乳酸菌的分離及酸奶制備

尹瓊等

【摘 要】從市售酸奶中分離并鑒定了保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）和嗜熱鏈球菌（Streptococus thermophilus）。將分離出的保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌以2：1的比例加入牛奶中42℃進(jìn)行發(fā)酵，用考馬斯亮藍(lán)G250法測定發(fā)酵前后蛋白質(zhì)含量，結(jié)果表明：蛋白質(zhì)含量呈增加趨勢，但仍然小于發(fā)酵前蛋白質(zhì)含量，單菌發(fā)酵的蛋白質(zhì)含量高于雙菌的蛋白質(zhì)含量。

【關(guān)鍵詞】發(fā)酵；蛋白質(zhì)含量測定；保加利亞乳桿菌；嗜熱鏈球菌

0 引言

酸奶一般是指殺菌乳在有益菌（如保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌）的作用下進(jìn)行發(fā)酵所得到的乳制品。發(fā)酵完成之后，乳制品中大量存在有保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌。經(jīng)過巴氏殺菌后再向牛奶中添加有益菌（發(fā)酵劑），經(jīng)發(fā)酵后冷卻灌裝的一種牛奶制品。最常用的酸奶發(fā)酵菌種是保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）和嗜熱乳酸鏈球菌（Streptococus thermophilus）這兩類乳酸菌。牛奶中含有很多乳糖和蛋白質(zhì)，酸奶在發(fā)酵的過程中會將乳糖分解，產(chǎn)生乳酸導(dǎo)致溶液的pH值逐漸下降，使酪蛋白聚集沉降，從而形成半固體狀態(tài)的凝膠體物質(zhì)。本研究將從市售酸奶產(chǎn)品中分離到保加利亞乳桿菌和嗜熱乳酸鏈球菌，研究凝固型酸奶的制作方法，用不同菌種發(fā)酵鮮奶，測定產(chǎn)品中蛋白質(zhì)含量，研究酸奶發(fā)酵的規(guī)律。

材料與方法：

1 儀器與試劑

化學(xué)試劑：檸檬酸二胺，磷酸氫二鉀，MgSO4·7H2O ，MnSO4·4H2O，氯化鈉，乙酸鈉，均為分析純。

生物試劑：牛血清白蛋白，胰蛋白胨，酵母提取物，溴甲酚紫，草酸銨結(jié)晶紫染液，盧戈氏碘液，番紅染液，七葉苷，阿拉伯糖，麥芽糖，棉子糖，纖維二糖，精氨酸。

材料：光明暢優(yōu)酸奶（產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)號 GB 19302，生產(chǎn)許可證號QS 4201 0501 0223），蒙牛純牛奶（GB 19302）。

儀器：超凈工作臺（上海博訊），培養(yǎng)箱（上海新苗），光學(xué)顯微鏡（南京舜宇），高壓滅菌鍋（上海華線核醫(yī)），可見光分光光度計（上海尤尼柯）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的分離純化與鑒定，按照文獻(xiàn)[1-3]中的方法進(jìn)行。

2.2 接種發(fā)酵

稱取5g的奶粉，溶解于100ml蒸餾水中。分裝到100ml的錐形瓶中中，25ml一瓶，95℃滅菌5min。取已經(jīng)分離出的保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的菌液各200ul于5ml的滅過菌的鮮牛奶中，42℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵。

2.3 蛋白質(zhì)含量測定

分別配制濃度為0.01，0.02，0.04，0.06，0.08，0.1mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，用考馬斯亮藍(lán)G-250[4]， 于595nm處測定各管吸光值，繪制工作曲線。然后測定自制酸奶蛋白質(zhì)含量。

3 結(jié)果與討論

3.1 乳酸菌的分離純化與鑒定

市售酸奶的各稀釋度樣品液中，10-3，10-4，10-5稀釋度得到單菌落的效果較好，鏡檢[5]觀察可知，保加利亞乳桿菌菌落較大，米白色，表面不光滑，單個體呈長桿狀或成鏈，兩端鈍圓，為厭氧菌，革蘭氏染色為陽性；嗜熱鏈球菌菌落小，卵圓形，乳白色，呈對或鏈狀排列，革蘭氏染色也為陽性[6]。進(jìn)一步的糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)與生理生化鑒定結(jié)果如表1、表2所示。

3.2 酸奶的發(fā)酵和蛋白質(zhì)含量的測定

采用考馬斯亮藍(lán)法作牛血清白蛋白的工作曲線，測定在595nm處的吸光值，結(jié)果如圖1所示。吸光度y與蛋白質(zhì)濃度x（mg/ml）之間的關(guān)系式為y=6.88874x+0.08864，R=0.97887，用圖1的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算自制酸奶里的蛋白質(zhì)濃度。

將嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌和混合雙菌分別進(jìn)行酸奶發(fā)酵，測定不同時間產(chǎn)品的蛋白質(zhì)含量，結(jié)果如圖2和表3所示：

用分離的菌種進(jìn)行酸奶發(fā)酵的結(jié)果表明，發(fā)酵之后的蛋白質(zhì)含量比發(fā)酵之前高，但是按照理論推斷，牛奶在經(jīng)過乳酸菌發(fā)酵，乳酸菌為了增殖是會分解牛奶中的蛋白質(zhì)的，所以蛋白質(zhì)含量應(yīng)該是下降的。現(xiàn)在推斷有兩個方面的原因。（1）牛奶中的蛋白質(zhì)雖然被分解了，但是進(jìn)入細(xì)胞中是需要一個過程的，這個時候大分子蛋白質(zhì)被分解為小分子蛋白質(zhì)或者多個分子質(zhì)量較大的多肽，而在測定蛋白質(zhì)含量的時候，這些物質(zhì)并未進(jìn)入胞內(nèi)，造成了蛋白質(zhì)含量增高的假象；（2）發(fā)酵終點(diǎn)時，酪蛋白大量沉淀，造成在稀釋樣品時存在懸浮液，而染料與懸浮液的結(jié)合可能會導(dǎo)致蛋白質(zhì)含量的測定結(jié)果偏高。

4 結(jié)論

從市售酸奶中分離純化了保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌，嗜熱鏈球菌菌落小，成乳白色，保加利亞乳桿菌菌落較大，呈米白色，表面不光滑。對分離的菌種進(jìn)行了鑒定，所分離的嗜熱鏈球菌不能在pH9.6、6.5%NaCl條件下生長，不從精氨酸產(chǎn)氨，且麥芽糖、蔗糖、棉子糖發(fā)酵為陰性；所分離的保加利亞乳桿菌不從精氨酸產(chǎn)氨，乳糖發(fā)酵為陽性，而阿拉伯糖、麥芽糖、七葉苷、蔗糖、棉子糖、纖維二糖、核糖發(fā)酵均為陰性。所有這些檢測標(biāo)準(zhǔn)均符合伯杰氏手冊中對這兩種菌的描述，因此判斷分離菌種正確。用雙菌混合發(fā)酵制作酸奶，測定了發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)的含量變化，結(jié)果表明，隨著發(fā)酵時間的遞增，酸奶中的蛋白質(zhì)含量在發(fā)酵的初始階段呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，酸奶發(fā)酵的時間在6h之后蛋白質(zhì)含量持續(xù)下降。混合菌種發(fā)酵對蛋白質(zhì)的消耗明顯高于單菌種。發(fā)酵完成后，蛋白質(zhì)含量比發(fā)酵前要低。

【參考文獻(xiàn)】

[1]徐松斌，李威娜.酸奶中保加利亞乳桿菌的分離和鑒定[J].刊名中國乳品工業(yè)，2003，31（3）：16-17.

[2]王建芳，陳芳.嗜熱鏈球菌適宜培養(yǎng)條件研究[N].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，2008，17（2）：56-58.

[3]佟瀟.酸奶中嗜熱鏈球菌的分離和鑒定[J].中國乳品工業(yè)，2004，32（3）：26-27.

[4]孫士青，王少杰，等.考馬斯亮藍(lán)法快速測定乳品中蛋白質(zhì)含量[J].山東科學(xué)，2011，24（6）：53-55.

[5]沈萍，陳向東.微生物實(shí)驗(yàn)[M].4版.北京：高等教育出版社，2007.

[6]R.E.布坎南，N.E.吉本斯，等.伯杰細(xì)菌鑒定手冊[M].8版.北京：科學(xué)出版社.

[責(zé)任編輯：劉展]