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    1株魚類水霉病原真菌拮抗菌的發(fā)酵條件優(yōu)化

    2017-02-27 11:15梁永增魏冬梅王磊
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2017年1期
    關(guān)鍵詞:發(fā)酵魚病

    梁永增+魏冬梅+王磊

    摘要:采用單因素試驗(yàn)分別探討溫度、pH值、接種量、碳源、氮源、無機(jī)鹽對魚類水霉病原真菌拮抗菌菌株生長的影響,并在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對培養(yǎng)基組分進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果顯示,JL04最適培養(yǎng)溫度為 32 ℃,最適培養(yǎng)pH值為5,接種量對菌體生長的影響不顯著。由正交試驗(yàn)結(jié)果得出最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為胰蛋白胨 6 g/L、葡萄糖6 g/L、酵母提取物3.5 g/L、硝酸銨3.5 g/L、硫酸鎂2 g/L、氯化鈣3 g/L、硫酸錳1 g/L,最佳培養(yǎng)時(shí)間為18 h。在此優(yōu)化條件下,該菌株發(fā)酵培養(yǎng)達(dá)到對數(shù)生長末期的時(shí)間縮短了2 h,能較快進(jìn)入菌體密度最大的時(shí)期,為該菌株的高密度生產(chǎn)提供了一定依據(jù)。

    關(guān)鍵詞:魚??;水霉?。粭l件優(yōu)化;發(fā)酵;拮抗菌

    中圖分類號: S941.43+1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A 文章編號:1002-1302(2017)01-0141-05

    水霉?。⊿aprolegniasis)是嚴(yán)重威脅淡水養(yǎng)殖魚類的世界性病害。水霉病是繼發(fā)性感染疾病,流行很廣泛[1],一年四季均可發(fā)病[2],晚冬、初春季節(jié)尤為嚴(yán)重,對寄主無嚴(yán)格的選擇性,水產(chǎn)動(dòng)物及卵均可被感染,對養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失[3-4]。以生物拮抗為核心的生物防治方法具有綠色、環(huán)保、安全、高效的優(yōu)點(diǎn),近年來水產(chǎn)領(lǐng)域水霉病生物防治研究進(jìn)展較快[5],代表了水霉病防控研究的主流方向。生態(tài)防治在控制病原菌數(shù)量、減少魚類疾病發(fā)生的同時(shí)還能改善養(yǎng)殖環(huán)境、維護(hù)微生態(tài)平衡;因此,水霉病生態(tài)防治拮抗菌的開發(fā)變得尤其重要,拮抗菌的發(fā)酵條件也成為重點(diǎn)研究課題。

    對水霉病的治療現(xiàn)已進(jìn)行了多種嘗試,最初采用孔雀石綠、氯化鈉、臭氧、福爾馬林[6],其中孔雀石綠的治療效果最好,但由于孔雀石綠具有相當(dāng)強(qiáng)的副作用并造成嚴(yán)重的污染,目前已被禁用[7]。在對水霉病各方面的研究中,一種更為有效的解決途徑是利用生物間的相互作用控制水霉。近年來,中外學(xué)者對水霉病生物防治的研究已取得了一定成果,張書俊等[8]、劉莉莉等[9]、趙春暉等[10]、Balcázar等[11]已篩選出對水霉具有較強(qiáng)抑制作用的拮抗菌,并對其拮抗物質(zhì)進(jìn)行了初步的分離鑒定。筆者所在實(shí)驗(yàn)室分離得到1株水霉病原真菌拮抗菌JL04,經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌,以下簡稱“JL04菌株”。以JL04菌株為研究對象,對其發(fā)酵培養(yǎng)基組分及發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化,為今后JL04菌株的大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    1.1.1 菌種 供試菌種為水霉病原菌拮抗菌中具有廣譜抑菌性的菌株JL04,由筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期篩選得到。以LB斜面保存于4 ℃冰箱中。

    1.1.2 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(合成培養(yǎng)基,pH值7.0)用于水霉的培養(yǎng)和保存。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(牛肉膏3.0 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 5.0 g/L)用于細(xì)菌的分離、培養(yǎng)、保存。LB培養(yǎng)基(胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L,pH值7.0)用于細(xì)菌的發(fā)酵培養(yǎng)。

    1.1.3 試劑與儀器 主要試劑見表1,儀器設(shè)備見表2。

    1.2 方法和步驟

    1.2.1 水霉菌株及其拮抗菌株的培養(yǎng) 從長滿水霉菌絲的平板上切取直徑為1 cm的水霉瓊脂塊,接種于水霉培養(yǎng)基平板中央,于25 ℃下恒溫培養(yǎng)。將保存于4 ℃冰箱中的JL04菌株用接種環(huán)挑取菌落,在LB培養(yǎng)基平板上劃線,于37 ℃下恒溫活化培養(yǎng)?;罨蟮腏L04菌株用于發(fā)酵培養(yǎng)。

    1.2.2 JL04菌株拮抗作用廣譜性 采用平板對峙培養(yǎng)法,分別對12株“1.2.1”節(jié)活化完成的水霉菌株進(jìn)行拮抗廣譜性試驗(yàn)。將直徑1 cm的水霉瓊脂塊接種于PDA培養(yǎng)基平板中央,距水霉瓊脂塊一側(cè)25 mm處,接種20 μL發(fā)酵培養(yǎng)的拮抗菌JL04于滅菌濾紙片上,放置0.5 h,于25 ℃下恒溫倒置培養(yǎng)72 h,觀察拮抗效果。

    1.2.3 拮抗菌株JL04生長曲線測定 將JL04菌株接種于100 mL LB液體培養(yǎng)基中,置于37 ℃、120 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)12 h,用作種子液。取25個(gè)250 mL錐形瓶,每瓶裝有100 mL LB液體培養(yǎng)基,以0.5%的接種量將菌懸液接入24個(gè)錐形瓶,以無菌LB液體培養(yǎng)基作為空白對照,均置于 37 ℃、120 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)。分別于0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36 h取樣,采用紫外分光光度計(jì)測定D值(λ=600 nm),每份樣品測定3次取平均值。如果菌懸液濃度過高,適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行測定。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)、D600 nm值為縱坐標(biāo),繪制拮抗菌JL04的生長曲線。

    1.2.4 JL04菌株培養(yǎng)條件的優(yōu)化

    1.2.4.1 JL04菌株溫度條件的優(yōu)化 將拮抗菌JL04種子培養(yǎng)液按照0.5%的接種量接種至100 mL LB發(fā)酵培養(yǎng)基中,均調(diào)pH值至7.0,分別置于27、32、37、42 ℃下以 120 r/min 搖床培養(yǎng)20 h,測定不同溫度下JL04菌株培養(yǎng)液的D600 nm值。每組試驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行。

    1.2.4.2 JL04菌株最適初始pH值的確定 采用1 mol/L HCl或NaOH將LB發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值分別調(diào)至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0,按0.5%的接種量將JL04種子培養(yǎng)液接種至不同pH值的培養(yǎng)液中,置于37 ℃、120 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)20 h,測定不同pH值下JL04培養(yǎng)液的D600 nm值。每組試驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行。

    1.2.4.3 JL04菌株最佳接種量的確定 接種量設(shè)置梯度為1%、2%、3%、4%、5%。將拮抗菌接種于LB發(fā)酵培養(yǎng)液,在上述優(yōu)化后的pH值和溫度下發(fā)酵,制成種子菌液,以不同接種量接種于100 mL液體培養(yǎng)基中,置于37 ℃、120 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)20 h,測定不同接種量發(fā)酵液的D600 nm值。每組試驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行。

    1.2.5 JL04菌株培養(yǎng)基組分優(yōu)化

    1.2.5.1 碳源優(yōu)化 以1%硫酸銨為氮源,選擇葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、果糖、麥芽糖、葡萄糖+胰蛋白胨(質(zhì)量比1 ∶1)、可溶性淀粉+胰蛋白胨(質(zhì)量比1 ∶1)替代LB基礎(chǔ)液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的胰蛋白胨制成培養(yǎng)基,用量均為1%,配成100 mL培養(yǎng)液,調(diào)節(jié)pH值至7.0。將JL04菌株種子培養(yǎng)液按照0.5%的接種量接種至不同碳源的培養(yǎng)液中,置于 37 ℃、120 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)20 h。測定不同碳源JL04培養(yǎng)液的D600 nm值。每組試驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行。

    1.2.5.2 氮源優(yōu)化 以1%蔗糖為碳源,選擇酵母提取物、尿素、牛肉膏、硝酸鉀、硝酸銨、硫酸銨、硝酸鉀+酵母提取物(1 ∶1)、硝酸銨+酵母提取物(1 ∶1)、硫酸銨+酵母提取物(1 ∶1)、硝酸鉀+硫酸銨(1 ∶1)為氮源,分別以0.5%的量配成100 mL培養(yǎng)液,調(diào)節(jié)pH值至7.0。將JL04培養(yǎng)液按照0.5%的接種量接種至不同氮源的培養(yǎng)液中,置于37 ℃、120 r/min 搖床中振蕩培養(yǎng)20 h。測定不同氮源JL04培養(yǎng)液的D600 nm值。每組試驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行。

    1.2.5.3 無機(jī)鹽優(yōu)化 以1%蔗糖為碳源、0.5%酵母浸膏為氮源,選擇氯化鈣、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、硫酸錳、硫酸鎂+氯化鈣+硫酸錳(質(zhì)量比2 ∶3 ∶1)代替LB液體培養(yǎng)基中的氯化鈉制成培養(yǎng)基,分別以1%的量配成100 mL培養(yǎng)液,調(diào)節(jié)pH值至7.0。將JL04種子懸液以0.5%的接種量接種至不同無機(jī)鹽的培養(yǎng)液中,置于37 ℃、120 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)20 h。測定不同無機(jī)鹽JL04培養(yǎng)液的D600 nm值。每組試驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行。

    1.2.6 正交試驗(yàn) 正交試驗(yàn)用以優(yōu)化培養(yǎng)基最佳用量配比。通過單因素試驗(yàn)確定了JL04菌株發(fā)酵培養(yǎng)的最佳碳源、氮源、無機(jī)鹽。采用L9(33)正交表(表3)進(jìn)行試驗(yàn),以0.5%的接種量接菌懸液,每個(gè)培養(yǎng)基組合設(shè)3個(gè)平行,共9組試驗(yàn)。均置于37 ℃、120 r/min搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)20 h,測定發(fā)酵液的D600 nm值,以確定最佳培養(yǎng)基組合。每組試驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行。

    1.2.7 優(yōu)化后生長曲線的測定 將JL04菌株接種于100 mL優(yōu)化后的液體培養(yǎng)基中,置于37 ℃、120 r/min搖床中振蕩過夜培養(yǎng),用作種子懸液。取25個(gè)250 mL錐形瓶,每瓶裝 100 mL 優(yōu)化后的液體培養(yǎng)基,以0.5%的接種量將菌懸液接入24個(gè)錐形瓶,以無菌LB液體培養(yǎng)基作為空白對照,均置于37 ℃、120 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)。分別于0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36 h取樣,采用紫外分光光度計(jì)測定D600 nm值,每份樣品取樣3次并取測量結(jié)果的平均值。如果菌懸液濃度過高,適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行測定。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)、D600 nm值為縱坐標(biāo),繪制JL04菌株在優(yōu)化后培養(yǎng)基中的生長曲線。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 JL04菌株對魚類水霉病病原菌水霉的拮抗效果

    采用平板對峙培養(yǎng)法,由試驗(yàn)結(jié)果(圖1)可知,JL04菌株對12株水霉病原真菌均有拮抗性,JL04菌株是生物防治水霉病的1株理想菌株,因此對具有廣譜抑菌性的JL04菌株進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化尤為重要。

    2.2 生長曲線測定

    拮抗菌JL04菌株在LB液體培養(yǎng)基中的生長曲線見圖2。該菌株在LB培養(yǎng)基中0~4 h處于潛伏期,菌體生長量少;4 h后進(jìn)入對數(shù)生長期,菌體數(shù)量急劇增加;于20 h達(dá)到生長高峰;20~36 h進(jìn)入穩(wěn)定期。試驗(yàn)結(jié)果表明,JL04菌株在液體培養(yǎng)基中的增殖情況符合細(xì)菌的一般生長規(guī)律,經(jīng)歷了延遲期、 對數(shù)期、 穩(wěn)定期、衰亡期。在20 h后JL04菌株生長進(jìn)入了穩(wěn)定期,細(xì)菌增殖不明顯;因此,在LB培養(yǎng)基中發(fā)酵20 h為拮抗菌JL04菌株對數(shù)生長的末期,此時(shí)期內(nèi)收集的菌液適合作為種子懸液。

    2.3 JL04菌株培養(yǎng)條件的優(yōu)化

    2.3.1 JL04菌株溫度條件的選擇 溫度對蛋白質(zhì)及生物酶的活性影響很大,而蛋白質(zhì)和生物酶又是生物代謝過程中的重要物質(zhì),因此溫度對于微生物的生長具有很大影響。培養(yǎng)溫度過低或過高均會造成微生物生長緩慢,甚至導(dǎo)致微生物死亡。由圖3可知,32 ℃條件下JL04菌株長勢最好,與其他溫度相比差異顯著,因此拮抗菌JL04的最適生長溫度應(yīng)在 32 ℃ 左右。試驗(yàn)結(jié)果表明,JL04菌株對溫度比較敏感,在進(jìn)行培養(yǎng)時(shí),32 ℃是比較理想的溫度。

    2.3.2 最適初始pH值的確定 pH值能影響微生物細(xì)胞膜表面電荷及膜的通透性,進(jìn)而影響對物質(zhì)的吸收能力。另外,pH值還能改變酶活性、酶促反應(yīng)的速率及代謝途徑。過堿性或過酸性的環(huán)境會導(dǎo)致微生物生長緩慢,甚至導(dǎo)致細(xì)菌死亡。

    細(xì)菌在生長過程中所產(chǎn)生的胞外物質(zhì)會改變發(fā)酵液的pH值,因此僅能控制其初始pH值。由圖4可知,拮抗菌JL04在初始pH值為5~6時(shí)長勢最好,與其他組相比差異顯著,可見拮抗菌JL04更適合在略偏酸性的環(huán)境中生長。試驗(yàn)結(jié)果表明,培養(yǎng)基的初始pH值為5~6時(shí)更適合JL04菌株的生長。

    2.3.3 接種量的選擇 接種量是與培養(yǎng)基的利用率直接相關(guān)的量。接種量太大則菌種吸收不到足夠多的營養(yǎng),菌數(shù)不高且造成浪費(fèi);接種量太小對營養(yǎng)利用不充分,且細(xì)菌發(fā)酵周期延長,增加染菌概率。分別以不同接種量(1%、2%、3%、4%、5%)接種于培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),以培養(yǎng)得到的拮抗菌株發(fā)酵液的D600 nm值表示菌量。由圖5可知,接種量在3%時(shí)拮抗菌JL04的長勢最好。單因素方差分析表明, 5個(gè)接種量之間沒有顯著性差異,因此接種量對拮抗菌JL04的發(fā)酵生長影響不大。

    2.4 JL04菌株培養(yǎng)基組分優(yōu)化

    2.4.1 碳源優(yōu)化 根據(jù)微生物所能產(chǎn)生的酶系不同,不同微生物可利用不同的碳源。碳源對微生物生長代謝的作用主要是提供細(xì)胞的碳架,提供細(xì)胞生命活動(dòng)所需的能量,提供合成產(chǎn)物的碳架。碳源在制作微生物培養(yǎng)基或細(xì)胞培養(yǎng)基時(shí)具有重要作用,為微生物或細(xì)胞的正常生長、分裂提供物質(zhì)基礎(chǔ)。由圖6可知,以10 g/L胰蛋白胨+葡萄糖(1 ∶1)為碳源的發(fā)酵液D600 nm值最高,與其他單一碳源相比差異顯著;其次為胰蛋白胨+可溶性淀粉(1 ∶1),再次分別為葡萄糖、可溶性淀粉;而果糖、麥芽糖、蔗糖作為碳源時(shí)發(fā)酵液的D600 nm值均低于原培養(yǎng)基,因此選用胰蛋白胨+葡萄糖(1 ∶1)作為碳源。

    2.4.2 氮源優(yōu)化 微生物生長和產(chǎn)物合成需要氮源,氮源主要用于菌體細(xì)胞物質(zhì)(氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸等)和含氮代謝物的合成。氮源是微生物必需的營養(yǎng)物質(zhì)之一,對微生物的生命活動(dòng)意義重大。由圖7可知,JL04菌株在以酵母提取物+硝酸銨(1 ∶1)為氮源的培養(yǎng)基中長勢最好,其次為酵母提取物+硫酸銨(1 ∶1),再次分別為酵母提取物+硝酸鉀(1 ∶1)、酵母提取物、牛肉膏、硝酸鉀+硫酸銨(1 ∶1)、硝酸銨、硫酸銨、硝酸鉀、尿素。該結(jié)果可能的原因是有機(jī)氮源與無機(jī)氮源相比更易被利用,因此有機(jī)氮源對菌體生長更加有利。試驗(yàn)結(jié)果表明,選用酵母提取物+硝酸銨(1 ∶1)作為氮源有利于JL04菌株的發(fā)酵培養(yǎng)。

    2.4.3 無機(jī)鹽種類的優(yōu)化 無機(jī)鹽是細(xì)胞的結(jié)構(gòu)成分,參與并維持生物體的代謝活動(dòng),維持生物體內(nèi)的酸堿平衡及滲透壓。對微生物生長的重要性可見一斑。由圖8可知,以硫酸鎂+氯化鈣+硫酸錳(2 ∶3 ∶1)作為無機(jī)鹽的培養(yǎng)基發(fā)酵液D600 nm值最高;其次分別為氯化鈣、硫酸鎂、硫酸錳;而磷酸氫二鉀作為無機(jī)鹽時(shí),發(fā)酵液的菌量均沒有原培養(yǎng)基效果好,因此選用硫酸鎂+氯化鈣+硫酸錳(2 ∶3 ∶1)作為培養(yǎng)基的無機(jī)鹽。

    2.5 正交試驗(yàn)結(jié)果

    由表4可知,發(fā)酵培養(yǎng)基組分的最佳組合為A3B3C1,即拮抗菌JL04菌株的最佳培養(yǎng)基為6 g/L胰蛋白胨+6 g/L葡萄糖+ 3.5 g/L酵母提取物+3.5 g/L硝酸銨+2 g/L 硫酸鎂+3 g/L氯化鈣+1 g/L硫酸錳。極差分析表明,RA>RB>RC,即各因子對菌體濃度的影響大小依次為葡萄糖+胰蛋白胨>硝酸銨+酵母提取物>硫酸鎂+氯化鈣+硫酸錳。由表5可知,葡萄糖+胰蛋白胨差異顯著,而硫酸鎂+氯化鈣+硫酸鎂在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒有顯著性差異。

    2.6 拮抗菌JL04在發(fā)酵培養(yǎng)基中生長曲線的測定

    由圖9可知,該菌株在優(yōu)化后的培養(yǎng)基中0~4 h處于潛伏期,菌體生長量少;4 h后進(jìn)入對數(shù)生長期,菌體數(shù)量急劇增加;18 h達(dá)到生長高峰;18~36 h進(jìn)入穩(wěn)定期。在優(yōu)化培養(yǎng)基中發(fā)酵18 h為拮抗菌JL04菌株對數(shù)生長的末期,此時(shí)期內(nèi)收集的菌液適合作為菌種液,能得到高濃度的菌體。

    與優(yōu)化前的培養(yǎng)基相比,拮抗菌JL04在優(yōu)化后培養(yǎng)基中的對數(shù)生長末期提前了2 h,縮短了菌體發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)得到最高濃度菌量的培養(yǎng)時(shí)間;而且優(yōu)化前后該菌達(dá)到對數(shù)生長末期時(shí)的菌量不同,優(yōu)化后對數(shù)生長末期菌量明顯增大,這對于大量產(chǎn)生菌體來抑制水霉病原菌具有一定意義。

    3 結(jié)論與討論

    通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn),初步得到了實(shí)驗(yàn)室條件下JL04菌株液體發(fā)酵的培養(yǎng)基優(yōu)化配方,即6g/L胰蛋白胨、6 g/L 葡萄糖、3.5 g/L酵母提取物、3.5 g/L硝酸銨、2 g/L硫酸鎂、3 g/L氯化鈣、1 g/L硫酸錳。發(fā)酵條件的研究結(jié)果表明,菌株JL04對溫度和pH值較為敏感,其生長最適溫度為32 ℃,最適pH值為5~6,接種量對菌體生長的影響不顯著。篩選后的培養(yǎng)基碳源、氮源、無機(jī)鹽明確,且菌株JL04在優(yōu)化后的培養(yǎng)基中達(dá)到對數(shù)生長末期的時(shí)間縮短,能較快進(jìn)入菌體密度最大期,為該菌株的高密度生產(chǎn)提供依據(jù)。

    本試驗(yàn)僅在實(shí)驗(yàn)室條件下對發(fā)酵培養(yǎng)基的組成及其培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化,而拮抗菌制劑生防作用的發(fā)揮與制備工藝、使用方法以及菌劑使用時(shí)的溫度、濕度、pH值等環(huán)境因素密切相關(guān)。在拮抗菌制劑商業(yè)化過程中,一方面要繼續(xù)加強(qiáng)對拮抗菌活性物質(zhì)發(fā)酵工藝、提取與純化方法等的研究,另一方面要加強(qiáng)對拮抗菌制劑發(fā)揮最佳作用條件的研究,需在發(fā)酵罐和水環(huán)境下進(jìn)行驗(yàn)證。本試驗(yàn)對最佳碳源、氮源、無機(jī)鹽離子和正交試驗(yàn)法優(yōu)化培養(yǎng)基配比進(jìn)行了研究,僅以液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的總菌含量作為指標(biāo),并沒有其他與之相對應(yīng)的篩選模型作為依據(jù),因此可能對試驗(yàn)結(jié)果造成一定誤差,但并不影響本研究所得結(jié)果。今后的研究中可設(shè)計(jì)類似試驗(yàn)方案,以進(jìn)一步驗(yàn)證本試驗(yàn)的準(zhǔn)確性和完整性。

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