小兒腹痛草中獐牙菜苦苷與龍膽苦苷的含量測(cè)定

王麗 陳芬 符德歡 高麗 戚育芳 張曉南

【摘要】目的：建立小兒腹痛草中獐牙菜苦苷與龍膽苦苷的含量測(cè)定方法。方法：色譜柱：Phenomenex luna C18（46mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-水溶液（22∶78）；流速：10mL /min；檢測(cè)波長(zhǎng)239nm；柱溫：30℃。結(jié)果：獐牙菜苦苷的線性范圍00488～4875μg（r= 09998），平均回收率為9957%，RSD=330%；龍膽苦苷的線性范圍00215～2150 μg（r=09995），平均回收率為9780%，RSD=204%。結(jié)論：該方法準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好，可以作為小兒腹痛草中獐牙菜苦苷與龍膽苦苷的含量測(cè)定方法。

【關(guān)鍵詞】小兒腹痛草；獐牙菜苦苷；龍膽苦苷；HPLC；含量測(cè)定

【中圖分類號(hào)】R283【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2017）02-0035-03

Determination of the Content of National Medicine in Swertia patens of Swertiamarin and Gentiopicroside

WANG Li1CHEN Fen2FU Dehuan1*GAO Li1QI Yufang1ZHANG Xiaonan1

1.Yunnan Institute of Materia Medica/ Yunnan Bai Yao Group Innovation and R&D Center Yunnan Province Company/Key Laboratory for TCM and Ethnic Drug of New Drug Creation，Kunming 650111，China；2.Yunnan University of Traditional Chinese Medicine，Kunming 650500，China

Abstract：Objective To estebulish a HPLC method for the determination of Swertia patens. Methods The analysis was carried out on all analytical column C18（46mm×250mm， 5μm） .Mobile phase was methyl alcohol-water（22∶78）. The flow rate was 10 ml·min-1 and the detective wavelength was set at 239nm with column temperature of 30℃.Rusults The linear range was 00488～4875μg（r=09998）and the average recovery was 9957% with the RSD of 330% for swertiamrin. The linear range was 00215～2150μg（r=09995）and the average recovery was 9780%with the RSD of 204% for Gentiopicroside.Conclution This method was accurate and reliable.It can be used for determination of swertiamrin and Gentiopicroside in the Swertia patens.

Keywords：Swertia Patens；Swertiamrin；Gentiopicroside；HPLC；Determination of Content

小兒腹痛草為龍膽科獐牙菜屬斜莖獐牙菜Swertia patens Burk.的全草?！缎氯A本草綱要》以伸展獐牙菜之名載其：“全草，味苦，有解痙、止痛、安眠功能。用于小兒功能性腹痛”[1]，云南彝族用其全草治療消化不良、腹痛、牙痛等，且歷史已久[2] 。小兒腹痛草生于海拔1100～2500m的石灰?guī)r松林下、石灰?guī)r腐殖質(zhì)土壤中及石灰?guī)r山坡草地，分布于云南中部、東北部及四川南部[3]。小兒腹痛草含獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、齊墩果酸等成分，獐牙菜苦苷主要具有解痙、鎮(zhèn)痛作用；龍膽苦苷具有利膽、抗炎、健胃、降壓等作用，具有較好的開發(fā)前景。為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)該藥材，將以其所含獐牙菜苦苷及龍膽苦苷為目標(biāo)成分進(jìn)行定量分析研究。據(jù)查閱文獻(xiàn)，目前還未見用高效液相色譜法測(cè)定小兒腹痛草中獐牙菜苦苷及龍膽苦苷含量的文獻(xiàn)報(bào)道，本文建立了相應(yīng)的測(cè)定方法，為進(jìn)一步深入開發(fā)該藥材提供了一定的理論依據(jù)。

1儀器與材料

11儀器LC-2010AHT日本島津高效液相色譜儀，LCsolution工作站；FA2004N電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）。

12材料獐牙菜苦苷（批號(hào)：0785-200203，純度986%）、龍膽苦苷對(duì)照品（批號(hào)：110770-200510，純度99%）等購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。甲醇（色譜純，MERCK，批號(hào)：122250）；水為超純水。小兒腹痛草經(jīng)云南省藥物研究所高麗、戚育芳正高級(jí)工程師鑒定為斜莖獐牙菜Swertia Patens Burk，藥用部位為全草。

2方法與結(jié)果

21色譜條件色譜柱：Phenomenex luna C18（46mm×250mm，5m）；流動(dòng)相：甲醇-水溶液（22∶78）；流速：10mL /min；檢測(cè)波長(zhǎng)239nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL；理論塔板數(shù)按獐牙菜苦苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3000、按龍膽苦苷峰計(jì)算應(yīng)不低于5000。

22對(duì)照品溶液的制備精密稱取獐牙菜苦苷78 mg、龍膽苦苷215mg分別置于10mL容量瓶中，加甲醇制成078mg/L，0215mg/L的溶液，搖勻，045m的微孔濾膜過濾后作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。

23樣品溶液的制備取小兒腹痛草藥材細(xì)粉02g，精密稱定，加甲醇10mL/每次，超聲2次，每次30min，過濾，合并濾液后定容至25mL，搖勻，即得供試品溶液，045 m微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液用于測(cè)定樣品中龍膽苦苷的含量。

精密移取供試品溶液1mL于10mL容量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，用045m的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液用于測(cè)定樣品中獐牙菜苦苷的含量。

24線性關(guān)系考察依次精密吸取獐牙菜苦苷、龍膽苦苷對(duì)照品儲(chǔ)備液10、20、40、60、80mL，分別置于10mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成系列質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液。在上述色譜條件下，分別進(jìn)樣10μL，記錄色譜圖以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。回歸方程獐牙菜苦苷Y= 774600X – 21622（r=09998），龍膽苦苷Y=1E+06X-77009（r=09995），獐牙菜苦苷與龍膽苦苷分別在004875～4875 μg（r=09998）、00215～215 μg（r=09995）線性關(guān)系良好。

25精密度試驗(yàn)分別取濃度為0195 mg/mL的獐牙菜苦苷，0086 mg/mL的龍膽苦苷對(duì)照品溶液，按選定色譜條件重復(fù)測(cè)定6次，結(jié)果獐牙菜苦苷、龍膽苦苷峰面積的RSD分別為009%、069%。

26重復(fù)性試驗(yàn)準(zhǔn)確稱取同一批小兒腹痛草樣品6份，按“23”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，計(jì)算獐牙菜苦苷和龍膽苦苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD分別為163%、208%。

27穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一批樣品，精密稱定，按“23”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫放置，按“21”項(xiàng)下色譜條件，分別于0、2、4、8、12、24 h測(cè)定峰面積，計(jì)算獐牙菜苦苷和龍膽苦苷峰面積的RSD分別為078%、35%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

28加樣回收率試驗(yàn)

281獐牙菜苦苷的加樣回收率試驗(yàn)稱取已測(cè)定含量的小兒腹痛草藥材02g，3份，每次加甲醇10mL，超聲2次，每次30min，過濾，合并濾液后定容至25mL，搖勻，即得3個(gè)平行供試品溶液。分別移取每份供試品溶液1mL于25mL容量瓶中，每個(gè)供試品溶液3份，共9份，加入獐牙菜苦苷低、中、高3份對(duì)照品溶液，進(jìn)樣分析，計(jì)算平均回收率為9957%，RSD為330%。見表1。

282龍膽苦苷的加樣回收率試驗(yàn)稱取已測(cè)定含量的小兒腹痛草藥材02g，共9份，加入龍膽苦苷低、中、高3份對(duì)照品溶液，按“23”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，計(jì)算平均回收率為9780%，RSD為204%。見表2。

29樣品測(cè)定精密稱取兩個(gè)產(chǎn)地小兒腹痛草藥材粉末02g，每個(gè)產(chǎn)地三份，按“23”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依照上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見圖1～4，表3。

3討論

31提取方法選擇分別選擇了冷浸法（甲醇冷浸過夜），超聲法（甲醇超聲30min），熱浸法（甲醇回流30min）三種提取方法提取樣品，結(jié)果超聲提取時(shí)兩種苦苷的含量高于冷浸法和熱浸法，故選擇超聲提取。

32提取溶劑選擇分別選擇以甲醇、95%乙醇、75%乙醇為溶劑超聲提取樣品，結(jié)果甲醇提取時(shí)提取率較乙醇提取時(shí)高，故選擇甲醇為提取溶劑，這與獐牙菜屬常用提取溶劑相吻合。

33提取時(shí)間考察分別考察了甲醇超聲提取15、30、45min時(shí)對(duì)樣品中兩種苦苷含量的影響，結(jié)果與提取15min相比，提取30min時(shí)兩種苦苷的含量明顯增加，但與提取45min時(shí)相差不大，故選擇30min的提取時(shí)間。

34提取次數(shù)考察在甲醇超聲提取30min的前提下，考察其提取次數(shù)對(duì)兩種苦苷含量的影響，結(jié)果2次與3次相差不大，結(jié)果確定為2次。

通過對(duì)小兒腹痛草中獐牙菜苦苷和龍膽苦苷含量的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)小兒腹痛草中獐牙菜苦苷的含量較高，高達(dá)24175%。根據(jù)已報(bào)道文獻(xiàn)，該屬植物中獐牙菜苦苷含量在0091%～13137%之間不等。

獐牙菜苦苷能明顯抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)，具有顯著的鎮(zhèn)痛和鎮(zhèn)靜作用，而獐牙菜的鎮(zhèn)痛和解痙作用是獐牙菜苦苷治療胃腸道疼痛的藥理基礎(chǔ)[4]。測(cè)定獐牙菜苦苷的含量，在一定程度上揭示小兒腹痛草是一味很好的止痛藥。目前，以小兒腹痛草為主成分的中藥制劑甚少，本文的研究可為以后更好的開發(fā)利用該藥材提供部分理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

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（編輯：陶希睿）