慢性肝病患者拉米夫定耐藥毒株突變模式特征分析

歐陽(yáng)雅博 李慶 魏飛力 張玉林 黃雁翔 宋晨朝 郭向華 謝放 王珊珊 陳德喜

100069 北京， 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院 北京市肝病研究所

·論著·

慢性肝病患者拉米夫定耐藥毒株突變模式特征分析

歐陽(yáng)雅博 李慶 魏飛力 張玉林 黃雁翔 宋晨朝 郭向華 謝放 王珊珊 陳德喜

100069 北京， 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院 北京市肝病研究所

目的 探討拉米夫定(LAM)耐藥毒株突變模式及HBV S基因相關(guān)變異在不同疾病進(jìn)展慢性肝病患者中的特征。方法 收集LAM耐藥慢性肝病患者的血液標(biāo)本，獲得相應(yīng)的HBV RT基因核苷酸序列，分析耐藥突變位點(diǎn)、藥物耐受和耐藥相關(guān)HBV S基因變異特點(diǎn)及組間差異。結(jié)果本研究納入慢性乙型肝炎(CHB)患者47例，乙肝肝硬化(LC)和乙肝相關(guān)肝細(xì)胞癌(HCC)患者16例。M204I單點(diǎn)突變與L180M+M204I/V為L(zhǎng)AM耐藥的慢性肝病患者最常見(jiàn)突變形式(35/63，55.56%)。LC/HCC組對(duì)三種以上核苷(酸)類(lèi)似物同時(shí)耐藥人數(shù)高于CHB組(62.50% vs 34.04%，P=0.046)。LC/HCC組在HBV-S區(qū)檢測(cè)到與免疫逃逸相關(guān)的HBsAg突變位點(diǎn)數(shù)多于CHB組(62.50% vs 31.91%，P=0.031)，I126T/V與G145A(LCC/HCC，60%)、I126S/T與S117T(CHB，46.67%)為HBsAg逃逸突變的最常見(jiàn)形式。兩組患者均檢測(cè)到RT區(qū)變異伴隨HBsAg終止密碼子的突變(rtA181T/sW172*和rtM204I/sW196*)。結(jié)論 不同疾病進(jìn)展慢性肝病患者LAM耐藥毒株突變及相關(guān)HBV S基因變異特征存在差異，LC/HCC患者多重耐藥和免疫逃逸毒株比例高于CHB患者。

Fund programs: National Natural Science Foundation of China(81361120401)；Capital Health Research and Development of Special(2014-1-1151)； Beijing Talents Fund Supported Young Backbone Project(2015000021469G183)； You An Liver Disease and AIDS Foundation for Young Talent Incubation Project(YNKT20160015)

核苷(酸)類(lèi)似物[nucleos(t)ide analogs，NAs]的廣泛應(yīng)用對(duì)延緩慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B, CHB)病程進(jìn)展，減少肝硬化(liver cirrhosis，LC)與肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)發(fā)生起著關(guān)鍵作用[1]。然而我國(guó)抗病毒治療的常用藥物拉米夫定(Lamivudine，LAM)長(zhǎng)期服用后可產(chǎn)生較高的耐藥率并潛在增加患者對(duì)其他NAs的交叉耐藥性[2]。乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)P基因與S基因的開(kāi)放讀碼框存在重疊，LAM治療誘導(dǎo)的P基因的耐藥突變可引起HBV表面抗原(Hepatitis B surface antigen，HBsAg)S基因氨基酸發(fā)生變異，這些變化可能影響患者的疾病進(jìn)程和疫苗接種應(yīng)答反應(yīng)[3]。因此，本研究擬對(duì)LAM耐藥的慢性肝病患者為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)其感染的HBV耐藥突變模式及相關(guān)HBV S基因變異特征進(jìn)行分析，以比較HBV在不同疾病進(jìn)展患者中的突變特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 一般資料 回顧性納入2012年5月至2012年10月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院LAM耐藥的慢性肝病患者63例。其中，CHB和LC診斷均依據(jù)《病毒性肝炎防治方案》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并排除重疊感染[4]；HCC的診斷按照《原發(fā)性肝癌的臨床診斷與分期標(biāo)準(zhǔn)》進(jìn)行[5]。排除人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)、戊型肝炎病毒(HEV)及其他嗜肝病毒感染。收集患者血漿5 ml于-80℃凍存?zhèn)溆?。本研究獲北京佑安醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者在參與項(xiàng)目前進(jìn)行了知情同意書(shū)簽署。

1.2 方法

1.2.1 肝功能和HBV DNA定量檢測(cè)：血清ALT、AST等肝功能指標(biāo)采用OLMPUS-AU5400生化檢測(cè)儀及其配套試劑檢測(cè)。HBV DNA定量采用核酸熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(美國(guó)ABI 7500 Fast Real time PCR儀及相關(guān)試劑盒)，單位為IU/ml。血清HBV標(biāo)志物采用美國(guó)雅培公司的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒檢測(cè)。

1.2.2 HBV DNA提取，目的片段擴(kuò)增和測(cè)序：按照德國(guó)Qiagen公司HBV DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)操作提取血漿中HBV DNA后，參照文獻(xiàn)獲得P基因RT區(qū)序列[6]，陽(yáng)性PCR產(chǎn)物送往公司測(cè)序。

1.2.3 序列分析：獲得序列經(jīng)Sequencher 5.2.4軟件清理拼接后在斯坦福大學(xué)耐藥數(shù)據(jù)庫(kù)和HBV在線(xiàn)耐藥解釋工具進(jìn)行耐藥位點(diǎn)及HBsAg逃逸突變位點(diǎn)分析。利用BioEdit軟件進(jìn)行基于DNA序列的多序列比對(duì)用于組間突變位點(diǎn)比較。通過(guò)MEGA6.0軟件中的鄰位法及Kumura-2雙參數(shù)模型，自展法重復(fù)運(yùn)算1 000次構(gòu)建基于HBV RT區(qū)的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)用于HBV基因亞型確認(rèn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 組間人口學(xué)特征、臨床特征及突變位點(diǎn)差異分析根據(jù)數(shù)據(jù)情況通過(guò)SPSS 17.0軟件選擇Mann-Whitney非參數(shù)檢驗(yàn)、卡方檢驗(yàn)或Fisher精確計(jì)算法檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；以雙尾P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CHB與LC/HCC患者人口學(xué)及臨床特征比較 在LAM耐藥的63例慢性肝病患者中，CHB患者47例(男性31例，女性16例)，LC患者8例(男性6例，女性2例)，HCC患者8例(男性7例，女性1例)。將所有患者分為兩組，通過(guò)比較可見(jiàn)(表1)，除LC/HCC組的年齡及天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)大于CHB組外(均P<0.05)，兩組在性別、HBsAg陽(yáng)性比例、HBeAg陽(yáng)性比例、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、HBV DNA水平及基因型方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 CHB與LC/HCC患者HBV-RT區(qū)耐藥突變模式比較 63例慢性肝病患者除檢測(cè)到LAM耐藥相關(guān)突變位點(diǎn)外，阿德福韋酯(Adefovir dipivoxil，ADV)(A181T/V，N236T)與恩替卡韋(Entecavir，ETV)(T184A/I/S，S202G，M250I/V)耐藥位點(diǎn)也被檢測(cè)到。M204I單點(diǎn)突變與L180M+M204I/V為L(zhǎng)AM耐藥的慢性肝病患者最常見(jiàn)突變形式(35/63，55.56%)。CHB組與LC/HCC組的HBV-RT區(qū)耐藥突變模式前三位構(gòu)成差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.042，P=0.257)。63例患者所檢測(cè)到的LAM耐藥相關(guān)位點(diǎn)全部可導(dǎo)致替比夫定(Telbivudine，LdT)耐藥，而對(duì)三種以上NAs同時(shí)耐藥(LAM/LdT+ADV/ETV)的患者比例在兩組患者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.988，P=0.046)，LC/HCC組(10/16，62.50%)高于CHB組(16/47，34.04%)。

表1 慢性肝病患者人口學(xué)及臨床特征比較

注：a， Mann-Whitney檢驗(yàn); b，卡方檢驗(yàn); c， Fisher精確計(jì)算法檢驗(yàn); d， 中位數(shù) (范圍)*P<0.05

Note: a， Mann-Whitney test; b，chi-square test; c， Fisher’s exact test； d， Median (Range)*P<0.05

表2 慢性肝病患者基因型耐藥時(shí)HBV S基因的突變

2.3 CHB與LC/HCC患者耐藥相關(guān)HBV S基因變異比較 本研究中39.68%的慢性肝病患者(25/63)可在HBV-S區(qū)檢測(cè)到與免疫逃逸相關(guān)的HBsAg突變位點(diǎn)(表2)，其中LC/HCC組(10/16，62.50%)檢出比例高于CHB組(15/47，31.91%；χ2=4.665，P=0.031)。通過(guò)比較慢性肝病患者基因型耐藥時(shí)HBV S基因的突變類(lèi)型，LC/CHB組HBsAg逃逸突變的最常見(jiàn)形式為I126T/V與G145A(6/10，60%)，CHB組HBsAg逃逸突變比例最高的為I126S/T與S117T(7/15，46.67%)。慢性肝病患者中也可檢測(cè)到RT區(qū)變異伴隨HBsAg終止密碼子的突變(突變類(lèi)型包括rtA181T/sW172*、rtV191I/sW182*、rtM204I/sW196*和rtV207I/sW199*)(表2)，CHB組(19/47，40.43%)與LC/HCC組(3/16，18.75%)檢出比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.468，P=0.116)。

3 討論

LAM仍是目前我國(guó)臨床進(jìn)行抗HBV治療的主要藥物，其在慢性肝病患者中長(zhǎng)期廣泛應(yīng)用后，通過(guò)對(duì)HBV P 基因和S基因產(chǎn)生選擇壓力導(dǎo)致攜帶特異突變位點(diǎn)的HBV耐藥毒株出現(xiàn)并增加免疫逃逸毒株產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)，這可導(dǎo)致LC和HCC的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加，提高了治療難度和長(zhǎng)期治療的醫(yī)療成本[7]。本研究所納入的研究對(duì)象為曾單用或聯(lián)用LAM的慢性肝病患者，故ADV與EFV的耐藥相關(guān)突變位點(diǎn)也可被檢測(cè)到。對(duì)于LAM耐藥，V173L和L180M是公認(rèn)的M204V的代償性耐藥突變位點(diǎn)[8]。本研究中M204I單點(diǎn)突變與L180M+M204I/V為L(zhǎng)AM耐藥慢性肝病患者最常見(jiàn)突變形式。LC/HCC組對(duì)三種以上NAs同時(shí)耐藥的患者比例明顯高于CHB組，提示多重耐藥的發(fā)生在不同疾病進(jìn)展肝病患者中存在差異。

HBsAg是HBV穿膜蛋白同時(shí)也是人免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用的重要靶位，其突變所引起的免疫逃逸可導(dǎo)致一些中和抗體不能識(shí)別[9]。本研究顯示39.68%的慢性肝病患者可在HBV S區(qū)檢測(cè)到與免疫逃逸相關(guān)的HBsAg突變位點(diǎn)，其中LC/HCC組檢出比例高于CHB組，這說(shuō)明在NAs藥物壓力下LC/HCC組產(chǎn)生了更多的免疫逃逸毒株。與免疫逃逸相關(guān)的HBsAg突變位點(diǎn)的出現(xiàn)可能或多或少改變HBsAg的抗原性，這也是對(duì)目前商品化HBsAg診斷試劑及乙肝疫苗免疫的挑戰(zhàn)。HBV感染者體內(nèi)存在復(fù)雜的準(zhǔn)種，因此，基于Sanger測(cè)序結(jié)果獲得的HBV準(zhǔn)種優(yōu)勢(shì)種群RT區(qū)特征分析及預(yù)測(cè)可能會(huì)與血清HBV標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果存在不一致現(xiàn)象。另外HBsAg可發(fā)生終止密碼子提前產(chǎn)生的突變類(lèi)型，將導(dǎo)致截短的HBsAg表達(dá)，使病毒粒子和亞病毒顆粒從感染細(xì)胞中的分泌受阻[10]。本研究慢性肝病患者中可檢測(cè)到RT區(qū)變異伴隨HBsAg終止密碼子的突變，且兩組均檢測(cè)到rtA181T/sW172*。rtA181T/sW172*突變不僅對(duì)LAM和ADV耐藥，而且被報(bào)道與疾病進(jìn)展和HCC的發(fā)生相關(guān)，其潛在危險(xiǎn)性可能是HBsAg細(xì)胞內(nèi)潴留可產(chǎn)生顯著內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激從而導(dǎo)致持續(xù)的肝細(xì)胞損傷和再生[9]。因此，在大規(guī)模推廣NAs抗病毒治療的背景下，明確慢性肝病不同進(jìn)展患者HBV的耐藥突變模式和S基因突變情況有利于了解病毒的進(jìn)化方向和適應(yīng)性改變對(duì)疾病進(jìn)程的影響。

[1] Marcellin P, Gane E, Buti M, et al. Regression of cirrhosis during treatment with tenofovir disoproxil fumarate for chronic hepatitis B: a 5-year open-label follow-up study[J]. Lancet,2013,381(9865):468-475. doi: 10.1016/S0140-6736(12)61425-1.

[2] Locarnini S. Primary resistance, multidrug resistance, and cross-resistance pathways in HBV as a consequence of treatment failure[J]. Hepatol Int,2008,2(2):147-151. doi: 10.1007/s12072-008-9048-3.

[3] Mantovani N, Cicero M, Santana LC, et al. Detection of lamivudine-resistant variants and mutations related to reduced antigenicity of HBsAg in individuals from the cities of Santos and Sao Paulo, Brazil[J]. Virol J,2013,10:320. doi: 10.1186/1743-422X-10-320.

[4] 病毒性肝炎防治方案[J]. 中華傳染病雜志,2001,19(1):56-62.

[5] 中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)肝癌專(zhuān)業(yè)委員會(huì). 原發(fā)性肝癌的臨床診斷與分期標(biāo)準(zhǔn)[J]. 中華肝臟病雜志,2001,9(6):324.

[6] 金怡，魏飛力，馬麗娜，等. PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法檢測(cè)乙肝病毒耐藥位點(diǎn)的臨床研究[J]. 北京醫(yī)學(xué),2011,33(12):961-965.

[7] Lacombe K, Boyd A, Lavocat F, et al. High incidence of treatment-induced and vaccine-escape hepatitis B virus mutants among human immunodeficiency virus/hepatitis B-infected patients[J]. Hepatology,2013,58(3):912-922. doi: 10.1002/hep.26374.

[8] Ji D, Liu Y, Li L, et al. The rtL229 substitutions in the reverse transcriptase region of hepatitis B virus (HBV) polymerase are potentially associated with lamivudine resistance as a compensatory mutation[J]. J Clin Virol,2012,54(1):66-72. doi: 10.1016/j.jcv.2012.02.003.

[9] Yeh CT. Development of HBV S gene mutants in chronic hepatitis B patients receiving nucleotide/nucleoside analogue therapy[J]. Antivir Ther,2010,15(3 Pt B):471-475. doi: 10.3851/IMP1552.

[10] Warner N, Locarnini S. The antiviral drug selected hepatitis B virus rtA181T/sW172*mutant has a dominant negative secretion defect and alters the typical profile of viral rebound[J]. Hepatology,2008,48(1):88-98. doi: 10.1002/hep.22295.

Analysis of Lamivudine-resistant variants mutation patterns in patients with chronic hepatitis disease

OuyangYabo,LiQing,WeiFeili,ZhangYulin,HuangYanxiang,SongChenzhao,GuoXianghua,XieFang,WangShanshan,ChenDexi

BeijingInstituteofHepatology,YouAnHospitalAffiliatedtoCapitalMedicalUniversity,Beijing100069,ChinaCorrespondingauthor:ChenDexi,Email:dexichen@ccmu.edu.cn

Objective To investigate the genetic characteristics of Lamivudine-resistant mutation patterns and HBV S gene mutants in patients with chronic hepatitis disease of different disease progression. Methods Blood samples of LAM-resistant patients with chronic hepatitis disease were collected. HBV RT gene nucleotide sequences were obtained, and then differences in drug-resistant mutation patterns, drug susceptibility and HBV S gene mutants characteristics between the two groups were analyzed. ResultsForty-seven chronic hepatitis B (CHB) patients and 16 HBV-related liver cirrhosis (LC)/HBV-related hepatocellular carcinoma (HCC) patients were included in this study. M204I single point mutation and L180M+M204I/V were the most common pattern during patients with chronic hepatitis disease (35/63，55.56%). The numbers of resistant to three nucleos(t)ide analogues in LC/HCC group was higher than CHB group’s (62.50% vs 34.04%,P=0.046). In HBV S gene, more immune associated HBsAg-escape mutations were detected in LC/HCC group than that in CHB group (62.50% vs 31.91%,P=0.031). I126T/V and G145A (for LCC/HCC group, 60%), I126S/T and S117T (for CHB group, 46.67%) were showed as the most common form for HBsAg escape mutations in the two groups. The two groups both detected RT mutations concomitantly with stop codon mutations in S gene (rtA181T/sW172* and rtM204I/sW196*). Conclusions Different characteristics in Lamivudine-resistant mutations and associated HBV S gene mutants were found in patients with chronic hepatitis disease of different disease progression, and LC/HCC patients exhibit more multi-drug resistant variants and immune associated HBsAg-escape mutants than CHB patients.

Hepatitis B virus; Chronic hepatitis diseases; Lamivudine; Drug-resistant mutation; S gene mutants

陳德喜，Email: dexichen@ccmu.edu.cn

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.01.006

肝炎病毒，乙型; 慢性肝病; 拉米夫定; 耐藥突變; S基因突變

國(guó)家自然科學(xué)基金(81361120401)；首都衛(wèi)生發(fā)展科研專(zhuān)項(xiàng)(2014-1-1151)；北京市優(yōu)秀人才培養(yǎng)資助青年骨干個(gè)人項(xiàng)目(2015000021469G183)；佑安肝病艾滋病基金資助中青年人才孵育項(xiàng)目(YNKT20160015)

2016-04-11)