普洱茶中微生物研究進(jìn)展

季愛兵　龔?fù)瘳摗∨砦臅⒙敗≡贰?yán)亮

摘要 普洱茶的發(fā)酵離不開微生物。對(duì)目前普洱茶加工與微生物的關(guān)系，普洱茶發(fā)酵微生物的研究方法和已發(fā)現(xiàn)微生物的種類以及優(yōu)勢(shì)菌種對(duì)普洱茶品質(zhì)的影響進(jìn)行了綜述，指出應(yīng)用高通量測序技術(shù)研究普洱茶從原料鮮葉到普洱茶成品整個(gè)過程中微生物種群變化的必要性，以便更加深入地了解普洱茶中微生物種群的消亡規(guī)律及其對(duì)普洱茶品質(zhì)的影響。

關(guān)鍵詞 普洱茶；發(fā)酵；微生物

中圖分類號(hào) S571.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2016）21-0253-03

普洱茶是以云南大葉種曬青毛茶為原料經(jīng)后發(fā)酵加工而成緊壓茶或散茶，普洱茶又按照其加工工藝將其分為普洱生茶和普洱熟茶。普洱熟茶是曬青毛茶經(jīng)潮水、渥堆，經(jīng)渥堆過程中物質(zhì)變化是由微生物、酶、濕熱、氧化等綜合作用的結(jié)果，因其經(jīng)過人工后發(fā)酵以區(qū)別于普洱生茶。

近年來，隨著對(duì)普洱茶的深入研究，證實(shí)了普洱茶具有抗氧化、抗腫瘤、降血脂和降血糖等功效[1-4]。曬青毛茶不經(jīng)過微生物的發(fā)酵難以形成普洱熟茶所特有的香氣和湯色，一般認(rèn)為微生物或微生物酶的濕熱作用對(duì)普洱茶品質(zhì)的形成起著決定性作用[5-7]。

1 普洱茶加工方式與微生物

普洱茶鮮葉采摘經(jīng)萎凋后，進(jìn)行殺青，再揉捻，后曬干制得曬青毛茶。再由曬青毛茶加工得到普洱茶，其具體制作工藝流程如圖1所示。

將曬青毛茶經(jīng)人工增濕渥堆快速發(fā)酵而制成普洱熟茶[8]。普洱熟茶的加工方式借鑒于安化黑茶，但又不同于安化黑茶。其主要的不同在于普洱茶經(jīng)過曬青毛茶這一步，而安化黑茶從揉捻到后發(fā)酵不經(jīng)過干燥過程，再焙火干燥[9]。

普洱茶與紅茶的發(fā)酵方式相比，普洱茶的發(fā)酵與紅茶有些相似，都有茶多酚經(jīng)氧化生成茶紅素和茶褐素的過程，不同之處在于紅茶發(fā)酵僅需要3～4 h，而普洱茶發(fā)酵所需時(shí)間較長，渥堆時(shí)間至少需要3～4周。因?yàn)榧t茶發(fā)酵時(shí)間短，所以微生物作用較少，主要是生物酶的作用，而普洱茶的發(fā)酵與微生物的作用是分不開的。

普洱原料曬青毛茶就有大量的內(nèi)生菌，曬青毛茶又長期暴露在空氣中，在研究中發(fā)現(xiàn)很多發(fā)酵過程中的微生物都在普洱茶鮮葉中[10]和茶園空氣中[11-12]都有發(fā)現(xiàn)。普洱茶渥堆時(shí)，剛開始溫度由室溫緩慢升高，其潮水量常達(dá)到40%左右，堆溫一般保持在28～55 ℃，非常適合微生物的生長。在發(fā)酵過程中，肉眼可見真菌菌絲。一般認(rèn)為，普洱茶的加工過程離不開微生物的作用，普洱茶的品質(zhì)與微生物的消亡有密切關(guān)系。

2 參與普洱茶發(fā)酵過程的微生物研究方法

2.1 微生物的傳統(tǒng)分離鑒定

研究微生物學(xué)的傳統(tǒng)方法是將茶葉與無菌水按一定比例進(jìn)行均質(zhì)，然再做梯度培養(yǎng)，以此來初步了解渥堆發(fā)酵中普洱茶中微生物數(shù)量，然后對(duì)分離得到的微生物進(jìn)行純培養(yǎng)，以更好地進(jìn)行菌種鑒定或保藏。鑒定方法主要為形態(tài)學(xué)鑒定或根據(jù)生理生化性狀，一般將結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)分類系統(tǒng)中微生物形態(tài)或生理生化性狀進(jìn)行對(duì)比[13]。該方法是研究微生物的主要方法，已成功證實(shí)普洱茶中確實(shí)存在細(xì)菌、酵母、霉菌和放線菌[14-28]。

2.2 微生物自動(dòng)鑒定系統(tǒng)

鑒于微生物傳統(tǒng)鑒定方法的缺陷如工作量大，不利于操作，還受限于鑒定者的專業(yè)知識(shí)和認(rèn)知能力。傳統(tǒng)鑒定方法還常常受培養(yǎng)條件的限制，很多微生物不能在培養(yǎng)基上被分離培養(yǎng)出來，造成了鑒定種群不夠完整，使得人們無法全面了解普洱茶發(fā)酵過程中的微生物種群情況，多數(shù)只是鑒定到了優(yōu)勢(shì)菌種或是在一定的培養(yǎng)條件下表現(xiàn)為優(yōu)勢(shì)的菌群。

近年來微生物快速鑒定儀更多地應(yīng)用到微生物鑒定工作來，該系統(tǒng)是將微生物與底物反應(yīng)的生化類型與已知建立的數(shù)據(jù)庫中的類型比較，使微生物鑒定更加快速、準(zhǔn)確。Mo等[20]利用API ID 32C和API ID 50 CHL微生物快速鑒定系統(tǒng)對(duì)普洱茶發(fā)酵過程中的微生物進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)了多種酵母和細(xì)菌。但由于該系統(tǒng)是根據(jù)現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中所提供的背景資料進(jìn)行微生物鑒定，數(shù)據(jù)庫資料會(huì)影響微生物鑒定的種類及準(zhǔn)確性。

2.3 分子生物學(xué)方法

PACE N R的研究表明，傳統(tǒng)分離方法鑒定的微生物只占環(huán)境微生物總數(shù)的0.1%～10.0%[29]，傳統(tǒng)鑒定方法還常常受培養(yǎng)條件的限制，很多微生物不能在培養(yǎng)基上被分離培養(yǎng)出來，造成了鑒定種群不夠完整，使得人們無法全面了解普洱茶發(fā)酵過程中的種群情況，多數(shù)只是鑒定到了優(yōu)勢(shì)菌種或是在特定的培養(yǎng)中為優(yōu)勢(shì)的菌群。日本學(xué)者M(jìn).Abe等[30]應(yīng)用PCR變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）技術(shù)研究普洱茶發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)，對(duì)不同發(fā)酵階段的普洱茶中微生物種群進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)普洱茶2種優(yōu)勢(shì)種群，同時(shí)在用孟加拉紅培養(yǎng)基，PDA 培養(yǎng)基在 30 ℃ 培養(yǎng)時(shí)也證實(shí)了這一結(jié)論，進(jìn)一步說明了將分子生物學(xué)方法用于普洱茶發(fā)酵過程中微生物學(xué)研究是可行的[30]。

劑量組也對(duì)普洱茶鮮葉中的內(nèi)生菌[10]進(jìn)行了研究，普洱茶渥堆發(fā)酵微生物的研究以及普洱茶區(qū)空氣微生物[11-12]的研究中都分別采用了PCR，Polymerase Chain Reaction（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）分子生物學(xué)的方法，擴(kuò)增細(xì)菌的16SrDNA和真菌的ITS序列測定分析或 PCR-變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）對(duì)參與或有可能參與普洱渥堆發(fā)酵的微生物進(jìn)行了鑒定。

呂昌勇[31]利用宏基因組學(xué)高通量測序研究方法認(rèn)為，細(xì)菌是普洱茶渥堆發(fā)酵過程中的主要菌群，占總微生物的76.26%；真核生物次之，占16.35%。目前應(yīng)用高通量測序在普洱茶渥堆發(fā)酵微生物的研究中很少涉及，趙 明等[32]在利用高通量測序方法研究普洱茶發(fā)酵過程中的微生物，對(duì)參與普洱茶渥堆發(fā)酵微生物種群作了初步的鑒定。Wei Zhang等[33]通過實(shí)時(shí)定量PCR研究認(rèn)為，煙曲霉、微小根毛霉、熱帶假絲酵母菌、鐮刀菌、Thermomyces lanuginosus、Aspergillus niger、blastobotrys adeninivorans、Rasamsonia emersonii、Asper-gillus tubingensis、Rasamsonia cylindrospora、Rasamsonia byss-ochlamydoides等嗜熱菌在普洱茶渥堆發(fā)酵過程中起著重要的作用。

3 普洱茶發(fā)酵微生物研究進(jìn)展

3.1 普洱茶微生物種群

陳宗道等[14]從20世紀(jì)80年代開始研究普洱茶中的微生物以來，已經(jīng)證實(shí)細(xì)菌、酵母、霉菌和放線菌都參與了普洱茶的發(fā)酵。

周紅杰和趙龍飛等[6，18]先后從普洱茶和普洱茶翻堆樣品都分離得到了黑曲霉、酵母菌、米曲霉、根霉、灰綠曲霉和極少的細(xì)菌。方 祥等[23]，M.Abe等[30]以及楊瑞娟等[34-35]從不同年代的普洱茶和渥堆發(fā)酵的普洱茶中分離得到了霉菌（黑曲霉、微小根毛霉、牛根毛霉）、酵母、細(xì)菌（芽孢桿菌，Bacillus coagulans，球菌，無芽孢短桿菌，乳酸菌，植物乳桿菌，類乳酸片球菌和大量嗜熱細(xì)菌）、放線菌。呂昌勇[31]認(rèn)為，普洱茶發(fā)酵初期的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌是變形菌門（Proteobac-teria），隨后厚壁菌門（Firmicutes）上升成為優(yōu)勢(shì)菌，放線菌門（Acti-nobacteria）與Firmicutes在發(fā)酵后期繁成為共同優(yōu)勢(shì)菌。原料的優(yōu)勢(shì)真菌歸類為no-rank-Fungi（65.39%），發(fā)酵過程中，曲霉屬（Aspe-rgillus.sp）真菌一直處于優(yōu)勢(shì)；發(fā)酵中期環(huán)境中的根毛霉屬（Rhizomucor.sp）先升高后降低。

3.2 優(yōu)勢(shì)菌種與普洱茶品質(zhì)的關(guān)系

近年來，關(guān)于普洱茶與微生物關(guān)系研究更多地集中在優(yōu)勢(shì)菌種對(duì)普洱茶品質(zhì)影響的研究，多數(shù)是將分離純化后的微生物再接種到普洱茶中，用來研究普洱茶品質(zhì)改變情況。陳秀燕等[36]將灰綠曲霉和青霉接種到普洱生餅茶和散茶中，能明顯加速普洱茶陳化的作用，且能提高茶湯的香氣。研究表明，灰綠曲霉和青霉接能加速茶葉中纖維和果膠的降解，使普洱茶更加甘滑、醇厚。董文明等[27]認(rèn)為，普洱茶發(fā)酵過程中，黑曲霉產(chǎn)淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶、果膠酶，酵母菌產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶、果膠酶，細(xì)菌只產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶。經(jīng)過這些酶的作用后普洱生茶形成了普洱熟茶甘厚濃醇的品質(zhì)特征。周才碧等[28]利用優(yōu)勢(shì)菌株黑曲霉純種對(duì)普洱茶進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，得到的茶樣香氣濃純、湯色呈黑褐色、滋味較平和，且茶色素發(fā)生明顯變化，表明黑曲霉可以作為發(fā)酵用菌種，適于普洱茶的渥堆發(fā)酵?？笛嗌降萚37]對(duì)普洱茶在普洱茶發(fā)酵過程中添加外源酶和接種酵母，其結(jié)果表明，使用外源酶可增加普洱茶所含水溶性總糖及游離氨基酸的含量，接種酵母可明顯加速普洱茶茶多酚的轉(zhuǎn)化。

4 普洱茶發(fā)酵過程中微生物學(xué)研究存在的不足及展望

4.1 存在的不足

目前對(duì)參與普洱茶發(fā)酵微生物的研究都集中在優(yōu)勢(shì)菌和能培養(yǎng)的微生物上，對(duì)于非培養(yǎng)微生物研究仍然很少涉及，對(duì)于這些微生物在普洱茶渥堆發(fā)酵中的作用研究就更無從談起。對(duì)于普洱茶發(fā)酵微生物對(duì)普洱茶品質(zhì)的轉(zhuǎn)化作用及其機(jī)制研究首先就要解決非培養(yǎng)的微生物鑒定工作。目前關(guān)于普洱茶中微生物發(fā)酵的研究已經(jīng)日趨成熟，宏基因組學(xué)[38]也更多地應(yīng)用于普洱茶發(fā)酵微生物研究中來，多數(shù)都是停留在第一代測序研究上。關(guān)于微生物對(duì)普洱茶品質(zhì)的影響，更多的是在于研究接種某一種或多種優(yōu)勢(shì)微生物或酶對(duì)發(fā)酵品質(zhì)的影響，而忽略了普洱茶發(fā)酵微生物群落對(duì)普洱茶發(fā)酵的影響。

4.2 展望

微生物第二代測序技術(shù)在環(huán)境微生物的研究方面已經(jīng)非常成熟，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于環(huán)境微生物的研究[39-40]，而對(duì)普洱茶發(fā)酵中的微生物的研究結(jié)果卻少之又少。呂昌勇[31]和趙 明等[32]利用高通量測序方法對(duì)普洱茶渥堆發(fā)酵中的微生物進(jìn)行了研究，這一技術(shù)的應(yīng)用為普洱茶中非培養(yǎng)微生物的研究提供了新的可能。高通量測序技術(shù)在環(huán)境微生物的研究中常比PCR-DGGE法檢測靈敏度高 3.8～39.4倍[41]。

利用高通量測序技術(shù)將普洱茶從鮮葉到普洱熟茶成品的微生物組成作出系統(tǒng)研究，并總結(jié)出這些微生物生長和消亡規(guī)律，對(duì)普洱茶鮮葉、干茶、渥堆的每個(gè)時(shí)期和成品的微生物生態(tài)系統(tǒng)作出系統(tǒng)的研究，探明這些微生物在每個(gè)時(shí)期的組成情況如何，以使人們能更好地探明普洱茶在發(fā)酵中是否有有害微生物的參與，為明確這些微生物在發(fā)酵過程的作用提供更為全面而系統(tǒng)的研究對(duì)象，從而有利于更好地了解普洱茶發(fā)酵中微生物的消亡規(guī)律和其對(duì)普洱茶品質(zhì)的影響。

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