分離海馬組織。采用ELISA方法檢測海馬組織TNF-α和IL-1β的表達(dá)。結(jié)果 術(shù)后1、2、4、8周，VD組大鼠海馬組織TNF-α和IL-1β的表達(dá)均明顯高于Sham組（P < 0.05）；術(shù)后8周，NBP+VD組大鼠海馬組織TNF-α的表達(dá)明顯低于VD組大鼠（P < 0.05）；VD組大鼠海馬組織IL-1β的表達(dá)于2周時(shí)達(dá)到高峰期（P < 0.05）。 結(jié)論 VD大鼠海馬組織TNF-α和IL-1β表達(dá)增加，NBP可通過降低VD大鼠海馬組織TNF-α的水平從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞] 丁苯酞；血管性癡呆；海馬；腫瘤壞死因子α；白介素1β

[中圖分類號] R743 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）01（c）-0012-04

[Abstract] Objective To study the effects of 3-n-butylphthalide （NBP） on the expression of TNF-α and IL-1β at different time points in the hippocampus of vascular dementia rats. Methods A total of 80 Wistar rats were assigned to vascular dementia models （VD） group， vascular dementia models + NBP injection （NBP+VD） group， sham surgery + NBP injection （NBP+Sham） group and sham surgery （sham） group by randomized blocks， with 20 rats in each group. Vascular dementia rat model was established by ligating bilateral common carotid artery. The NBP+VD group and NBP+Sham group were intraperitoneally injected with NBP 5 mg/（kg·d）， VD group and Sham group were intraperitoneally injected with 0.2 mL/d saline for 7 days. Each group was divided into four subgroups （n=5） at 1， 2， 4 and 8 weeks after surgery. The rats in each group were decapitated to obtain brains at different time points， and hippocampus were isolated. TNF-α and IL-1β expressions in the hippocampus were determined by ELISA method. Results The expressions of TNF-α and IL-1β in the hippocampus of VD group were significantly higher than those of Sham group at each time point（P < 0.05）； the expression of TNF-α in the hippocampus of NBP+VD group was significantly lower than that of VD group at 8 weeks after surgery（P < 0.05）； the expression of IL-1β in the hippocampus of VD group reached peak level at 2 weeks after surgery. Conclusion The expression of TNF-α and IL-1β increase in the hippocampus of rats with vascular dementia. NBP may exert the protective effect by reducing TNF-α level in the hippocampus of vascular dementia rats.

[Key words] 3-n-butylphthalide； Vascular dementia； Hippocampus； Tumor necrosis factor-α； Interleukin-1β

丁苯酞（3-n-butylphthalide，NBP）是人工合成的消旋正丁基苯酞，作為臨床用于治療缺血性腦卒中的國家級一類新藥，NBP能夠明顯減輕急性缺血性腦卒中患者中樞神經(jīng)功能缺損[1]。隨著對NBP研究的不斷深入，目前發(fā)現(xiàn)NBP對血管性癡呆（vascular dementia，VD）也有較為明顯的改善作用[2-3]，但其作用機(jī)制還缺乏深入的研究。臨床研究觀察到VD患者血漿中促炎細(xì)胞因子水平明顯升高，并且促炎細(xì)胞因子水平與癡呆程度呈正相關(guān)[4]。Cunningham等[5]發(fā)現(xiàn)，腦組織中促炎細(xì)胞因子表達(dá)增加會(huì)加速癡呆的進(jìn)展。TNF-α和IL-1β是兩種重要的促炎細(xì)胞因子，腦缺血后海馬中TNF-α和IL-1β表達(dá)增加與VD發(fā)生密切相關(guān)[6]。本研究在制備VD大鼠模型的基礎(chǔ)上，應(yīng)用NBP給予干預(yù)治療，觀察不同時(shí)間點(diǎn)VD模型大鼠海馬組織TNF-α和IL-1β表達(dá)變化，進(jìn)而探討NBP對VD的保護(hù)作用，為臨床應(yīng)用NBP治療VD提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器

80只健康SPF級Wistar大鼠（雌雄各半），體重200～220 g，購于吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號：SCXK（吉）2003-001。丁苯酞氯化鈉注射液（石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H20100041）。大鼠TNF-α酶聯(lián)免疫檢測試劑盒和大鼠IL-1β酶聯(lián)免疫檢測試劑盒購自北京綠源博德生物科技有限公司。酶標(biāo)儀（ELX800，美國Bio-Tek公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

大鼠飼養(yǎng)于吉林大學(xué)第二醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，室內(nèi)溫度22～26℃，相對濕度40%～60%，光暗周期12 h，自由攝取食物和水，動(dòng)物模型制備前適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。按隨機(jī)區(qū)組法分為血管性癡呆模型（VD）組、血管性癡呆模型+丁苯酞氯化鈉注射液（NBP+VD）組、假手術(shù)+丁苯酞氯化鈉注射液（NBP+Sham）組和假手術(shù)（Sham）組4個(gè)組，每組20只；再將各組按時(shí)間分為術(shù)后1周、2周、4周和8周4個(gè)亞組，每個(gè)亞組5只。

1.3 動(dòng)物模型制備

采用永久性雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎法制備VD大鼠模型，具體操作如下：

VD組和NBP+VD組大鼠術(shù)前禁食、禁水8 h，10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉大鼠，仰臥位固定于操作臺，常規(guī)消毒頸部手術(shù)區(qū)域，頸前正中作一長約1 cm的縱形切口，鈍性逐層分離皮下軟組織、頸前肌群，分離出氣管側(cè)后方的頸動(dòng)脈鞘，進(jìn)而分離頸總動(dòng)脈與迷走神經(jīng)，以1號絲線永久結(jié)扎頸總動(dòng)脈，同法結(jié)扎另一側(cè)頸總動(dòng)脈。局部消毒后恢復(fù)組織層次并縫合皮膚。Sham組和NBP+Sham組大鼠除不結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈外，其余操作與VD組和NBP+VD組大鼠一致。術(shù)后動(dòng)物另放于干凈鼠籠飼養(yǎng)，自由獲取水源及飼料。

1.4 藥物干預(yù)

NBP+Sham組和NBP+VD組大鼠清醒后（術(shù)后1 d，可在籠中自由活動(dòng)），給予丁苯酞氯化鈉注射液腹腔注射，劑量為5 mg/（kg·d）（藥物劑量根據(jù)成人常規(guī)每日劑量進(jìn)行換算），Sham組和VD組大鼠給予生理鹽水腹腔注射（0.2 mL/d）。各組大鼠連續(xù)腹腔注射給藥7 d。

1.5 標(biāo)本采集及檢測指標(biāo)

各組大鼠在術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)（1、2、4、8周），給予10%水合氯醛腹腔注射麻醉（麻醉劑量：0.3 mL/100 g），生理鹽水心臟灌注5 min，斷頭取腦，分離雙側(cè)海馬，-70℃保存?zhèn)溆?。用ELISA法檢測各組大鼠海馬組織中TNF-α和IL-1β水平，按試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對應(yīng)的吸光度（A）值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣品的A值在回歸方程上計(jì)算出對應(yīng)的樣品濃度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析和Tukey檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠海馬組織TNF-α的表達(dá)比較

不同時(shí)間點(diǎn)，各組大鼠海馬組織TNF-α的表達(dá)比較：①術(shù)后1、2、4、8周，VD組大鼠海馬組織TNF-α的含量明顯高于Sham組（P < 0.05）；②術(shù)后1、2周，NBP+VD組大鼠海馬組織TNF-α的含量明顯高于Sham組（P < 0.05）；③術(shù)后8周，NBP+VD組大鼠海馬組織TNF-α的含量明顯低于VD組大鼠（P < 0.05）。

不同組別大鼠各時(shí)間點(diǎn)海馬組織TNF-α的表達(dá)比較：術(shù)后1、2、4、8周，四組大鼠海馬組織TNF-α的含量結(jié)果比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ﹥ 0.05）。見表1。

2.2 各組大鼠海馬組織IL-1β的表達(dá)比較

不同時(shí)間點(diǎn)，各組大鼠海馬組織IL-1β的表達(dá)比較：術(shù)后1、2、4、8周，VD組和NBP+VD組大鼠海馬組織IL-1β的含量明顯高于Sham組（P < 0.05）。

不同組別大鼠各時(shí)間點(diǎn)海馬組織IL-1β的表達(dá)比較：①VD組大鼠2周時(shí)海馬組織IL-1β的含量明顯高于術(shù)后1、4、8周（P < 0.05）；術(shù)后1、4、8周時(shí)海馬組織IL-1β的含量無顯著性差異（P﹥0.05）。②NBP+VD組大鼠術(shù)后4、8周時(shí)海馬組織IL-1β的含量明顯低于術(shù)后1、2周（P < 0.05）。見表2。

3 討論

炎性損傷是VD的一個(gè)重要病理機(jī)制，腦缺血損傷引起多種炎性因子上調(diào)，如細(xì)胞間粘附分子1、環(huán)氧合酶-2（COX-2）、一氧化氮（NO）、TNF-α、IL-1β等[7-8]，這些炎性因子可以激活小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞，激活的膠質(zhì)細(xì)胞又進(jìn)一步釋放多種細(xì)胞因子和有毒介質(zhì)，造成神經(jīng)元的損傷，并且可以破壞血腦屏障，血腦屏障的破壞又會(huì)增強(qiáng)炎性反應(yīng)，造成繼發(fā)性的腦損害[9-11]。臨床研究發(fā)現(xiàn)：VD病人血清IL-6明顯高于正常人群[12]；多梗死性癡呆患者腦脊液中TNF-α含量明顯高于對照組，因此認(rèn)為多梗死性癡呆患者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性應(yīng)答機(jī)制被激活，并且與病情的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[13]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：VD大鼠腦脊液和血清中IL-6含量明顯升高，且IL-6含量越高，模型大鼠記憶學(xué)習(xí)能力越差[14]。腦組織缺血及缺血再灌注時(shí)，神經(jīng)元、內(nèi)皮細(xì)胞等被激活，釋放兩種重要的炎性因子TNF-α和IL-1β，進(jìn)而刺激其他細(xì)胞因子的釋放，形成級聯(lián)反應(yīng)，激活粒細(xì)胞、單核-吞噬細(xì)胞等，造成炎性反應(yīng)損傷神經(jīng)元[15]；誘導(dǎo)血管活性物質(zhì)的異常釋放，導(dǎo)致血管收縮、腦血流量進(jìn)一步降低，加重腦缺血損傷[16]。炎性因子不僅影響神經(jīng)元的存活，還可以調(diào)節(jié)突觸可塑性，參與VD發(fā)病[17-18]。有研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血后海馬中TNF-α和IL-1β表達(dá)增加與VD發(fā)生密切相關(guān)[6，17]。

TNF-α能夠影響星形膠質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的功能，導(dǎo)致細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)重塑[19]；激活核轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB）進(jìn)而引起星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放促炎細(xì)胞因子[20]；促使小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放興奮性神經(jīng)遞質(zhì)（如谷氨酸），并且抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞再攝取谷氨酸，導(dǎo)致胞外谷氨酸水平持續(xù)增高，增加神經(jīng)毒性作用，引起細(xì)胞因子、毒性介質(zhì)的積累，誘導(dǎo)神經(jīng)元死亡[21]。TNF-α還可以上調(diào)神經(jīng)元的谷氨酸受體，并促進(jìn)神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)不規(guī)則趨化因子（Fractalkine），F(xiàn)ractalkine與其受體結(jié)合誘導(dǎo)黏附、趨化和激活其他炎性細(xì)胞，造成神經(jīng)元損傷[22]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：VD組大鼠1、2、4、8周時(shí)海馬組織TNF-α的含量均明顯高于Sham組，證實(shí)海馬組織TNF-α異常增加參與了血管性癡呆的病理過程。術(shù)后8周，NBP+VD組大鼠海馬組織TNF-α的含量明顯低于VD組大鼠（P < 0.05），提示NBP可以抑制腦缺血恢復(fù)期海馬組織TNF-α的過度表達(dá)，從而減弱因TNF-α引起的神經(jīng)損害，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

盡管IL-1β可能并不直接毒害神經(jīng)細(xì)胞，但I(xiàn)L-1β可以激活星形膠質(zhì)細(xì)胞，通過NF-κB途徑促使膠質(zhì)細(xì)胞釋放TNF-α和iNOs（iNOS可產(chǎn)生NO），NO對神經(jīng)細(xì)胞具有直接毒性，并且可以增加血腦屏障的通透性[23-24]。IL-1β還可以誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)ICAM-1、MCP-1等，促進(jìn)單核細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的浸潤，加重神經(jīng)炎性反應(yīng)，造成神經(jīng)損傷[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，VD組大鼠術(shù)后1、2、4、8周時(shí)海馬組織IL-1β含量均明顯高于Sham組，證實(shí)海馬組織IL-1β參與了血管性癡呆的病理過程。VD組大鼠2周時(shí)海馬組織IL-1β的含量明顯高于1、4、8周；提示IL-1β過表達(dá)在腦缺血2周時(shí)達(dá)到高峰。術(shù)后個(gè)時(shí)間點(diǎn)，NBP+VD組大鼠海馬組織IL-1β的含量與VD組大鼠相比均未發(fā)現(xiàn)明顯差異，提示NBP可能并不能影響VD大鼠海馬組織IL-1β的過度表達(dá)。

綜上所述，TNF-α和IL-1β表達(dá)增加參與了VD病理過程，其中IL-1β過表達(dá)在腦缺血2周時(shí)達(dá)到高峰。NBP可以抑制腦缺血恢復(fù)期海馬組織TNF-α的過度表達(dá)，減弱TNF-α引起的神經(jīng)損害，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，而NBP可能不影響VD大鼠海馬組織IL-1β的過度表達(dá)。

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（收稿日期：2016-10-17 本文編輯：李岳澤）