聚集性感染甲型H1N1流感病毒的HA1基因特征分析

楊鵬飛 燕清麗 馬雪征 張麗萍 甄維 劉純成 邢亞東 姚海波 何南江 胡孔新

223001 淮安市疾病預(yù)防控制中心(楊鵬飛、燕清麗、劉純成、邢亞東、姚海波、何南江)；100123 中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院衛(wèi)生檢疫研究所(馬雪征、張麗萍、胡孔新)；102206 中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所(甄維)

·論著·

聚集性感染甲型H1N1流感病毒的HA1基因特征分析

楊鵬飛 燕清麗 馬雪征 張麗萍 甄維 劉純成 邢亞東 姚海波 何南江 胡孔新

223001 淮安市疾病預(yù)防控制中心(楊鵬飛、燕清麗、劉純成、邢亞東、姚海波、何南江)；100123 中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院衛(wèi)生檢疫研究所(馬雪征、張麗萍、胡孔新)；102206 中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所(甄維)

楊鵬飛、燕清麗為并列第一作者

目的 了解淮安市某中學(xué)一起引起聚集性感染的流感病毒HA1基因特征。方法 采用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法進(jìn)行病原體的快速檢測(cè)，對(duì)分離的毒株進(jìn)行HA1基因擴(kuò)增、測(cè)序及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹并進(jìn)行HA1基因特征分析。結(jié)果 從流感樣病例中檢測(cè)出11份甲型H1N1流感病毒陽(yáng)性，與疫苗株A/California/07/2009核苷酸及氨基酸同源性分別為97.7%-98.1%及96.6%-97.4%。引起本次疫情的甲型H1N1流感病毒株與2014年分離的毒株聚集在一起。序列分析提示淮安分離株受體結(jié)合位點(diǎn)及糖基化位點(diǎn)的氨基酸序列均未發(fā)生變異，在抗原決定簇Ca1區(qū)均發(fā)現(xiàn)變異，為S220T。結(jié)論 引起本次聚集性疫情的病原體為甲型H1N1流感病毒，盡管淮安株在抗原決定簇Ca1區(qū)存在氨基酸突變，但其抗原性未發(fā)生改變。

Fund programs: National Science and Technology Major Project of China on Infectious Disease Control and Prevention(2013ZX10004101-006)；Huai’an Preventive Medicine Association Project (hayf201516); Huai’an Scientific Technological Special Project (HAS2015019-3).

流感病毒屬于正黏病毒科流感病毒屬，為單負(fù)鏈分節(jié)段具有包膜結(jié)構(gòu)的RNA病毒[1]。根據(jù)流感病毒膜表面糖蛋白血凝素(Hemagglutinin，HA)及神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase，NA)抗原差異性可將甲型流感病毒分為HA18個(gè)亞型，NA分11個(gè)亞型[2,3]。其中HA主要參與機(jī)體免疫，對(duì)于病毒的感染力至關(guān)重要。HA基因易發(fā)生變異，特別是HA1基因區(qū)的高頻率變異是流感病毒發(fā)生遺傳變異的分子基礎(chǔ)，甲型流感病毒的抗原決定簇主要集中在HA1基因區(qū)，HA1基因變異表現(xiàn)為抗原漂移和抗原轉(zhuǎn)換，容易導(dǎo)致甲型流感病毒的暴發(fā)及大流行[4-7]。因此分析甲型流感病毒HA1基因特征有助于了解病毒抗原性變化，從本質(zhì)上揭示流感病毒分子結(jié)構(gòu)的變異與流行關(guān)系, 從而為流感疫情防控提供理論依據(jù)。

2009年甲型H1N1流感病毒首次在美國(guó)和墨西哥患者中檢測(cè)到，隨后通過人傳人途徑導(dǎo)致全球大流行，嚴(yán)重威脅全球的公共衛(wèi)生[8-10]。自2010年10月后，甲型H1N1流感進(jìn)入了大流行的后期。至今，甲型H1N1流感依然在世界各地不斷發(fā)生流行。甲型H1N1流感病毒傳染性強(qiáng)、傳播速度快，主要通過空氣和密切接觸傳播，同其他甲型流感病毒一樣在臨床上表現(xiàn)以發(fā)熱、流涕、咳嗽、頭痛為主[8,9]。

2013年12月，淮安市某中學(xué)學(xué)生發(fā)生以發(fā)熱、咳嗽、咽痛為主要癥狀的流感樣暴發(fā)疫情。經(jīng)現(xiàn)場(chǎng)流行病學(xué)調(diào)查和對(duì)其中部分患者標(biāo)本用分子生物學(xué)、病原學(xué)等方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果證實(shí)這起疫情是由甲型H1N1流感病毒引起的。現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 2013年12月10日-2013年12月13日淮安市某中學(xué)學(xué)生中出現(xiàn)發(fā)熱、體溫>37.5℃，伴有頭痛、頭暈、咽痛、咳嗽癥狀的學(xué)生。

1.2 流行病學(xué)調(diào)查 按照《甲型H1N1流感監(jiān)測(cè)方案 (第二版)》對(duì)疑似或確診病例進(jìn)行流行病學(xué)相關(guān)調(diào)查，同時(shí)無菌采集相應(yīng)病例的咽拭子，低溫運(yùn)送至淮安市疾病預(yù)防控制中心檢驗(yàn)科進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 人咽拭子RNA提取 利用Qiagen公司的病毒核酸提取試劑盒對(duì)上述樣本按照說明書進(jìn)行人咽拭子RNA提取，并于-80℃保存。

1.4 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè) 利用碩世生物公司的A/B雙重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑盒、H3N2、甲型H1N1流感病毒實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑盒對(duì)上述樣本RNA進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 病毒分離 選擇Ct值較小(通常Ct值≤28.0)的咽拭子標(biāo)本接種于長(zhǎng)成單層的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的狗腎細(xì)胞(Madin darby canine kidney, MDCK)，按照《流行性感冒診斷標(biāo)準(zhǔn)及處理原則》及《全國(guó)流感監(jiān)測(cè)技術(shù)指南》中的操作步驟進(jìn)行病毒分離及紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)。

1.6 病毒的HA1基因的擴(kuò)增 利用Qiagen公司的One Step RT-PCR Kit進(jìn)行甲型H1N1流感病毒HA1基因的RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)條件為：42℃逆轉(zhuǎn)錄90 min，95℃ 5 min；95℃變性30 s、52℃復(fù)性30 s、72℃延伸1 min 30 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；72℃ 延伸10 min。純化產(chǎn)物送上海英濰捷基有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.7 序列分析 用DNASTA軟件包中的MegAlign軟件進(jìn)行基因序列排序及同源性分析，用MEGA5.0軟件進(jìn)行序列對(duì)齊、氨基酸分析并將比對(duì)的核苷酸序列轉(zhuǎn)化為BEAST1.75軟件所用的文件，利用Bayes法，以GTR替代模型運(yùn)行20 000 000代進(jìn)行建樹，利用FigTree v1.3.1軟件進(jìn)行圖形分析。用于比較分析的甲型H1N1流感病毒的HA1序列均來自于GenBank。

2 結(jié)果

2.1 流行特征 該校自2013年12月10日至13日被診斷為流感病例的共有11例，罹患率為14.86%。這次暴發(fā)的病例均在一個(gè)班級(jí)，該校其他班級(jí)沒有發(fā)現(xiàn)類似病例。11例病例中男女比例為4.5∶1，年齡段均在14歲-15歲。該校全部學(xué)生一年內(nèi)未接種過流感疫苗。

2.2 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè) 對(duì)采集的18份咽拭子樣本進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)，結(jié)果顯示有11份標(biāo)本檢測(cè)為甲型H1N1流感病毒核酸陽(yáng)性。

2.3 病毒分離培養(yǎng) 接種實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)陽(yáng)性且Ct值≤28.0的樣本7份，進(jìn)行MDCK細(xì)胞培養(yǎng)。盲傳3代后，有5份樣本分離到毒株。

表1 淮安分離的甲型H1N1流感病毒株與疫苗株在抗原決定簇位點(diǎn)中的氨基酸比較

注：加粗的為與淮安株發(fā)生突變的氨基酸

Note: The new mutations of Huai’an strains are shown with the type of boldface

2.4 同源性分析 利用RT-PCR法從5份分離的毒株中擴(kuò)增甲型H1N1流感病毒的HA1基因片段并進(jìn)行測(cè)序。分離的毒株A/Huai’an/ILI12002/2014、A/Huai’an/ILI12005/2014、A/Huai’an/ILI12007/2014、A/Huai’an/ILI12010/2014及A/Huai’an/ILI12022/2014均擴(kuò)增出HA1基因序列。5株間的HA1基因片段的核苷酸同源性為99.2%-99.9%，氨基酸同源性為98.6%-99.9%，與疫苗株A/California/07/2009核苷酸及氨基酸同源性分別為97.7%-98.1%及96.6%-97.4%；與A/Yunnan-Zhaoyang/SWL1917/2014的同源性最高，分別99.2%-99.6%(核苷酸)和98.9%-99.7%(氨基酸)；與A/Anhui-Xiangshan/SWL1894/2014、A/HK/7345/2014 的核苷酸同源性均>98.8%，氨基酸同源性均>98.3%；與A/Zhejiang/TZ11/2013核苷酸同源性﹤98.7%，氨基酸同源性均﹤98.6%；與A/Zhejiang/HuZ1/2012的核苷酸及氨基酸同源性均﹤97.8%。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)淮安市聚集性感染的甲型H1N1流感病毒株與2009-2010年江蘇省境內(nèi)分離的毒株A/Jiangsu/1/2009、A/Nanjing/1/2009、A/Nanjing/1/2010 及A/Taizhou/09/2009的同源性核苷酸及氨基酸同源性均﹤98.4%。

2.5 甲型H1N1流感病毒的系統(tǒng)進(jìn)化分析 由HA1基因片段構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹見圖1，分離的病毒株A/Huai′an/ILI12002/2014、A/Huai′an/ILI12005/2014、A/Huai′an/ILI12007/2014、A/Huai′an/ILI12010/2014及A/Huai′an/ILI12022/2014聚集在一起，在進(jìn)化關(guān)系上與云南分離株A/Yunnan-Zhaoyang/SWL1917/2014和安徽分離株A/Anhui-Xiangshan/SWL1894/2014最近，并與中國(guó)香港毒株A/HK/62/2015、A/HK/7345/2015及浙江分離株A/Zhejiang/TZ11/2013、A/Zhejiang/HuZ1/2012等共同分在一個(gè)進(jìn)化分枝內(nèi)?；窗卜蛛x的毒株與疫苗株A/California/07/2009及A/Hangzhou/04/2009的進(jìn)化關(guān)系最遠(yuǎn)。值得注意的是淮安分離的毒株與江蘇省境內(nèi)分離的毒株A/Jiangsu/1/2009、A/Nanjing/1/2009、A/Nanjing/1/2010 及A/Taizhou/09/2009分在不同的進(jìn)化枝內(nèi)。

2.6 抗原決定簇及受體位點(diǎn)分析 甲型H1N1流感病毒的HA1基因區(qū)上分布著HA的全部4個(gè)抗原決定簇，分別為Sa、Sb、Ca及Cb[4,6,11]。本研究中分離的毒株與疫苗株A/California/07/2009相比A/Huai′an/ILI12007/2014的5個(gè)抗原決定簇中各氨基酸位點(diǎn)均未發(fā)生變異，而A/Huai′an/ILI12002/2014、A/Huai′an/ILI12005/2014、A/Huai′an/ILI12010/2014及A/Huai′an/ILI12022/2014存在變異，主要在抗原決定簇Ca1區(qū)220氨基酸位點(diǎn)由S突變成T，值的注意的是A/Huai′an/ILI12002/2014在抗原決定簇Sb區(qū)202氨基酸位點(diǎn)也存在變異，為S→T(表1)。

進(jìn)化樹中不同的顏色代表不同的clade(進(jìn)化簇)，其中紅色加粗為本研究中分離的病毒，進(jìn)化枝上顯示≥0.50后驗(yàn)概率圖1 淮安分離株的系統(tǒng)進(jìn)化樹Different clades of phylogenetic tree are indicated by different color, and the isolates in this study are shown in red with the type of boldface, with posterior node probabilities(≥0.50) showed above branchFig.1 Phylogenetic tree of Huai′an isolates

甲型H1N1流感病毒受體結(jié)合位點(diǎn)(Receptor binding sites，RBS)位于HA三聚體中每個(gè)單體的頭部，主要由190螺旋(190-198)130環(huán)(135-138)和220環(huán)(221-228)3個(gè)結(jié)構(gòu)的氨基酸殘基組成[11]。經(jīng)氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，與A/California/07/2009相比，均沒有發(fā)現(xiàn)有氨基酸位點(diǎn)變異。

2.7 糖基化位點(diǎn)分析 HA蛋白經(jīng)過進(jìn)一步的加工修飾如空間結(jié)構(gòu)變化、水解、氨基酸位點(diǎn)的糖基化等才能成為結(jié)構(gòu)蛋白，其中氨基酸位點(diǎn)的糖基化對(duì)病毒與受體的結(jié)合能力、病毒與抗體的結(jié)合能力、HA蛋白的裂解等生物學(xué)特性方面均有直接的影響[7,12]。本研究中發(fā)現(xiàn)淮安分離的毒株與疫苗株A/California/07/2009相比，在糖基化位點(diǎn)27(N-N-S-T)、28(N-S-T-D)、40(N-V-T-V)、104(N-G-T-C)、293(N-T-T-C)、304(N-T-S-L)處均未發(fā)生氨基酸突變、缺失或增加。

3 討論

甲型H1N1流感病毒自2009暴發(fā)后，逐漸替代季節(jié)性H1N1流感病毒，成為流感流行季節(jié)中常見的病原體。在流感季節(jié)，特別是一些人群密集的地方，如醫(yī)院、學(xué)校等，往往會(huì)成為流感流行及傳播區(qū)。聚集性流感樣病例的出現(xiàn)往往與當(dāng)年流行的流感類型有一定的提示作用。結(jié)合本次聚集性病例的臨床癥狀、流行病學(xué)調(diào)查、流感流行季節(jié)特點(diǎn)，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法檢測(cè)、分離病毒及HA1基因擴(kuò)增測(cè)序，最終確定引起本次疫情暴發(fā)的病原體為甲型H1N1流感病毒。

甲型流感病毒的抗原漂移主要取決于HA1基因的變異，也直接決定了流感的流行及流行規(guī)模的大小[4,5]。本研究中以引起聚集性感染病例的甲型H1N1流感病毒為研究對(duì)象，選擇HA1基因片段為關(guān)注點(diǎn)，從同源性、系統(tǒng)進(jìn)化、關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)(抗原決定簇位點(diǎn)、受體結(jié)合位點(diǎn)及糖基化位點(diǎn))變異與國(guó)內(nèi)代表株及國(guó)際推薦疫苗株進(jìn)行比對(duì)分析。在本研究中發(fā)現(xiàn)引起淮安市某中學(xué)的聚集性病例的病毒株與A/Yunnan-Zhaoyang/SWL1917/2014、A/Anhui-Xiangshan/SWL1894/2014及A/HK/7345/2014的同源性較高，而與江蘇省分離株A/Jiangsu/1/2009、A/Nanjing/1/2009、A/Nanjing/1/2010 及A/Taizhou/09/2009同源性較低，同時(shí)結(jié)合進(jìn)行發(fā)現(xiàn)淮安分離株與A/Yunnan-Zhaoyang/SWL1917/2014、A/Anhui-Xiangshan/SWL1894/2014及A/HK/7345/2014聚集在一個(gè)進(jìn)化枝內(nèi)，而與江蘇省分離株A/Jiangsu/1/2009、A/Nanjing/1/2009、A/Nanjing/1/2010 及A/Taizhou/09/2009則分屬不同的進(jìn)化單元，這提示甲型H1N1流感病毒HA1基因的演化特征為變異在時(shí)間分布上有明顯差異，而同一時(shí)間段的變異基本相同或相近并且不呈現(xiàn)與地域分布的差異性[13]。

值得注意的是本研究中分離的毒株中，1株(A/Huai′an/ILI12007/2014)在抗原決定簇區(qū)未發(fā)生變異，3株(A/Huai′an/ILI12005/2014、A/Huai′an/ILI12010/2014及A/Huai′an/ILI12022/2014)在抗原決定簇的Ca1區(qū)220氨基酸位點(diǎn)發(fā)生變異，1株(A/Huai′an/ILI12002/2014)在抗原決定簇Ca1區(qū)220氨基酸位點(diǎn)及Sb區(qū)202氨基酸位點(diǎn)同時(shí)發(fā)生變異，這提示流感病毒感染后存在準(zhǔn)種，可能是機(jī)體免疫差異導(dǎo)致流感病毒面臨不同的選擇壓力而進(jìn)行的基因突變[14,15]。通常情況下甲型H1N1流感病毒HA1區(qū)至少有4個(gè)氨基酸序列發(fā)生替代且替換必須涉及2-3個(gè)抗原決定簇位點(diǎn)上，才會(huì)引起抗原漂移，導(dǎo)致流感新種產(chǎn)生[11]。因此淮安分離株的抗原性沒有發(fā)生改變。

本研究中發(fā)現(xiàn)盡管淮安分離的毒株與疫苗株A/California/07/2009的核苷酸同源性﹤98.1%，氨基酸同源性﹤97.4%，但是對(duì)其抗原結(jié)合位點(diǎn)、糖基化位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)與疫苗株相比均未發(fā)生變異；雖然淮安分離株在抗原決定簇位點(diǎn)中有1-2個(gè)基酸位點(diǎn)發(fā)生變異，但不足以引起病毒的抗原性發(fā)生改變，因此國(guó)際推薦的疫苗株有免疫保護(hù)作用。

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Analysis of HA1 gene of influenza A H1N1 pdm09 virus from a clustered human cases

YangPengfei,YanQingli,MaXuezheng,ZhangLiping,ZhenWei,LiuChuncheng,XingYadong,YaoHaibo,HeNanjiang,HuKongxin

Huai’anCenterforDiseaseControlandPrevention,Huai’an223001,China(YangPF,YanQL,LiuCC,XingYD,YaoHB,HeNJ);ChineseAcademyofInspectionandQuarantine,InstituteofHealthQuarantine, 100123Beijing,China(MaXZ,ZhangLP,HuKX);NationalInstituteforViralDiseaseControlandPrevention,ChinaCDC, 102206Beijing,China(ZhenW)YangPengfeiandYanQingliarethefirstauthorswhocontributedequallytothearticleCorrespondingauthor:HuKongxin,Email:hukongxin@caiq.gov.cn;HeNanjiang,Email:hahnj110@163.com;

Objective To understand the viral etiology of a clustered case of human infection outbreak in the middle school of Huai’an city. Methods Nasopharyngeal swab samples from patients were collected and rapidly detected by Real-time RT-PCR and the target virus isolated in cells. Furthermore, HA1 segments of target virus were amplified by RT-PCR and sequenced. The genetic and phylogenetic analysis based on HA1 genes was computed. Results Influenza A(H1N1)pdm09 viral nucleic acid in 11 nasopharyngeal swab samples from patients in the outbreak were positive. Compared to the vaccine strains A/California/07/2009, the Huai’an isolates, nucleotide identity was 97.7%-98.1%, and amino acid identity was 96.6%-97.4%. Phylogenetic analysis of HA1 segment sequences indicated that the Huai’an strains from the outbreak were related closely to the viruses isolated in the year of 2014. Sequence analysis indicated that the Huai’an isolates had no amino acid substitution in the receptor binding sites and glycosylation sites, while in the Ca1 of antigenic determinant of HA1 the Huai’an isolates had an amino acid substitution of S for T at 220. Conclusions The pathogen of the clustered case of human infection was Influenza A(H1N1)pdm09 virus. Though the Huai’an isolates had one animo acid substitution in the Ca1 of antigenic determinant, the antigenicity characteristic remained unchanged.

A clustered case; Influenza A(H1N1)pdm09 virus; HA1 gene; Phylogenetic analysis; Amino acid substitution

胡孔新，Email：hukongxin@caiq.gov.cn；何南江，Email：hahnj110@163.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.01.009

聚集性病例；甲型H1N1流感病毒；HA1基因；進(jìn)化分析；氨基酸變異

國(guó)家傳染病重大科技專項(xiàng)(2013ZX10004-101-006)；淮安市預(yù)防醫(yī)學(xué)會(huì)科研基金(hayf201516);淮安市科技局科研項(xiàng)目(HAS2015019-3)

2016-02-29)