H5N6禽流感病毒雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR的建立與應(yīng)用

譚翰清 程潔萍 朱穎梅 譚海芳 黃強(qiáng) 蘇樂(lè)斌 林鳳 鄧廷國(guó) 黎碧堅(jiān)

526060 肇慶，廣東省肇慶市疾病預(yù)防控制中心

·技術(shù)方法·

H5N6禽流感病毒雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR的建立與應(yīng)用

譚翰清 程潔萍 朱穎梅 譚海芳 黃強(qiáng) 蘇樂(lè)斌 林鳳 鄧廷國(guó) 黎碧堅(jiān)

526060 肇慶，廣東省肇慶市疾病預(yù)防控制中心

目的 建立H5N6禽流感病毒TaqMan-MGB探針雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR，用于疑似病例快速診斷及活禽交易市場(chǎng)外環(huán)境監(jiān)測(cè)。方法 根據(jù)GenBank 中H5N6禽流感病毒HA和NA高保守序列設(shè)計(jì)特異引物和TaqMan-MGB探針,建立和優(yōu)化雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR體系,進(jìn)行特異性、靈敏度、重復(fù)性試驗(yàn)，并在臨床應(yīng)用中與商品化試劑盒比較。結(jié)果 H5N6雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR體系可在80 min內(nèi)完成檢測(cè)，與其它亞型流感病毒及常見(jiàn)呼吸道病原體無(wú)交叉反應(yīng)，最低檢測(cè)限達(dá)到10拷貝/反應(yīng)，H5和N6靶基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R2分別為0.999和0.993，Ct值的變異系數(shù)分別為0.151%-0.549%和0.213%-0.575%，驗(yàn)證試驗(yàn)的陽(yáng)性和陰性符合率均為100%。結(jié)論 H5N6禽流感病毒TaqMan-MGB探針雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR特異、靈敏、穩(wěn)定,可在疑似病例的早期快速應(yīng)急檢測(cè)及活禽交易市場(chǎng)外環(huán)境持續(xù)性監(jiān)測(cè)方面具有較好的應(yīng)用價(jià)值。

Fund programs: Medical Science and Technology Research Foundation of Guangdong Province(A2015573);Zhaoqing Science and Technology Innovation Project(2015E1810)

自1997年首次發(fā)現(xiàn)人感染H5N1以來(lái)，H5亞型系列的禽流感病毒在不斷進(jìn)化、重組，已在禽類中發(fā)現(xiàn)H5N2、H5N5、H5N6、H5N8等亞型。近年監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，禽類及外環(huán)境中H5N6呈上升趨勢(shì)[1-4]，廣東、江西等地部分養(yǎng)殖場(chǎng)H5N6禽流感疫情[5]。2014年5月四川省發(fā)現(xiàn)了全球首個(gè)H5N6人感染病例，廣東、云南等地也相繼報(bào)告新的病例；活禽交易市場(chǎng)外環(huán)境中H5N6具有較高的污染率[6]。2015年12月肇慶市也發(fā)現(xiàn)1例H5N6病例，活禽交易市場(chǎng)外環(huán)境H5N6污染狀況嚴(yán)重。

表1 H5N6禽流感病毒引物及TaqMan-MGB探針序列

注：H5引物、探針位置以KT245143序列為參考，N6引物、探針位置以KT313412序列為參考

Note:The position of primers and probes targed for the gene of H5 and N6 were refered to the sequences KT245143 and KT313412,respectively

H5N6在禽間的優(yōu)勢(shì)流行及人類感染病例的頻密報(bào)告，給全球公共衛(wèi)生敲響了警鐘，需要加強(qiáng)對(duì)該病毒的快速診斷與持續(xù)監(jiān)測(cè)。實(shí)時(shí)熒光RT-PCR具有快速、特異、靈敏的優(yōu)勢(shì)[7]，是新發(fā)和再發(fā)傳染病應(yīng)急檢測(cè)與監(jiān)測(cè)的重要工具。本研究擬建立H5N6禽流感TaqMan-MGB探針雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)體系，用于疑似病例的快速診斷與活禽交易市場(chǎng)外環(huán)境持續(xù)性監(jiān)測(cè)，為臨床救治、疫情防控提供準(zhǔn)確的病原學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 7500fast實(shí)時(shí)熒光PCR儀(美國(guó)ABI)、QIAxtractor核酸提取儀(德國(guó)Qiagen)、高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Hettich220)、凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)BioRad)等；QIAamp Viral RNA Mini Kit、QIAxtractor 病毒全自動(dòng)核酸提取試劑盒、QIAprep Spin Miniprep Kit質(zhì)粒提取試劑(德國(guó)Qiagen)，One-Step RT-PCR試劑盒(Abiom公司)。

1.2 引物和探針 根據(jù)GenBank公布的H5N6病毒HA和NA基因序列，通過(guò)NCBI的BLAST確定高保守區(qū)域，利用Primer-designer、Primer 5.0、Primer Express 3.0進(jìn)行引物和TaqMan-MGB探針的設(shè)計(jì)與評(píng)價(jià)，具體序列見(jiàn)表1。

1.3 核酸提取 咽拭子、外環(huán)境涂抹拭子需震蕩混勻后3 000 rpm離心5 min，取140 μl上清液進(jìn)行病毒RNA提取，大批量樣本用QIAxctrator提取，小量標(biāo)本用QIAamp Viral RNA Mini Kit手工提取，RNA -75℃保存?zhèn)溆茫唧w操作參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.4 陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的制備 以肇慶市H5N6病例咽拭RNA為模板，進(jìn)行H5和N6靶基因擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物純化后連接至pUCK載體，并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)藍(lán)白斑篩選、增菌后，進(jìn)行陽(yáng)性克隆質(zhì)粒的抽提、純化與鑒定，紫外分光光度計(jì)測(cè)值后稀釋成1×109拷貝/μl，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR初步建立與優(yōu)化 根據(jù)One step RT-PCR Kit推薦的各組分濃度和循環(huán)參數(shù)，初步建立H5及N6一步法TaqMan-MGB探針單重及雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)體積為25 μl。并根據(jù)引物、探針的溶解溫度，調(diào)整和選擇實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)的退火溫度與時(shí)間，利用矩陣法優(yōu)化引物和探針的最佳反應(yīng)濃度。

1.6 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR特異性試驗(yàn) 對(duì)H5N1、H5N2、H5N6、H6N6、H7N9、H9N2、H3N2、H1N1(2009)、Bv和By亞型流感、副流感、腺病毒3型、呼吸道合胞病毒、偏肺病毒等進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR，檢測(cè)H5N6雙重反應(yīng)體系的特異性。

1.7 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR靈敏度試驗(yàn) 取106-100拷貝/μl梯度的陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線和確定其最低檢測(cè)下限。

1.8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取H5N63個(gè)濃度核酸各10份，-75℃保存，每天對(duì)各濃度樣本進(jìn)行雙樣檢測(cè)，對(duì)10次反應(yīng)的Ct值統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算各樣品Ct值的平均值和變異系數(shù)，評(píng)價(jià)反應(yīng)體系的重復(fù)性。

圖1 H5N6實(shí)時(shí)熒光RT-PCR特異性(A)與靈敏度(B)試驗(yàn)Fig.1 Specificity and Sensitivity test of real-time RT-PCR for H5N6(A for specificity and B for sensitivity)

1.9 雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR臨床標(biāo)本驗(yàn)證試驗(yàn) 用經(jīng)廣東省疾病預(yù)防控制中心流感參比中心已確診的肇慶市人感染H5N6病例咽拭、外環(huán)境監(jiān)測(cè)陽(yáng)性及陰性標(biāo)本，對(duì)本研究建立的H5N6雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，并與兩種經(jīng)省流感參比中心評(píng)估過(guò)的實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒進(jìn)行比較，應(yīng)用SPSS17.0進(jìn)行兩個(gè)樣本率的卡方檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的克隆與鑒定 H5和N6靶基因陽(yáng)性克隆質(zhì)粒PCR擴(kuò)增后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在85 bp、142 bp處有單一特異亮帶；陽(yáng)性克隆質(zhì)粒靶基因片段所測(cè)到的序列經(jīng)NCBI比對(duì)，與GenBank已公布的H5N6亞型中的HA(KT245143)和NA(KT313412)保守序列相一致。

2.2 雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化 RT-PCR反應(yīng)液體積20 μl，模板量加樣量5 μl。經(jīng)矩陣法優(yōu)化，當(dāng)反應(yīng)體系中H5靶基因的引物和探針終濃度分別為0.4和0.2 μmol/L、N6靶基因的引物和探針終濃度分別為0.5和0.3 μmol/L時(shí)，可獲得的雙重反應(yīng)擴(kuò)增曲線效果最佳。ABI7500fast實(shí)時(shí)熒光PCR儀上反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為：45℃逆轉(zhuǎn)錄15 min；95℃滅活10 min；95℃變性10 s，56℃退火/延伸45 s(末端收集熒光)，45個(gè)循環(huán)。

2.3 反應(yīng)體系特異性 雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR對(duì)H1N1(2009)、H3N2、H7N9、H9N2、Bv和By亞型流感、副流感病毒、腺病毒3型、呼吸道合胞病毒、偏肺病毒均無(wú)擴(kuò)增反應(yīng)，對(duì)H5N1、H5N2僅有H5單重?cái)U(kuò)增，對(duì)H6N6僅有N6單重?cái)U(kuò)增，對(duì)H5N6具有典形“S”形雙擴(kuò)增曲線(圖1A)。

2.4 靈敏度 H5N6雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR在109-101拷貝/μl的稀釋梯度具有良好間隔的擴(kuò)增曲線，最低檢測(cè)下限能可達(dá)10拷貝數(shù)/反應(yīng) (圖1B)。H5靶基因標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2為0.999，標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率-3.354，截距43.128(圖2A)；N6靶基因標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2為0.993，標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率-3.362，截距43.657(圖2B)。

2.5 重復(fù)性 對(duì)H5N6病毒3個(gè)不同核酸濃度樣本(H、M、L)檢測(cè)10次，H5靶基因的Ct值平均數(shù)分別為20.32、27.24、33.13，變異系數(shù)CV為0.151%-0.549%；N6靶基因的Ct值分別為21.02、28.01、33.24，變異系數(shù)CV為0.213%-0.575%。2.6 臨床樣本的驗(yàn)證性 對(duì)肇慶市首例人感染H5N6病例的3份陽(yáng)性咽拭、外環(huán)境監(jiān)測(cè)的28份陽(yáng)性標(biāo)本和180份陰性標(biāo)本進(jìn)行驗(yàn)證，H5N6雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)體系可對(duì)標(biāo)本進(jìn)行有效的區(qū)分，陽(yáng)性擴(kuò)增曲線呈典型S型，與兩種主流的商品化H5N6核酸實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑陰陽(yáng)性結(jié)果相一致。

3 討論

圖2 H5和N6亞型實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(A為H5、B為N6)Fig.2 Standard curve of real-time RT-PCR for H5 and N6 subtypes (A for H5 and B for N6)

H5N6為近年來(lái)新出現(xiàn)的高致病性禽流感亞型，自2014年5月四川發(fā)現(xiàn)了全球首例人感染H5N6病例，至2016年5月，我國(guó)共報(bào)告H5N6確診病例13例、死亡6人，其中廣東6例(肇慶1例)。研究者對(duì)H5N6禽源株和人感染毒株進(jìn)行基因序列分析，發(fā)現(xiàn)其由H5N1和H6N6重組、進(jìn)化而來(lái)[8，9]；2014年廣州發(fā)現(xiàn)的人感染H5N6毒株HA及NA基因與2013年?yáng)|莞養(yǎng)殖場(chǎng)中雞分離株核酸同源性分別為99.4%和98.3%，內(nèi)部基因同源性高達(dá)98.5%-100%，揭示了該病例所感染的H5N6禽流感病毒來(lái)源于禽類毒株[10]。鑒于當(dāng)前H5N6在禽類間的廣泛流行和對(duì)人致病的嚴(yán)重性，加強(qiáng)對(duì)該亞型禽流感的持續(xù)監(jiān)測(cè)是十分必要的。

實(shí)時(shí)熒光RT-PCR可為禽流感病毒快速檢測(cè)與監(jiān)測(cè)發(fā)揮重要作用。周其偉等[11]應(yīng)用TaqMan-LNA探針技術(shù)建立了H7N9實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法，劉婷婷等[12]應(yīng)用TaqMan探針技術(shù)建立了H3N8實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法，均取得較好的效果。本研究通過(guò)對(duì)GenBank中H5N6亞型的HA和NA序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)不同毒株序列間難以找到高保守區(qū)進(jìn)行TaqMan探針或分子信標(biāo)探針較長(zhǎng)片段的設(shè)計(jì)，而采用TaqMan-MGB探針技術(shù)，可使探針Tm值提高10℃左右且設(shè)計(jì)得更短[13]，極大地增加了引物、探針組合的可選性。經(jīng)NCBI網(wǎng)站BLAST，本研究設(shè)計(jì)的H5N6雙重引物和TaqMan-MGB探針均能特異地涵蓋GeneBank已發(fā)布的H5N6序列，與其他流感病毒亞型和病原體序列不發(fā)生交叉反應(yīng)，擴(kuò)增曲線呈典型S型，最低檢測(cè)下限可達(dá)10拷貝/反應(yīng)，臨床應(yīng)用試驗(yàn)的陽(yáng)性和陰性結(jié)果符合率100%，擴(kuò)增效果與兩種主要的商品試劑相一致。本研究建立的H5N6禽流感TaqMan-MGB探針雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR可同時(shí)檢測(cè)H5和N6靶基因，特異、靈敏地發(fā)現(xiàn)和鑒別臨床疑似病例、外環(huán)境標(biāo)本中的H5N6病毒，為臨床救治、疫情防控和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供快速、準(zhǔn)確的病原學(xué)依據(jù)，具有較好的推廣應(yīng)用前景。

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Development and application of dual real time RT-PCR for avian influenza H5N6 virus

TanHanqing,ChengJieping,ZhuYingmei,TanHaifang,HuangQiang,SuLebin,LinFeng,DengTingguo,LiBijian

ZhaoqingCenterforDiseaseControlandPrevention,Zhaoqing526060,ChinaCorrespondingauthor:TanHanqing,Email:tanhanqing2000@163.com

Objective To establish a TaqMan-MGB probe-based real-time fluorescence RT-PCR assay for avian influenza H5N6 virus used in rapid diagnosis for suspected cases and surveillance for outer environment of live poultry markets. Methods Based on the conservative sequences of avian influenza H5N6 virus for HA and NA gene published on GenBank，specific primers and TaqMan-MGB probes were designed to develop and optimize for the dual real-time RT-PCR assay. Specificity, sensitivity, repeatability and comparison tests were carried out. Results This dual real-time RT-PCR detection can be completed within 80 minutes. There was no cross-reaction with other subtypes of influenza virus and common respiratory pathogens. The minimum detection limit could be up to 10 copies/reaction. The correlation coefficient of standard curve for the gene of H5 and N6 were 0.999 and 0.993,and the coefficients of variation for cycle threshold were range from 0.151%-0.549%and 0.213%-0.575%, respectively. The positive and negative coincidence rates of the validation test were 100%．Conclusions This TaqMan-MGB probe-based dual real-time RT-PCR for avian influenza H5N6 virus was rapid, specific and sensitive. It will have a good use in early emergency detection of suspected cases and continuous monitoring of external environment in live poultry trade market.

Avian influenza H5N6 virus；Real-time RT-PCR；TaqMan-MGB probe；Hemagglutinin gene；Neuraminidase gene

廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金(A2015573)；肇慶市科技創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(2015E1810)

譚翰清，Email:tanhanqing2000@163.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.01.013

H5N6禽流感病毒；實(shí)時(shí)熒光RT-PCR；TaqMan-MGB探針；血凝素基因；神經(jīng)氨酸酶基因

2016-08-05)