超高效液相色譜—三重四極桿質(zhì)譜法同時檢測烏頭湯中8種主要成分

徐新蕊　單文靜　吳健

[摘要] 目的 建立超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法同時測定烏頭湯中8種成分的定量方法。 方法 選用Waters Acquilty UPLC C18 column（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色譜柱，以乙腈-0.1%乙酸水溶液為流動相。質(zhì)譜條件：電噴霧離子（ESI）源，采用多反應(yīng)檢測模式（MRM）對烏頭湯中苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、芍藥苷、毛蕊異黃酮-7-O-β-D-Glu、甘草苷、甘草酸銨、麻黃堿進(jìn)行定量分析。 結(jié)果 苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、芍藥苷、毛蕊異黃酮-7-O-β-D-Glu、甘草苷、甘草酸銨、麻黃堿等8種成分的線性范圍分別為0.014～0.229、0.384～0.003、0.007～0.922、1.072～137.321、0.055～7.084、0.148～18.974、0.204～26.226、0.038～4.951 μg/mL，r2>0.9990，精密度相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為1.31%、1.52%、1.42%、1.56%、1.47%、1.59%、1.61%、1.57%。重復(fù)性RSD分別為2.4%、2.6%、2.7%、2.5%、3.1%、3.5%、2.3%、3.4%。回收率依次為92.68%、91.99%、92.79%、96.71%、97.19%、96.79%、98.15%、96.09%，RSD<2.15%。 結(jié)論 該方法快速、簡便、重復(fù)性好，可用于同時測定烏頭湯中的8種成分以及烏頭湯的質(zhì)量控制。

[關(guān)鍵詞] 烏頭湯；超高效液相色譜；三重四極桿質(zhì)譜；多反應(yīng)檢測模式；質(zhì)量控制

[中圖分類號] R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）01（c）-0147-05

[Abstract] Objective To establish a quantitative method of simultaneous determination of 8 major components in Wutou Decoction by ultra-high performance liquid chromatography coupled with triple quadrupole mass spectrometry. Methods Waters Acquilty UPLC C18 column （2.1 mm×100 mm， 1.7 μm） was selected as chromatographic column， aqueous solution of acetonitrile-1% acetic acid was taken as mobile phase. The conditions of mass spectrum： electrospray ions （ESI） source， multiple reaction monitoring （MRM） was used to take quantitative analysis of benzoylaconitine， benzoylhypaconitine， benzoylmesaconine， paeoniflorin， calycosin-7-O-β-D-glucopyranoside， liquiritin， ammonium glycyrrhetate， ephedrine in Wutou Decoction. Results The linearity range of 8 major components of benzoylaconitine， benzoylhypaconitine， benzoylmesaconine， paeoniflorin， calycosin-7-O-β-D-glucopyranoside， liquiritin， ammonium glycyrrhetate， ephedrine was 0.014-0.229， 0.384-0.003， 0.007-0.922， 1.072-137.321， 0.055-7.084， 0.148-18.974， 0.204-26.226， 0.038-4.951 μg/mL respectively， r2>0.9990. The relative standard deviation （RSD） of precision was 1.31%， 1.52%， 1.42%， 1.56%， 1.47%， 1.59%， 1.61%， 1.57% respectively. The repeatability of RSD was 2.4%， 2.6%， 2.7%， 2.5%， 3.1%， 3.5%， 2.3%， 3.4% respectively. The recovery rate was 92.68%， 91.99%， 92.79%， 96.71%， 97.19%， 96.79%， 98.15%， 96.09% respectively， RSD<2.15%. Conclusion This method is rapid， simple and convenient， with good repeatability， which can be used for the simultaneous determination of 8 major components in Wutou Decoction and the quality control of Wutou Decoction.

[Key words] Wutou Decoction； Ultra-high performance liquid chromatography； Triple quadrupole mass spectrometry； Multiple reaction monitoring； Quality control

烏頭湯出自《金匱要略》，由制川烏、麻黃、炙甘草、白芍、黃芪組成，具有溫經(jīng)散寒、祛濕鎮(zhèn)痛的功效，主治寒濕痹證[1-3]。制川烏雖是有毒之品，在臨床上卻廣泛應(yīng)用于風(fēng)寒濕痹、關(guān)節(jié)疼痛、心腹冷痛、麻醉鎮(zhèn)痛等[4-6]。國內(nèi)外就烏頭湯中有效成分的測定及其在治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的客觀內(nèi)在規(guī)律中進(jìn)行了多層次的研究，并取得了一定的進(jìn)展[7-20]，但鮮見關(guān)于烏頭湯方劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)或物質(zhì)基礎(chǔ)的研究報道。本研究采用超高效液相色譜法對烏頭湯中8種有效成分同時進(jìn)行定量測定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1290高效液相色譜儀，Agilent 6460質(zhì)譜檢測器；BandelinSonorex RK 1208BH超聲波清洗器（德國）；HWS 24型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Milipore超純水機；美國Mililpore公司METTLER Toledo AB265-S電子天平（瑞士）。

1.2 藥品

甲醇、乙腈購于美國ACS恩科化學(xué)，乙酸、乙酸銨購于Sigma公司，均為色譜純。水為超純水，其余試劑均為分析純。制川烏、麻黃、白芍、黃芪、炙甘草等藥材購于哈爾濱人民同泰藥房，經(jīng)哈爾濱商業(yè)大學(xué)理學(xué)院吳健副研究員鑒定均為正品。芍藥苷、甘草酸銨、甘草苷、麻黃堿、苯甲酰烏頭原堿（BA）、苯甲酰次烏頭原堿（BHA）、苯甲酰新烏頭原堿（BMA）、毛蕊異黃酮-7-O-β-D-Glu苷購于中國食品藥品檢定研究院。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用Waters ACQULTY UPLC C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色譜柱進(jìn)行分析，以0.01 mol/L醋酸銨溶液（含0.1%乙酸溶液）為流動相A，乙腈為B，進(jìn)行梯度洗脫。0～20 min，流動相A（%）為95→80；20～30 min，流動相A（%）為80→70；30～40 min，流動相A（%）為70→50；40～50 min，流動相A（%）為50，流速為0.35 mL/min，進(jìn)樣量為1 μL，柱溫為30℃。

2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI源），檢測方式：正離子檢測，掃描方式：多反應(yīng)離子監(jiān)測（MRM），對照品的選擇檢測離子質(zhì)荷比為芍藥苷：498.2→179.1；甘草酸銨：823.4→453.3；甘草苷：419.1→257.1；麻黃堿：166.0→132.8；BA：604.3→105.1；BHA：574.3→105.1；BMA：590.3→105.1；毛蕊異黃酮-7-O-β-D-Glu：447.1→285.1，干燥氣（N2）流速11.0 L/min，Nebulizer 0.10335 MPa，干燥氣溫度300℃，檢測器電壓4000 V。

2.3 對照品溶液的制備

精密取各對照品適量，分別置于量瓶中以甲醇溶解并定容，搖勻，得對照品溶液，精密吸取各對照品溶液于同一容量瓶中，甲醇定容至刻度，即得混合對照品溶液。各成分含量為芍藥苷137 μg/mL、甘草酸銨26.2 μg/mL、甘草苷18.9 μg/mL、麻黃堿4.96 μg/mL、BA 0.229 μg/mL、BHA 0.384 μg/mL、BMA 0.926 μg/mL、毛蕊異黃酮-7-O-β-D-Glu 7.08 μg/mL。

2.4 供試品溶液的制備

按照《金匱要略》記載的烏頭湯方劑配藥：稱取川烏6 g、黃芪9 g、麻黃9 g、甘草9 g、白芍9 g粉末，混合后以10倍量水浸泡1 h，回流提取1.5 h，取上清液，將藥渣再以8倍量水提取1.5 h，合并上清液。濃縮水煎液并減壓干燥，得浸膏12.1 g。取浸膏約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入70%甲醇10 mL，超聲處理30 min，補重，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.5 陰性對照溶液的制備

按照“2.3”項下方法制成不含上述8種標(biāo)準(zhǔn)品的陰性樣品溶液，備用。

2.6 專屬性考察

按色譜條件，分別取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液進(jìn)樣測定，結(jié)果樣品在各對照品的位置上無干擾。結(jié)果見圖1～2。

2.7 線性關(guān)系的考察

精密吸取混合對照品溶液適量，依次稀釋得系列質(zhì)量濃度溶液。在上述色譜條件下測定，峰面積為縱坐標(biāo)（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表1。

2.8 精密度考察

精密吸取混合對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄各組色譜峰峰面積。結(jié)果BA、BHA、BMA、芍藥苷、毛蕊異黃酮-7-Glu、甘草苷、甘草酸銨、麻黃堿峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為1.23%、1.41%、1.37%、1.38%、1.31%、1.42%、1.39%、1.26%。精密吸取混合對照品溶液連續(xù)2 d進(jìn)樣，每天3次，記錄各組色譜峰峰面積。8種對照品峰面積的RSD分別為1.31%、1.52%、1.42%、1.56%、1.47%、1.59%、1.61%、1.57%。

2.9 重復(fù)性試驗

取樣品6份，按“2.4”項下配制供試品溶液。按“2.1”項下條件測定。結(jié)果BA、BHA、BMA、芍藥苷、毛蕊異黃酮-7-Glu、甘草苷、甘草酸銨、麻黃堿峰面積的RSD分別為2.4%、2.6%、2.7%、2.5%、3.1%、3.5%、2.3%、3.4%（n = 6）符合試驗要求。

2.10 穩(wěn)定性試驗

取樣品，按“2.4”項下制備溶液，放置于進(jìn)樣室中，放置0、4、8、12、24 h，按“2.1”項下檢測。結(jié)果BA、BHA、BMA、芍藥苷、毛蕊異黃酮-7-Glu、甘草苷、甘草酸銨、麻黃堿峰面積的RSD分別為3.3%、2.1%、2.7%、3.2%、3.0%、2.7%、2.9%、2.5%（n = 6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.11 加樣回收率試驗

精密稱定樣品約0.5 g，加入各對照品溶液適量，按“2.4”項下制備，測定并計算回收率，結(jié)果見表2，實驗結(jié)果符合中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法的要求。

2.12 樣品含量測定

按照“2.4”項下方法制備三批烏頭湯浸膏，“2.1”項下方法檢測，計算每批樣品中各檢測成分的含量。見表3。

3 討論

本試驗考察了不同色譜柱、流動相及質(zhì)譜條件對化合物定量的影響，結(jié)果表明，Waters Acquilty UPLC C18 column（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色譜柱，效果較為理想，各化合物峰形良好。使用乙腈-0.1%乙酸水溶液為流動相，各化合物分離較好，無相互干擾，出峰時間短。

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（收稿日期：2016-10-09 本文編輯：張瑜杰）