辛伐他汀對脂多糖誘導(dǎo)的小鼠抑郁行為及神經(jīng)炎癥的影響

張海娜，徐 慧，余旭奔，王晨之，許巧巧，戴歌心，胡盧豐，張秀華

(1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，浙江 溫州 325000；2. 溫州市龍灣區(qū)第一人民醫(yī)院藥劑科，浙江 溫州 325024)

辛伐他汀對脂多糖誘導(dǎo)的小鼠抑郁行為及神經(jīng)炎癥的影響

張海娜1，徐 慧1，余旭奔1，王晨之2，許巧巧1，戴歌心1，胡盧豐1，張秀華1

(1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，浙江 溫州 325000；2. 溫州市龍灣區(qū)第一人民醫(yī)院藥劑科，浙江 溫州 325024)

目的 探討辛伐他汀對脂多糖(LPS)誘導(dǎo)小鼠抑郁行為的影響及其機(jī)制。方法 給予ICR小鼠單劑量腹腔注射脂多糖0.5 mg·kg-1建立抑郁小鼠模型。在給予小鼠LPS前每天灌胃給予辛伐他汀，連續(xù)給藥1周。采用強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)、懸尾試驗(yàn)、糖水偏好度實(shí)驗(yàn)檢測小鼠抑郁樣行為；采用Western blot檢測小鼠前額葉皮層NF-κB p65、白介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)蛋白水平。結(jié)果 懸尾試驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常對照組相比，LPS組小鼠不動時間明顯延長，給予辛伐他汀10和20 mg·kg-1能明顯減少抑郁小鼠不動時間；糖水偏好度檢測結(jié)果顯示，與正常對照組相比，LPS組小鼠糖水偏好度明顯降低，而給予辛伐他汀10和20 mg·kg-1能增加抑郁小鼠糖水偏好度；Western blot結(jié)果顯示，LPS組小鼠前額葉皮層NF-κB p65，IL-1β和TNF-α明顯升高，給予辛伐他汀10和20 mg·kg-1能抑制抑郁小鼠炎性蛋白表達(dá)升高。結(jié)論 辛伐他汀能夠改善LPS誘導(dǎo)的小鼠抑郁樣行為和神經(jīng)炎癥。

辛伐他?。灰钟舭Y；炎癥；脂多糖；NF-κB；前額葉皮層

抑郁癥是由多種原因引起的以心境低落為主要癥狀的精神疾病。臨床主要表現(xiàn)為興趣減退、情緒低落、思維障礙、睡眠障礙等[1]。目前臨床上常用的抗抑郁藥物多是基于“單胺神經(jīng)遞質(zhì)假說”研發(fā)，即通過抑制5-HT和去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)體功能，以阻斷單胺類神經(jīng)遞質(zhì)在突觸間隙的重攝取，增加其在突觸間隙的濃度，從而改善抑郁癥狀。然而這些藥物存在效率低，治療效果緩慢，停藥易復(fù)發(fā)等不足。因此，尋找有效的防治抑郁癥的新型抗抑郁藥物是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。神經(jīng)炎癥是抑郁癥至關(guān)重要的病理學(xué)基礎(chǔ)，多種經(jīng)典的抗抑郁治療均能改善神經(jīng)炎癥而發(fā)揮抗抑郁作用。研究發(fā)現(xiàn)抑郁癥病人腦脊液中炎癥因子水平升高[2]。此外，動物實(shí)驗(yàn)研究表明，給予IL-6、IL-1β、TNF-α或者脂多糖(LPS)能誘導(dǎo)動物抑郁樣行為[3]。他汀類藥物是羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑，能減少細(xì)胞內(nèi)膽固醇合成，降低血清膽固醇水平。此外，他汀類藥物對免疫炎癥和氧化應(yīng)激均有不同程度的預(yù)防和治療作用[4]。近年來[5-6]，有研究表明辛伐他汀可通過增加腦內(nèi)神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡和神經(jīng)炎癥水平，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。本文旨在觀察辛伐他汀對LPS誘導(dǎo)的小鼠抑郁行為和神經(jīng)炎癥的影響，為進(jìn)一步解釋抑郁癥的病理生理機(jī)制、發(fā)掘更有效的抗抑郁藥物奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 ICR小鼠，♂，清潔級，體質(zhì)量(24±2)g，共40只，由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物合格證號：SCXK(浙)2010-0044。小鼠自由攝食攝水，飼養(yǎng)溫度為(22±2)℃，濕度55%±5%，8 ∶00～20 ∶00照明環(huán)境。

1.2 試劑與儀器 辛伐他汀(Simvastatin，Sim，購于杭州默沙東有限公司)；脂多糖(LPS，購于Sigma Aldrich公司；NF-κB p65抗體(購于Cell Signaling Technology公司)；IL-1β抗體(購于Santa Cruz Biotechnology公司)；TNF-α抗體(購于Santa Cruz Biotechnology公司)；組蛋白3抗體(Histone 3，購于Bioward Technology公司)；抗兔二抗(購于Bioward Technology公司)；其他試劑為分析純。

酶標(biāo)儀(Thermo scientific)；紫外-可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；臺式高速冷凍離心機(jī)(TGL-16 型，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室開發(fā)有限公司)；Sartorius 分析天平(TP-114型，北京塞多利斯天平有限公司)；凝膠成像系統(tǒng)(Tanon-4200，上海天能科技有限公司)。

2 方法

2.1 動物分組和給藥 將小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，按體質(zhì)量隨機(jī)挑選10只為正常對照組，10只為LPS組，10只為LPS+Sim 10 mg·kg-1組，10只為LPS+Sim 20 mg·kg-1組。辛伐他汀溶于0.5% CMC-Na中。連續(xù)灌胃給予小鼠辛伐他汀1周，期間給予正常對照組和LPS組小鼠等劑量0.5% CMC-Na。在最后一次給藥結(jié)束24 h后，除正常對照組外，其余30只小鼠單次腹腔注射LPS 0.5mg·kg-1，正常對照小鼠單次腹腔注射等劑量生理鹽水。

2.2 行為學(xué)測試 在注射LPS 24 h后，對各組小鼠進(jìn)行行為學(xué)測試。

2.2.1 曠場實(shí)驗(yàn)(open field test，OFT) 測試箱為50cm×50cm×40cm的塑料箱，底部黑色，四壁為白色。設(shè)定ANY-MAZE采集軟件的實(shí)驗(yàn)參數(shù)。采集時間為5 min。采集指標(biāo)選擇穿越格子的總次數(shù)以及移動總距離。實(shí)驗(yàn)開始時將每只小鼠面朝箱壁放入測試箱內(nèi)任一角落，記錄隨后5 min內(nèi)小鼠的自發(fā)活動。每次測試結(jié)束后清除小鼠排泄物，使用70%的酒精擦拭箱底及四壁，待酒精揮干后進(jìn)行下一只鼠測試。

2.2.2 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)測試器為直徑12cm，高33cm的圓柱形有機(jī)玻璃圓筒。往圓筒內(nèi)倒入一定量的溫水，使水深達(dá)到20cm，測試水溫為(25±2)℃。測試時，將小鼠放入有機(jī)玻璃圓筒內(nèi)，使用ANY-MAZE視頻采集系統(tǒng)軟件采集6 min內(nèi)小鼠的不動時間，記錄后4 min內(nèi)小鼠的不動時間。每只小鼠結(jié)束實(shí)驗(yàn)后，放在暖風(fēng)機(jī)旁烘干，并更換圓筒內(nèi)的水。

2.2.3 糖水偏好度測試 將小鼠單籠飼養(yǎng)，提前20 h禁食禁水。分別稱量飲用水及蔗糖水的重量。禁食禁水結(jié)束后，將兩瓶飲用液體同時插入鼠籠上，使小鼠可飲用兩瓶液體，這一過程維持1h。1 h結(jié)束后分別稱量兩瓶液體的重量。計算差值得出小鼠的飲用水的重量、飲用蔗糖水的重量及糖水偏好度(飲用的蔗糖水量/飲用的總液體量)。

2.3 Western blot檢測前額葉皮層NF-κB p65、IL-1β、TNF-α表達(dá)水平 總蛋白提?。禾幩绖游?、取腦，分離腦前額葉皮質(zhì)，稱重。按質(zhì)量(g):體積(mL)為1 ∶9的比例加入RIPA緩沖液(單去污裂解液：PMSF=1 ∶9)，制備組織勻漿，低溫離心(4 ℃，12 000×g，5 min)，收集蛋白樣液，并運(yùn)用BCA法測定蛋白濃度。核蛋白提?。簩⑶邦~葉皮質(zhì)用低滲裂解液進(jìn)行勻漿裂解(1 mL低滲裂解液中含有5 μL磷酸酶抑制劑、10 μL PMSF和1 μL DL-二硫蘇糖醇)，3 000×g離心5 min。沉淀再用低滲裂解液進(jìn)行溶解，5 000×g離心5 min獲得沉降物溶于200 μL裂解液，低溫處置20 min后，4 ℃ 15 000×g離心10 min吸取上清蛋白樣液，行BCA法定量。配制上樣液(1 μL溶液含4 μg蛋白)，100 ℃加熱10 min變性后，-80 ℃保存?zhèn)溆?。制備分離的電泳凝膠，每孔分別加入10 μL的蛋白樣液；按電壓強(qiáng)度為80 V進(jìn)行濃縮，120 V進(jìn)行分離。將所需的目的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，并用脫脂奶粉(TBST溶解)封閉膜上未吸附蛋白區(qū)來減少非特異性結(jié)合的影響；而后用脫脂奶粉稀釋的抗體孵育，即用NF-κB p65抗體(1 ∶1 000稀釋)、IL-1β抗體(1 ∶200稀釋)、TNF-α抗體(1 ∶200稀釋)、β-actin抗體(1 ∶5 000稀釋)、組蛋白H3抗體(1 ∶500稀釋)4 ℃孵育過夜，然后用TBST洗凈，PDVF膜用抗兔二抗(1 ∶5 000稀釋)，室溫下孵育2 h后洗凈，Tanon-4200凝膠成像系統(tǒng)顯色成像。以β-actin或組蛋白H3作為內(nèi)參照，采用Gel-Pro Analyzer 4軟件進(jìn)行分析處理，以每個條帶的積分吸光度值(integrated absorbance，IA) 與其相對應(yīng)的β-actin或組蛋白H3的比值表示蛋白的表達(dá)水平。

3 結(jié)果

3.1 辛伐他汀抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠抑郁樣行為 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)(FST)和懸尾試驗(yàn)(TST)結(jié)果顯示，與正常對照組相比，LPS模型組小鼠不動時間明顯延長(P<0.05)，表明LPS誘導(dǎo)了小鼠抑郁樣行為。提前連續(xù)灌胃給予小鼠辛伐他汀(10或20 mg·kg-1)1周能明顯預(yù)防LPS誘導(dǎo)的小鼠不動時間的延長(P<0.05)，表明辛伐他汀能夠預(yù)防LPS誘導(dǎo)的行為絕望(Fig 1A,B)。此外，我們對各組小鼠進(jìn)行了曠場實(shí)驗(yàn)(OFT)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各組小鼠的穿格次數(shù)和行徑總距離差異無顯著性(P>0.05)，說明LPS和辛伐他汀沒有影響小鼠的自發(fā)活動(Fig 1C)。此外，我們采用糖水偏好度(SPF)評價小鼠抑郁表型的一個重要指標(biāo)——快感缺乏。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LPS明顯降低小鼠糖水偏好度(P<0.05)，而提前連續(xù)灌胃給予辛伐他汀1周能明顯預(yù)防LPS誘導(dǎo)的小鼠糖水偏好度降低(P<0.05)，表明辛伐他汀能夠預(yù)防LPS誘導(dǎo)的快感缺乏(Fig 1D)。

3.2 辛伐他汀抑制抑郁小鼠前額葉皮層NF-κB信號通路激活及炎癥因子表達(dá)水平升高 我們采用Western blot檢測了前額葉皮層(prefrontal cortex,PFC)內(nèi)NF-κB p65的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LPS明顯增加PFC內(nèi)NF-κB p65水平(P<0.05)，而辛伐他汀能夠預(yù)防LPS誘導(dǎo)的NF-κB p65表達(dá)增加(P<0.05)(Fig 2A)。此外，我們采用Western blot檢測了辛伐他汀對LPS誘導(dǎo)的抑郁小鼠PFC內(nèi)炎癥因子水平的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LPS能明顯增加PFC內(nèi)IL-1β、TNF-α水平(P<0.05)。提前連續(xù)給予辛伐他汀(10或20 mg·kg-1)1周能明顯預(yù)防PFC內(nèi)IL-1β、TNF-α水平增加(P<0.05)(Fig 2B,C)。因此，辛伐他汀可能通過調(diào)控NF-κB信號通路進(jìn)而降低腦內(nèi)炎癥因子水平而發(fā)揮抗神經(jīng)炎癥作用。

Male mice were administered with simvastatin (10 or 20 mg·kg-1) for consecutively 7 days. Then mice were injected with LPS (0.5 mg·kg-1). 24 h later, mice were exposed to behavior tests. Shown are the immobility time in the FST (A) and TST (B), total distance and line crossings in the OFT (C) and preference of surcose in the SPF (D).*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsLPS model group.

4 討論

越來越多的研究表明，神經(jīng)炎癥是抑郁癥重要的病理學(xué)基礎(chǔ)，抑郁癥病人常伴有腦內(nèi)炎癥因子水平增加，而給予抗抑郁治療后，腦內(nèi)炎癥因子水平下降[7-8]。本研究采用單次腹腔注射LPS(0.5 mg·kg-1)誘導(dǎo)抑郁小鼠模型，觀察連續(xù)灌胃給予辛伐他汀1周對小鼠抑郁表型以及腦內(nèi)炎癥因子表達(dá)的影響。研究結(jié)果顯示，辛伐他汀能夠抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠抑郁樣行為，產(chǎn)生抗抑郁作用。此外，辛伐他汀能夠抑制NF-κB信號通路進(jìn)而降低腦內(nèi)炎癥因子水平。

大量的研究表明LPS能夠誘導(dǎo)嚙齒類動物抑郁表型，且單次注射LPS常被用來誘導(dǎo)炎癥相關(guān)的小鼠抑郁癥狀[9]。LPS誘導(dǎo)的病理行為包括攝食減少、睡眠障礙、對疼痛的敏感性增加，快感缺乏[10]。

Fig 2 Simvastatin inhibits LPS-induced LPS-activated
NF-κB pathway and increment of pro-inflammatory cytokines

這些癥狀與臨床上抑郁癥患者的表現(xiàn)相似。諸多的文獻(xiàn)報道，單次腹腔注射LPS 0.5 mg·kg-1可在24 h后能夠明顯誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)抑郁表型[7, 11]。本研究中，我們采用單次腹腔注射LPS 0.5 mg·kg-1，結(jié)果顯示LPS能明顯誘導(dǎo)小鼠在TST和FST中不動時間的增加，降低糖水偏好度，表現(xiàn)出抑郁樣行為。

辛伐他汀是脂溶性他汀類藥物，可透過血腦屏障，在臨床上被廣泛用于降低血漿膽固醇水平。有研究表明，辛伐他汀具有良好的神經(jīng)保護(hù)作用，能夠明顯改善腦出血、脊柱損傷、顱腦損傷的預(yù)后和神經(jīng)功能[5-6]。此外，有臨床研究表明，辛伐他汀能夠降低患抑郁癥和焦慮癥的風(fēng)險。然而，關(guān)于辛伐他汀對抑郁癥的影響和機(jī)制還未被完全闡明。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，辛伐他汀能夠明顯改善LPS誘導(dǎo)的小鼠抑郁樣行為，降低小鼠的行為絕望，增加小鼠的糖水偏好。此外，神經(jīng)炎癥被認(rèn)為是抑郁癥的重要病理原因之一，許多臨床前和臨床研究表明，抗抑郁藥物能夠明顯改善抑郁癥患者神經(jīng)炎癥水平[7-8]。因此，辛伐他汀的抗炎特性可能是其發(fā)揮抗抑郁作用的重要原因。我們的研究結(jié)果證明辛伐他汀能夠明顯降低前額葉皮層IL-1β、TNF-α蛋白水平。

NF-κB蛋白家族(RelA/p65、RelB、c-Rel、p50、p52)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中分布廣泛，其在多種神經(jīng)炎癥相關(guān)疾病中表達(dá)增加[12-13]。NF-κB作為早期轉(zhuǎn)錄因子，參與炎癥反應(yīng)各個階段諸多炎癥因子的生成，包括IL-1β、TNF-α、IL-2、IL-6、iNOS、趨化分子、粘附分子等。NF-κB激活后，腦內(nèi)一系列炎癥因子表達(dá)增加。而這些炎癥因子表達(dá)增加造成神經(jīng)細(xì)胞損傷，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞死亡。有研究報道辛伐他汀能夠抑制NF-κB信號通路[7, 14]，我們的研究表明LPS可激活前額葉皮層NF-κB，增加NF-κB表達(dá)，進(jìn)而上調(diào)IL-1β、TNF-α等炎癥因子水平。有趣的是，辛伐他汀能夠抑制NF-κB信號通路，減少前額葉皮層IL-1β、TNF-α水平。

綜上所述，辛伐他汀可能通過調(diào)節(jié)NF-κB信號通路進(jìn)而減少腦內(nèi)IL-1β、TNF-α等炎癥因子水平，發(fā)揮抗抑郁作用。有望被二次開發(fā)為防治炎癥相關(guān)抑郁癥的藥物，進(jìn)而為多環(huán)節(jié)治療抑郁癥提供新思路。

(致謝：本研究在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室完成。感謝徐慧、王晨之、許巧巧、戴歌心對實(shí)驗(yàn)操作的幫助，感謝徐慧、余旭奔、胡盧豐對文章寫作的指導(dǎo)。)

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Effect of simvastatin on lipopolysaccharides induced depressive behaviors and neuroinflammation in mice

ZHANG Hai-na1, XU Hui1, YU Xu-ben1, WANG Chen-zhi2, XU Qiao-qiao1, DAI Ge-xin1, HU Lu-feng1, ZHANG Xiu-hua1

(1.DeptofPharmacy,theFirstAffiliatedHospitalofWenzhouMedicalUniversity,WenzhouZhejiang325000,China; 2.DeptofPharmacy,theFirstPeopleHospitalofLongwan,WenzhouZhejiang325024,China)

Aim To investigate the effects of simvastatin on depressive behaviors and neuroinflammation in lipopolysaccharide (LPS)-induced depression in mice. Methods Male mice were injected with LPS (0.5 mg·kg-1) to induce depressive mice model. Before injecting LPS, mice were administered orally with simvastatin consecutively for 7 days. Forced swimming test (FST), tail suspension test (TST), and sucrose preference test (SPF) were used to detect depression-like behaviors in mice, while Western blot was used to detect the proteins of pro-inflammatory factors nuclear factor-κB p65 subunit (NF-κB p65), interleukin-1β (IL-1β), tumor necrosis factor-α (TNF-α) in the prefrontal cortex of mice. Results The data of FST and TST showed that mice treated with LPS displayed increased immobility time, while depressed mice treated with simvastatin 10, 20 mg·kg-1showed significant reduction in immobility time relative to mice trea-ted with LPS. The data of SPF showed decreased sucrose preference in mice treated with LPS, while simvastatin 10, 20 mg·kg-1treatment suppressed the reduction of sucrose preference in mice treated with LPS. The data of Western blot showed that treatment with LPS significantly increased the levels of NF-κB p65，IL-1β and TNF-α in the prefrontal cortex of mice. However, simvastatin 10, 20 mg·kg-1suppressed the change of these proinflammatory factors. Conclusion Simvastatin improves the depression-like behaviors and neuroinflammatory response in LPS-induced depressive mice.

simvastatin; depression; inflammation; lipopolysaccharides; NF-κB; prefrontal cortex

時間：2017-3-4 11:50

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170304.1150.032.html

2016-10-17，

2016-12-30

浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 (No LY16H30005)

張海娜(1984-)，女，碩士，藥師，研究方向：藥物治療學(xué),Tel：0577-86938687； E-mail：443945147@qq.com; 張秀華(1965-)，女，博士，教授，主任藥師，研究方向：臨床藥學(xué),通訊作者,Tel：0577-88069558； E-mail：wzzhangxiuhua@126.com。

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.03.016

A

1001-1978(2017)03-0373-06

R-332；R322.81；R364.5；R749.42；R972.6; R977.3