• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    1株魚類水霉病原真菌拮抗菌的發(fā)酵條件優(yōu)化

    2017-02-27 11:15梁永增魏冬梅王磊
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2017年1期
    關(guān)鍵詞:發(fā)酵魚病

    梁永增+魏冬梅+王磊

    摘要:采用單因素試驗(yàn)分別探討溫度、pH值、接種量、碳源、氮源、無機(jī)鹽對魚類水霉病原真菌拮抗菌菌株生長的影響,并在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對培養(yǎng)基組分進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果顯示,JL04最適培養(yǎng)溫度為 32 ℃,最適培養(yǎng)pH值為5,接種量對菌體生長的影響不顯著。由正交試驗(yàn)結(jié)果得出最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為胰蛋白胨 6 g/L、葡萄糖6 g/L、酵母提取物3.5 g/L、硝酸銨3.5 g/L、硫酸鎂2 g/L、氯化鈣3 g/L、硫酸錳1 g/L,最佳培養(yǎng)時(shí)間為18 h。在此優(yōu)化條件下,該菌株發(fā)酵培養(yǎng)達(dá)到對數(shù)生長末期的時(shí)間縮短了2 h,能較快進(jìn)入菌體密度最大的時(shí)期,為該菌株的高密度生產(chǎn)提供了一定依據(jù)。

    關(guān)鍵詞:魚??;水霉?。粭l件優(yōu)化;發(fā)酵;拮抗菌

    中圖分類號: S941.43+1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A 文章編號:1002-1302(2017)01-0141-05

    水霉?。⊿aprolegniasis)是嚴(yán)重威脅淡水養(yǎng)殖魚類的世界性病害。水霉病是繼發(fā)性感染疾病,流行很廣泛[1],一年四季均可發(fā)病[2],晚冬、初春季節(jié)尤為嚴(yán)重,對寄主無嚴(yán)格的選擇性,水產(chǎn)動(dòng)物及卵均可被感染,對養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失[3-4]。以生物拮抗為核心的生物防治方法具有綠色、環(huán)保、安全、高效的優(yōu)點(diǎn),近年來水產(chǎn)領(lǐng)域水霉病生物防治研究進(jìn)展較快[5],代表了水霉病防控研究的主流方向。生態(tài)防治在控制病原菌數(shù)量、減少魚類疾病發(fā)生的同時(shí)還能改善養(yǎng)殖環(huán)境、維護(hù)微生態(tài)平衡;因此,水霉病生態(tài)防治拮抗菌的開發(fā)變得尤其重要,拮抗菌的發(fā)酵條件也成為重點(diǎn)研究課題。

    對水霉病的治療現(xiàn)已進(jìn)行了多種嘗試,最初采用孔雀石綠、氯化鈉、臭氧、福爾馬林[6],其中孔雀石綠的治療效果最好,但由于孔雀石綠具有相當(dāng)強(qiáng)的副作用并造成嚴(yán)重的污染,目前已被禁用[7]。在對水霉病各方面的研究中,一種更為有效的解決途徑是利用生物間的相互作用控制水霉。近年來,中外學(xué)者對水霉病生物防治的研究已取得了一定成果,張書俊等[8]、劉莉莉等[9]、趙春暉等[10]、Balcázar等[11]已篩選出對水霉具有較強(qiáng)抑制作用的拮抗菌,并對其拮抗物質(zhì)進(jìn)行了初步的分離鑒定。筆者所在實(shí)驗(yàn)室分離得到1株水霉病原真菌拮抗菌JL04,經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌,以下簡稱“JL04菌株”。以JL04菌株為研究對象,對其發(fā)酵培養(yǎng)基組分及發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化,為今后JL04菌株的大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    1.1.1 菌種 供試菌種為水霉病原菌拮抗菌中具有廣譜抑菌性的菌株JL04,由筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期篩選得到。以LB斜面保存于4 ℃冰箱中。

    1.1.2 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(合成培養(yǎng)基,pH值7.0)用于水霉的培養(yǎng)和保存。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(牛肉膏3.0 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 5.0 g/L)用于細(xì)菌的分離、培養(yǎng)、保存。LB培養(yǎng)基(胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L,pH值7.0)用于細(xì)菌的發(fā)酵培養(yǎng)。

    1.1.3 試劑與儀器 主要試劑見表1,儀器設(shè)備見表2。

    1.2 方法和步驟

    1.2.1 水霉菌株及其拮抗菌株的培養(yǎng) 從長滿水霉菌絲的平板上切取直徑為1 cm的水霉瓊脂塊,接種于水霉培養(yǎng)基平板中央,于25 ℃下恒溫培養(yǎng)。將保存于4 ℃冰箱中的JL04菌株用接種環(huán)挑取菌落,在LB培養(yǎng)基平板上劃線,于37 ℃下恒溫活化培養(yǎng)?;罨蟮腏L04菌株用于發(fā)酵培養(yǎng)。

    1.2.2 JL04菌株拮抗作用廣譜性 采用平板對峙培養(yǎng)法,分別對12株“1.2.1”節(jié)活化完成的水霉菌株進(jìn)行拮抗廣譜性試驗(yàn)。將直徑1 cm的水霉瓊脂塊接種于PDA培養(yǎng)基平板中央,距水霉瓊脂塊一側(cè)25 mm處,接種20 μL發(fā)酵培養(yǎng)的拮抗菌JL04于滅菌濾紙片上,放置0.5 h,于25 ℃下恒溫倒置培養(yǎng)72 h,觀察拮抗效果。

    1.2.3 拮抗菌株JL04生長曲線測定 將JL04菌株接種于100 mL LB液體培養(yǎng)基中,置于37 ℃、120 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)12 h,用作種子液。取25個(gè)250 mL錐形瓶,每瓶裝有100 mL LB液體培養(yǎng)基,以0.5%的接種量將菌懸液接入24個(gè)錐形瓶,以無菌LB液體培養(yǎng)基作為空白對照,均置于 37 ℃、120 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)。分別于0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36 h取樣,采用紫外分光光度計(jì)測定D值(λ=600 nm),每份樣品測定3次取平均值。如果菌懸液濃度過高,適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行測定。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)、D600 nm值為縱坐標(biāo),繪制拮抗菌JL04的生長曲線。

    1.2.4 JL04菌株培養(yǎng)條件的優(yōu)化

    1.2.4.1 JL04菌株溫度條件的優(yōu)化 將拮抗菌JL04種子培養(yǎng)液按照0.5%的接種量接種至100 mL LB發(fā)酵培養(yǎng)基中,均調(diào)pH值至7.0,分別置于27、32、37、42 ℃下以 120 r/min 搖床培養(yǎng)20 h,測定不同溫度下JL04菌株培養(yǎng)液的D600 nm值。每組試驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行。

    1.2.4.2 JL04菌株最適初始pH值的確定 采用1 mol/L HCl或NaOH將LB發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值分別調(diào)至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0,按0.5%的接種量將JL04種子培養(yǎng)液接種至不同pH值的培養(yǎng)液中,置于37 ℃、120 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)20 h,測定不同pH值下JL04培養(yǎng)液的D600 nm值。每組試驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行。

    1.2.4.3 JL04菌株最佳接種量的確定 接種量設(shè)置梯度為1%、2%、3%、4%、5%。將拮抗菌接種于LB發(fā)酵培養(yǎng)液,在上述優(yōu)化后的pH值和溫度下發(fā)酵,制成種子菌液,以不同接種量接種于100 mL液體培養(yǎng)基中,置于37 ℃、120 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)20 h,測定不同接種量發(fā)酵液的D600 nm值。每組試驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行。

    1.2.5 JL04菌株培養(yǎng)基組分優(yōu)化

    1.2.5.1 碳源優(yōu)化 以1%硫酸銨為氮源,選擇葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、果糖、麥芽糖、葡萄糖+胰蛋白胨(質(zhì)量比1 ∶1)、可溶性淀粉+胰蛋白胨(質(zhì)量比1 ∶1)替代LB基礎(chǔ)液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的胰蛋白胨制成培養(yǎng)基,用量均為1%,配成100 mL培養(yǎng)液,調(diào)節(jié)pH值至7.0。將JL04菌株種子培養(yǎng)液按照0.5%的接種量接種至不同碳源的培養(yǎng)液中,置于 37 ℃、120 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)20 h。測定不同碳源JL04培養(yǎng)液的D600 nm值。每組試驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行。

    1.2.5.2 氮源優(yōu)化 以1%蔗糖為碳源,選擇酵母提取物、尿素、牛肉膏、硝酸鉀、硝酸銨、硫酸銨、硝酸鉀+酵母提取物(1 ∶1)、硝酸銨+酵母提取物(1 ∶1)、硫酸銨+酵母提取物(1 ∶1)、硝酸鉀+硫酸銨(1 ∶1)為氮源,分別以0.5%的量配成100 mL培養(yǎng)液,調(diào)節(jié)pH值至7.0。將JL04培養(yǎng)液按照0.5%的接種量接種至不同氮源的培養(yǎng)液中,置于37 ℃、120 r/min 搖床中振蕩培養(yǎng)20 h。測定不同氮源JL04培養(yǎng)液的D600 nm值。每組試驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行。

    1.2.5.3 無機(jī)鹽優(yōu)化 以1%蔗糖為碳源、0.5%酵母浸膏為氮源,選擇氯化鈣、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、硫酸錳、硫酸鎂+氯化鈣+硫酸錳(質(zhì)量比2 ∶3 ∶1)代替LB液體培養(yǎng)基中的氯化鈉制成培養(yǎng)基,分別以1%的量配成100 mL培養(yǎng)液,調(diào)節(jié)pH值至7.0。將JL04種子懸液以0.5%的接種量接種至不同無機(jī)鹽的培養(yǎng)液中,置于37 ℃、120 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)20 h。測定不同無機(jī)鹽JL04培養(yǎng)液的D600 nm值。每組試驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行。

    1.2.6 正交試驗(yàn) 正交試驗(yàn)用以優(yōu)化培養(yǎng)基最佳用量配比。通過單因素試驗(yàn)確定了JL04菌株發(fā)酵培養(yǎng)的最佳碳源、氮源、無機(jī)鹽。采用L9(33)正交表(表3)進(jìn)行試驗(yàn),以0.5%的接種量接菌懸液,每個(gè)培養(yǎng)基組合設(shè)3個(gè)平行,共9組試驗(yàn)。均置于37 ℃、120 r/min搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)20 h,測定發(fā)酵液的D600 nm值,以確定最佳培養(yǎng)基組合。每組試驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行。

    1.2.7 優(yōu)化后生長曲線的測定 將JL04菌株接種于100 mL優(yōu)化后的液體培養(yǎng)基中,置于37 ℃、120 r/min搖床中振蕩過夜培養(yǎng),用作種子懸液。取25個(gè)250 mL錐形瓶,每瓶裝 100 mL 優(yōu)化后的液體培養(yǎng)基,以0.5%的接種量將菌懸液接入24個(gè)錐形瓶,以無菌LB液體培養(yǎng)基作為空白對照,均置于37 ℃、120 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)。分別于0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36 h取樣,采用紫外分光光度計(jì)測定D600 nm值,每份樣品取樣3次并取測量結(jié)果的平均值。如果菌懸液濃度過高,適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行測定。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)、D600 nm值為縱坐標(biāo),繪制JL04菌株在優(yōu)化后培養(yǎng)基中的生長曲線。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 JL04菌株對魚類水霉病病原菌水霉的拮抗效果

    采用平板對峙培養(yǎng)法,由試驗(yàn)結(jié)果(圖1)可知,JL04菌株對12株水霉病原真菌均有拮抗性,JL04菌株是生物防治水霉病的1株理想菌株,因此對具有廣譜抑菌性的JL04菌株進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化尤為重要。

    2.2 生長曲線測定

    拮抗菌JL04菌株在LB液體培養(yǎng)基中的生長曲線見圖2。該菌株在LB培養(yǎng)基中0~4 h處于潛伏期,菌體生長量少;4 h后進(jìn)入對數(shù)生長期,菌體數(shù)量急劇增加;于20 h達(dá)到生長高峰;20~36 h進(jìn)入穩(wěn)定期。試驗(yàn)結(jié)果表明,JL04菌株在液體培養(yǎng)基中的增殖情況符合細(xì)菌的一般生長規(guī)律,經(jīng)歷了延遲期、 對數(shù)期、 穩(wěn)定期、衰亡期。在20 h后JL04菌株生長進(jìn)入了穩(wěn)定期,細(xì)菌增殖不明顯;因此,在LB培養(yǎng)基中發(fā)酵20 h為拮抗菌JL04菌株對數(shù)生長的末期,此時(shí)期內(nèi)收集的菌液適合作為種子懸液。

    2.3 JL04菌株培養(yǎng)條件的優(yōu)化

    2.3.1 JL04菌株溫度條件的選擇 溫度對蛋白質(zhì)及生物酶的活性影響很大,而蛋白質(zhì)和生物酶又是生物代謝過程中的重要物質(zhì),因此溫度對于微生物的生長具有很大影響。培養(yǎng)溫度過低或過高均會造成微生物生長緩慢,甚至導(dǎo)致微生物死亡。由圖3可知,32 ℃條件下JL04菌株長勢最好,與其他溫度相比差異顯著,因此拮抗菌JL04的最適生長溫度應(yīng)在 32 ℃ 左右。試驗(yàn)結(jié)果表明,JL04菌株對溫度比較敏感,在進(jìn)行培養(yǎng)時(shí),32 ℃是比較理想的溫度。

    2.3.2 最適初始pH值的確定 pH值能影響微生物細(xì)胞膜表面電荷及膜的通透性,進(jìn)而影響對物質(zhì)的吸收能力。另外,pH值還能改變酶活性、酶促反應(yīng)的速率及代謝途徑。過堿性或過酸性的環(huán)境會導(dǎo)致微生物生長緩慢,甚至導(dǎo)致細(xì)菌死亡。

    細(xì)菌在生長過程中所產(chǎn)生的胞外物質(zhì)會改變發(fā)酵液的pH值,因此僅能控制其初始pH值。由圖4可知,拮抗菌JL04在初始pH值為5~6時(shí)長勢最好,與其他組相比差異顯著,可見拮抗菌JL04更適合在略偏酸性的環(huán)境中生長。試驗(yàn)結(jié)果表明,培養(yǎng)基的初始pH值為5~6時(shí)更適合JL04菌株的生長。

    2.3.3 接種量的選擇 接種量是與培養(yǎng)基的利用率直接相關(guān)的量。接種量太大則菌種吸收不到足夠多的營養(yǎng),菌數(shù)不高且造成浪費(fèi);接種量太小對營養(yǎng)利用不充分,且細(xì)菌發(fā)酵周期延長,增加染菌概率。分別以不同接種量(1%、2%、3%、4%、5%)接種于培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),以培養(yǎng)得到的拮抗菌株發(fā)酵液的D600 nm值表示菌量。由圖5可知,接種量在3%時(shí)拮抗菌JL04的長勢最好。單因素方差分析表明, 5個(gè)接種量之間沒有顯著性差異,因此接種量對拮抗菌JL04的發(fā)酵生長影響不大。

    2.4 JL04菌株培養(yǎng)基組分優(yōu)化

    2.4.1 碳源優(yōu)化 根據(jù)微生物所能產(chǎn)生的酶系不同,不同微生物可利用不同的碳源。碳源對微生物生長代謝的作用主要是提供細(xì)胞的碳架,提供細(xì)胞生命活動(dòng)所需的能量,提供合成產(chǎn)物的碳架。碳源在制作微生物培養(yǎng)基或細(xì)胞培養(yǎng)基時(shí)具有重要作用,為微生物或細(xì)胞的正常生長、分裂提供物質(zhì)基礎(chǔ)。由圖6可知,以10 g/L胰蛋白胨+葡萄糖(1 ∶1)為碳源的發(fā)酵液D600 nm值最高,與其他單一碳源相比差異顯著;其次為胰蛋白胨+可溶性淀粉(1 ∶1),再次分別為葡萄糖、可溶性淀粉;而果糖、麥芽糖、蔗糖作為碳源時(shí)發(fā)酵液的D600 nm值均低于原培養(yǎng)基,因此選用胰蛋白胨+葡萄糖(1 ∶1)作為碳源。

    2.4.2 氮源優(yōu)化 微生物生長和產(chǎn)物合成需要氮源,氮源主要用于菌體細(xì)胞物質(zhì)(氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸等)和含氮代謝物的合成。氮源是微生物必需的營養(yǎng)物質(zhì)之一,對微生物的生命活動(dòng)意義重大。由圖7可知,JL04菌株在以酵母提取物+硝酸銨(1 ∶1)為氮源的培養(yǎng)基中長勢最好,其次為酵母提取物+硫酸銨(1 ∶1),再次分別為酵母提取物+硝酸鉀(1 ∶1)、酵母提取物、牛肉膏、硝酸鉀+硫酸銨(1 ∶1)、硝酸銨、硫酸銨、硝酸鉀、尿素。該結(jié)果可能的原因是有機(jī)氮源與無機(jī)氮源相比更易被利用,因此有機(jī)氮源對菌體生長更加有利。試驗(yàn)結(jié)果表明,選用酵母提取物+硝酸銨(1 ∶1)作為氮源有利于JL04菌株的發(fā)酵培養(yǎng)。

    2.4.3 無機(jī)鹽種類的優(yōu)化 無機(jī)鹽是細(xì)胞的結(jié)構(gòu)成分,參與并維持生物體的代謝活動(dòng),維持生物體內(nèi)的酸堿平衡及滲透壓。對微生物生長的重要性可見一斑。由圖8可知,以硫酸鎂+氯化鈣+硫酸錳(2 ∶3 ∶1)作為無機(jī)鹽的培養(yǎng)基發(fā)酵液D600 nm值最高;其次分別為氯化鈣、硫酸鎂、硫酸錳;而磷酸氫二鉀作為無機(jī)鹽時(shí),發(fā)酵液的菌量均沒有原培養(yǎng)基效果好,因此選用硫酸鎂+氯化鈣+硫酸錳(2 ∶3 ∶1)作為培養(yǎng)基的無機(jī)鹽。

    2.5 正交試驗(yàn)結(jié)果

    由表4可知,發(fā)酵培養(yǎng)基組分的最佳組合為A3B3C1,即拮抗菌JL04菌株的最佳培養(yǎng)基為6 g/L胰蛋白胨+6 g/L葡萄糖+ 3.5 g/L酵母提取物+3.5 g/L硝酸銨+2 g/L 硫酸鎂+3 g/L氯化鈣+1 g/L硫酸錳。極差分析表明,RA>RB>RC,即各因子對菌體濃度的影響大小依次為葡萄糖+胰蛋白胨>硝酸銨+酵母提取物>硫酸鎂+氯化鈣+硫酸錳。由表5可知,葡萄糖+胰蛋白胨差異顯著,而硫酸鎂+氯化鈣+硫酸鎂在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒有顯著性差異。

    2.6 拮抗菌JL04在發(fā)酵培養(yǎng)基中生長曲線的測定

    由圖9可知,該菌株在優(yōu)化后的培養(yǎng)基中0~4 h處于潛伏期,菌體生長量少;4 h后進(jìn)入對數(shù)生長期,菌體數(shù)量急劇增加;18 h達(dá)到生長高峰;18~36 h進(jìn)入穩(wěn)定期。在優(yōu)化培養(yǎng)基中發(fā)酵18 h為拮抗菌JL04菌株對數(shù)生長的末期,此時(shí)期內(nèi)收集的菌液適合作為菌種液,能得到高濃度的菌體。

    與優(yōu)化前的培養(yǎng)基相比,拮抗菌JL04在優(yōu)化后培養(yǎng)基中的對數(shù)生長末期提前了2 h,縮短了菌體發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)得到最高濃度菌量的培養(yǎng)時(shí)間;而且優(yōu)化前后該菌達(dá)到對數(shù)生長末期時(shí)的菌量不同,優(yōu)化后對數(shù)生長末期菌量明顯增大,這對于大量產(chǎn)生菌體來抑制水霉病原菌具有一定意義。

    3 結(jié)論與討論

    通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn),初步得到了實(shí)驗(yàn)室條件下JL04菌株液體發(fā)酵的培養(yǎng)基優(yōu)化配方,即6g/L胰蛋白胨、6 g/L 葡萄糖、3.5 g/L酵母提取物、3.5 g/L硝酸銨、2 g/L硫酸鎂、3 g/L氯化鈣、1 g/L硫酸錳。發(fā)酵條件的研究結(jié)果表明,菌株JL04對溫度和pH值較為敏感,其生長最適溫度為32 ℃,最適pH值為5~6,接種量對菌體生長的影響不顯著。篩選后的培養(yǎng)基碳源、氮源、無機(jī)鹽明確,且菌株JL04在優(yōu)化后的培養(yǎng)基中達(dá)到對數(shù)生長末期的時(shí)間縮短,能較快進(jìn)入菌體密度最大期,為該菌株的高密度生產(chǎn)提供依據(jù)。

    本試驗(yàn)僅在實(shí)驗(yàn)室條件下對發(fā)酵培養(yǎng)基的組成及其培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化,而拮抗菌制劑生防作用的發(fā)揮與制備工藝、使用方法以及菌劑使用時(shí)的溫度、濕度、pH值等環(huán)境因素密切相關(guān)。在拮抗菌制劑商業(yè)化過程中,一方面要繼續(xù)加強(qiáng)對拮抗菌活性物質(zhì)發(fā)酵工藝、提取與純化方法等的研究,另一方面要加強(qiáng)對拮抗菌制劑發(fā)揮最佳作用條件的研究,需在發(fā)酵罐和水環(huán)境下進(jìn)行驗(yàn)證。本試驗(yàn)對最佳碳源、氮源、無機(jī)鹽離子和正交試驗(yàn)法優(yōu)化培養(yǎng)基配比進(jìn)行了研究,僅以液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的總菌含量作為指標(biāo),并沒有其他與之相對應(yīng)的篩選模型作為依據(jù),因此可能對試驗(yàn)結(jié)果造成一定誤差,但并不影響本研究所得結(jié)果。今后的研究中可設(shè)計(jì)類似試驗(yàn)方案,以進(jìn)一步驗(yàn)證本試驗(yàn)的準(zhǔn)確性和完整性。

    參考文獻(xiàn):

    [1]Steciow M M,Paul A,Bala K. Saprolegnia bulbosa sp. nov. isolated from an Argentine stream:taxonomy and comparison with related species[J]. FEMS Microbiology Letters,2007,268(2):225-230.

    [2]董亞倫,梁政遠(yuǎn). 幾種抗霉菌藥物對美洲鰣魚卵水霉病的防治效果比較[J]. 科學(xué)養(yǎng)魚,2015(6):60.

    [3]李 霞,白利丹,焦忠凱. 淡水魚類水霉病防治技術(shù)[J]. 漁業(yè)致富指南,2015(16):49-50.

    [4]孫 琪,胡 鯤,楊先樂. 殼聚糖對草魚人工感染水霉的影響[J]. 水生生物學(xué)報(bào),2014,38(1):180-183.

    [5]趙春暉. 水霉拮抗菌拮抗活性及其機(jī)理研究[D]. 濟(jì)南:山東師范大學(xué),2013.

    [6]陳 力. 白斑狗魚規(guī)?;斯し庇梆B(yǎng)殖技術(shù)研究[D]. 保定:河北農(nóng)業(yè)大學(xué),2013.

    [7]許佳露,張世奇,曹海鵬,等. 生化防腐酸防治水霉病效果總結(jié)[J]. 海洋與漁業(yè),2011(6):60.

    [8]張書俊,楊先樂,李 聃,等. 水霉拮抗菌的篩選及其拮抗作用的初步研究[J]. 水生生物學(xué)報(bào),2008,32(3):302-307.

    [9]劉莉莉,路福平,劉 浩,等. 拮抗水霉菌株的篩選及抑菌蛋白的分離純化[J]. 天津科技大學(xué)學(xué)報(bào),2011,26(4):18-21.

    [10]趙春暉,楊桂文,秦玉廣,等. 水霉拮抗菌拮抗活性物質(zhì)的分離鑒定[J]. 科技信息,2013(7):1-2.

    [11]Balcázar J L,Vendrell D,Blas I D,et al. In vitro competitive adhe-sion and production of antagonistic compounds by lactic acid bacteria against fish pathogens[J]. Veterinary Microbiology,2007,122(3/4):373-380.王 濤,曹麗萍,杜金梁,等. 利用地塞米松構(gòu)建建鯉肝切片脂變模型[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2017,45(1):146-149.

    猜你喜歡
    發(fā)酵魚病
    水產(chǎn)養(yǎng)殖中魚病的防治措施分析
    魚病肆虐,4000萬打水漂!洪湖龍口有水產(chǎn)人在行動(dòng)
    震撼!屈老師第六期漁醫(yī)培訓(xùn)班座無虛席,“一滴水診斷魚病”新增內(nèi)容驚艷全場
    要注重防控2019年春季魚病的再度暴發(fā)
    盡心盡力,不忘初心!這家20年老牌漁藥廠把實(shí)驗(yàn)室“搬到”市場,魚病防控更加精準(zhǔn)有效
    在魚病最易爆發(fā)的季節(jié),針對花、白鰱爆發(fā)性出血、敗血病的防控措施
    脱女人内裤的视频| 国产伦人伦偷精品视频| 午夜视频精品福利| 国产极品精品免费视频能看的| 国产精品电影一区二区三区| 久久热在线av| 欧美中文日本在线观看视频| 欧美丝袜亚洲另类 | 偷拍熟女少妇极品色| 亚洲无线在线观看| 日韩欧美免费精品| 国产黄色小视频在线观看| 91久久精品国产一区二区成人 | 久久久久久国产a免费观看| 亚洲av电影在线进入| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 国产高清激情床上av| 国产精品久久久av美女十八| 在线视频色国产色| 欧美av亚洲av综合av国产av| avwww免费| 丰满人妻一区二区三区视频av | 男人舔女人下体高潮全视频| 亚洲熟妇熟女久久| 久久中文字幕人妻熟女| 五月玫瑰六月丁香| 欧美性猛交黑人性爽| 高清在线国产一区| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 午夜福利18| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 国产欧美日韩精品一区二区| 啦啦啦韩国在线观看视频| 精品国产乱子伦一区二区三区| 久久久国产成人精品二区| 亚洲欧美日韩高清专用| 亚洲精华国产精华精| 亚洲欧美日韩高清专用| 三级毛片av免费| 国产激情久久老熟女| 亚洲在线自拍视频| 色综合婷婷激情| 九色国产91popny在线| 亚洲欧美激情综合另类| 成人无遮挡网站| 观看美女的网站| 美女cb高潮喷水在线观看 | 夜夜躁狠狠躁天天躁| 99久久99久久久精品蜜桃| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 久久久久久九九精品二区国产| 村上凉子中文字幕在线| 亚洲精品在线观看二区| 久久久国产成人免费| 色精品久久人妻99蜜桃| 国产成人aa在线观看| 99久久综合精品五月天人人| 99热这里只有是精品50| 白带黄色成豆腐渣| 国产男靠女视频免费网站| 久久99热这里只有精品18| 日韩三级视频一区二区三区| 天天添夜夜摸| 免费观看人在逋| 99精品久久久久人妻精品| www.精华液| 天堂影院成人在线观看| 成人欧美大片| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 精品电影一区二区在线| 亚洲,欧美精品.| 啪啪无遮挡十八禁网站| 又爽又黄无遮挡网站| 窝窝影院91人妻| 岛国在线观看网站| 国产精品亚洲一级av第二区| 国产三级在线视频| 十八禁网站免费在线| av在线天堂中文字幕| 好男人在线观看高清免费视频| 精品午夜福利视频在线观看一区| 99国产精品99久久久久| 亚洲欧美日韩东京热| 日韩中文字幕欧美一区二区| ponron亚洲| 国产精品久久久av美女十八| 国产一区二区在线av高清观看| 免费看十八禁软件| 欧美另类亚洲清纯唯美| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 日韩人妻高清精品专区| 国产私拍福利视频在线观看| 欧美成人性av电影在线观看| 免费在线观看亚洲国产| 国产精品 欧美亚洲| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 亚洲国产高清在线一区二区三| 成人三级黄色视频| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 国产精品av久久久久免费| 美女cb高潮喷水在线观看 | 久久精品91蜜桃| 久久久久亚洲av毛片大全| 免费高清视频大片| 亚洲九九香蕉| 夜夜爽天天搞| 国产成人aa在线观看| svipshipincom国产片| 中文字幕av在线有码专区| 九九在线视频观看精品| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 午夜成年电影在线免费观看| 男女之事视频高清在线观看| 欧美在线一区亚洲| 毛片女人毛片| 精品久久久久久成人av| 国产精品乱码一区二三区的特点| 欧美日本亚洲视频在线播放| 中文字幕熟女人妻在线| 操出白浆在线播放| 中文字幕最新亚洲高清| 日韩精品中文字幕看吧| 亚洲乱码一区二区免费版| 久久久久久国产a免费观看| 一本久久中文字幕| 最新在线观看一区二区三区| 国产成人啪精品午夜网站| 一区二区三区国产精品乱码| 欧美一级毛片孕妇| 免费看美女性在线毛片视频| 日本 欧美在线| 青草久久国产| 精品久久久久久久久久免费视频| av福利片在线观看| 少妇人妻一区二区三区视频| 此物有八面人人有两片| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 亚洲国产欧美一区二区综合| 久久久国产成人精品二区| 中文资源天堂在线| 全区人妻精品视频| 午夜免费观看网址| 偷拍熟女少妇极品色| 精品一区二区三区视频在线 | e午夜精品久久久久久久| 成熟少妇高潮喷水视频| 久久精品国产综合久久久| www日本在线高清视频| 搡老岳熟女国产| 91在线精品国自产拍蜜月 | 国产成人av激情在线播放| 亚洲av五月六月丁香网| 亚洲成人精品中文字幕电影| 国产黄色小视频在线观看| 亚洲成a人片在线一区二区| 看免费av毛片| 国产黄片美女视频| 最好的美女福利视频网| 香蕉av资源在线| 色综合站精品国产| 偷拍熟女少妇极品色| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 天堂网av新在线| 99视频精品全部免费 在线 | 在线观看美女被高潮喷水网站 | 欧美日韩国产亚洲二区| 老司机深夜福利视频在线观看| 成年女人看的毛片在线观看| 神马国产精品三级电影在线观看| 婷婷六月久久综合丁香| 国产三级中文精品| 国产综合懂色| 老司机午夜十八禁免费视频| 成人特级av手机在线观看| 51午夜福利影视在线观看| 91在线精品国自产拍蜜月 | 宅男免费午夜| 18禁美女被吸乳视频| 午夜精品久久久久久毛片777| 国产高清videossex| 搞女人的毛片| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 亚洲美女黄片视频| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 长腿黑丝高跟| 中亚洲国语对白在线视频| 最新中文字幕久久久久 | 亚洲七黄色美女视频| 国产成人影院久久av| 午夜福利视频1000在线观看| 亚洲熟妇熟女久久| 99国产精品一区二区蜜桃av| 熟女人妻精品中文字幕| 99国产精品99久久久久| 亚洲真实伦在线观看| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 国产69精品久久久久777片 | 亚洲av免费在线观看| 最近最新免费中文字幕在线| 亚洲精品456在线播放app | 无限看片的www在线观看| 999久久久国产精品视频| 精品久久久久久久毛片微露脸| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 国产激情偷乱视频一区二区| 大型黄色视频在线免费观看| 岛国视频午夜一区免费看| 一个人免费在线观看电影 | 很黄的视频免费| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 叶爱在线成人免费视频播放| 国产日本99.免费观看| av黄色大香蕉| 黄色日韩在线| 国产精品一及| 日韩欧美免费精品| 可以在线观看的亚洲视频| 可以在线观看毛片的网站| 精品电影一区二区在线| 亚洲av日韩精品久久久久久密| www.www免费av| 国产精品九九99| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 欧美又色又爽又黄视频| 深夜精品福利| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 少妇的丰满在线观看| 久久国产精品人妻蜜桃| 久久久久久久久中文| 亚洲国产精品久久男人天堂| 日韩精品青青久久久久久| 久久精品国产清高在天天线| 黄色视频,在线免费观看| 丝袜人妻中文字幕| 久久久色成人| 久久久国产成人精品二区| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 久久国产精品影院| 免费在线观看影片大全网站| 一区福利在线观看| 欧美黄色片欧美黄色片| 69av精品久久久久久| 成人性生交大片免费视频hd| 欧美黄色淫秽网站| 国产激情偷乱视频一区二区| 精品不卡国产一区二区三区| 美女午夜性视频免费| 免费观看人在逋| 成年免费大片在线观看| 国产成+人综合+亚洲专区| 免费看a级黄色片| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 欧美黄色淫秽网站| 搡老熟女国产l中国老女人| 午夜福利高清视频| 亚洲无线在线观看| 91麻豆av在线| 成人国产综合亚洲| 国产精品久久久久久精品电影| 色精品久久人妻99蜜桃| 久久久久精品国产欧美久久久| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 88av欧美| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 国产成人精品久久二区二区免费| 精品电影一区二区在线| 我要搜黄色片| 亚洲国产中文字幕在线视频| 小说图片视频综合网站| 88av欧美| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 欧美日本视频| 91av网一区二区| 狠狠狠狠99中文字幕| 午夜成年电影在线免费观看| 身体一侧抽搐| 九九热线精品视视频播放| 两人在一起打扑克的视频| 婷婷精品国产亚洲av| 国产蜜桃级精品一区二区三区| tocl精华| 亚洲午夜理论影院| 久久久久久九九精品二区国产| 欧美一区二区国产精品久久精品| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 日韩国内少妇激情av| 欧美午夜高清在线| av女优亚洲男人天堂 | 精华霜和精华液先用哪个| 色精品久久人妻99蜜桃| 精品久久久久久久久久免费视频| 日本免费一区二区三区高清不卡| 免费看美女性在线毛片视频| 欧美中文综合在线视频| 日韩中文字幕欧美一区二区| 久久久国产精品麻豆| 国产久久久一区二区三区| 亚洲中文字幕日韩| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 最新在线观看一区二区三区| 国产精品亚洲一级av第二区| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 特大巨黑吊av在线直播| 国产精品1区2区在线观看.| 身体一侧抽搐| 亚洲av成人av| 最近在线观看免费完整版| 国产成人精品久久二区二区免费| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 婷婷六月久久综合丁香| 欧美乱妇无乱码| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 亚洲一区二区三区不卡视频| 少妇人妻一区二区三区视频| 日韩av在线大香蕉| 欧美大码av| 黄色成人免费大全| 精品电影一区二区在线| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 日本免费a在线| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 成人特级黄色片久久久久久久| 在线免费观看的www视频| 麻豆成人午夜福利视频| 亚洲精华国产精华精| 免费大片18禁| 美女 人体艺术 gogo| 中文资源天堂在线| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 午夜免费激情av| 可以在线观看毛片的网站| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 禁无遮挡网站| 国产成人精品久久二区二区91| 免费在线观看成人毛片| 99久久99久久久精品蜜桃| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 国产熟女xx| 色尼玛亚洲综合影院| 亚洲av五月六月丁香网| 久久精品人妻少妇| 12—13女人毛片做爰片一| 久久99热这里只有精品18| 久9热在线精品视频| 99久久综合精品五月天人人| 国产乱人视频| 性色avwww在线观看| 一本综合久久免费| 五月玫瑰六月丁香| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 国产午夜福利久久久久久| 国产黄色小视频在线观看| 久久国产精品人妻蜜桃| 国产精品久久久av美女十八| 麻豆成人午夜福利视频| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 亚洲午夜理论影院| 99久久精品国产亚洲精品| 一级毛片女人18水好多| 两个人的视频大全免费| 亚洲精品美女久久av网站| 成人性生交大片免费视频hd| 高清毛片免费观看视频网站| 久久国产精品人妻蜜桃| 日韩免费av在线播放| АⅤ资源中文在线天堂| 欧美丝袜亚洲另类 | 嫩草影视91久久| 国产私拍福利视频在线观看| 99在线视频只有这里精品首页| 99国产精品99久久久久| 精品国产三级普通话版| 一本久久中文字幕| 久久午夜综合久久蜜桃| 人妻夜夜爽99麻豆av| 午夜福利免费观看在线| 欧美国产日韩亚洲一区| 国产99白浆流出| 手机成人av网站| 精品福利观看| 日韩欧美国产一区二区入口| 成年版毛片免费区| 欧美又色又爽又黄视频| 一二三四在线观看免费中文在| 国产精品av视频在线免费观看| 午夜精品久久久久久毛片777| 看片在线看免费视频| 国产三级在线视频| 偷拍熟女少妇极品色| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 亚洲电影在线观看av| 变态另类丝袜制服| 亚洲国产中文字幕在线视频| 日本成人三级电影网站| 欧美黑人欧美精品刺激| 欧美中文综合在线视频| 欧美又色又爽又黄视频| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 成人精品一区二区免费| 美女免费视频网站| cao死你这个sao货| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 亚洲乱码一区二区免费版| 亚洲五月婷婷丁香| 国产伦一二天堂av在线观看| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 日本一二三区视频观看| 两个人看的免费小视频| 成人国产一区最新在线观看| 18禁国产床啪视频网站| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 一进一出好大好爽视频| 国产美女午夜福利| 国产精品99久久99久久久不卡| 长腿黑丝高跟| 午夜成年电影在线免费观看| www.自偷自拍.com| 男插女下体视频免费在线播放| 欧美日本视频| 99精品欧美一区二区三区四区| 好男人在线观看高清免费视频| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 亚洲,欧美精品.| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 日本熟妇午夜| 天堂动漫精品| 成人三级做爰电影| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 午夜影院日韩av| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| netflix在线观看网站| 老汉色av国产亚洲站长工具| 国产人伦9x9x在线观看| 亚洲欧美日韩无卡精品| 久久精品人妻少妇| 国产伦在线观看视频一区| 久久天堂一区二区三区四区| 久久草成人影院| av天堂在线播放| 午夜精品久久久久久毛片777| 国产精品亚洲一级av第二区| 一个人免费在线观看电影 | 成年版毛片免费区| 一个人看的www免费观看视频| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 美女扒开内裤让男人捅视频| 波多野结衣高清无吗| 久久性视频一级片| 岛国在线观看网站| 嫩草影院精品99| 看黄色毛片网站| 亚洲精品粉嫩美女一区| 最近最新中文字幕大全电影3| 国内揄拍国产精品人妻在线| 色视频www国产| 神马国产精品三级电影在线观看| 又大又爽又粗| 黄色日韩在线| 91久久精品国产一区二区成人 | 两人在一起打扑克的视频| 日本免费一区二区三区高清不卡| 青草久久国产| 全区人妻精品视频| 狠狠狠狠99中文字幕| 成人精品一区二区免费| 五月玫瑰六月丁香| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 亚洲成人中文字幕在线播放| 成年女人毛片免费观看观看9| 久久久久亚洲av毛片大全| 三级毛片av免费| 成人av一区二区三区在线看| 最近在线观看免费完整版| 999精品在线视频| 欧美成狂野欧美在线观看| 亚洲激情在线av| 法律面前人人平等表现在哪些方面| avwww免费| 色综合欧美亚洲国产小说| 亚洲乱码一区二区免费版| 免费在线观看成人毛片| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 999久久久精品免费观看国产| 成人无遮挡网站| 在线观看免费视频日本深夜| 久久精品91无色码中文字幕| 亚洲专区国产一区二区| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 午夜福利免费观看在线| 丁香六月欧美| 1024香蕉在线观看| 日本在线视频免费播放| 午夜福利欧美成人| 狂野欧美激情性xxxx| 日韩欧美精品v在线| 欧美色欧美亚洲另类二区| 国产爱豆传媒在线观看| 两性夫妻黄色片| 可以在线观看毛片的网站| 美女被艹到高潮喷水动态| 美女黄网站色视频| 成人18禁在线播放| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 欧美一级毛片孕妇| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 日韩欧美在线二视频| 午夜免费观看网址| 午夜精品一区二区三区免费看| 波多野结衣高清作品| 国产激情偷乱视频一区二区| 精品久久久久久久毛片微露脸| 精品国内亚洲2022精品成人| 国产一区二区在线av高清观看| 99热精品在线国产| 五月玫瑰六月丁香| 色尼玛亚洲综合影院| 99久久精品热视频| 久久国产精品人妻蜜桃| 99热只有精品国产| 成人欧美大片| 久久久久久国产a免费观看| 国产成人精品久久二区二区免费| 久久中文字幕人妻熟女| 一个人看视频在线观看www免费 | 午夜影院日韩av| 日本黄色片子视频| 18禁观看日本| 欧美乱妇无乱码| 免费观看精品视频网站| 可以在线观看毛片的网站| 国产成年人精品一区二区| 久久人妻av系列| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 久久久久久久久久黄片| 精品国产乱子伦一区二区三区| 老汉色av国产亚洲站长工具| 精品国内亚洲2022精品成人| 丰满人妻一区二区三区视频av | 最近最新中文字幕大全免费视频| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 欧美zozozo另类| 国产精品国产高清国产av| 最近最新中文字幕大全免费视频| 成人国产综合亚洲| 啪啪无遮挡十八禁网站| 亚洲av五月六月丁香网| 欧美激情在线99| 亚洲国产精品合色在线| 极品教师在线免费播放| 真实男女啪啪啪动态图| 精品日产1卡2卡| 村上凉子中文字幕在线| 国产单亲对白刺激| 啦啦啦免费观看视频1| 亚洲av电影不卡..在线观看| 黄色女人牲交| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 久久99热这里只有精品18| 最近最新中文字幕大全电影3| 亚洲,欧美精品.| 国产在线精品亚洲第一网站| 婷婷六月久久综合丁香| 午夜成年电影在线免费观看| 日韩中文字幕欧美一区二区| 日韩免费av在线播放| 国产亚洲精品久久久com| 国产毛片a区久久久久| 色播亚洲综合网| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 国产亚洲av嫩草精品影院| 日本黄大片高清| 精品熟女少妇八av免费久了| 日本免费一区二区三区高清不卡| 99在线视频只有这里精品首页| 亚洲 国产 在线| x7x7x7水蜜桃| 亚洲乱码一区二区免费版| 国产成人av教育| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 亚洲专区中文字幕在线| 国产亚洲欧美98| 色噜噜av男人的天堂激情| 少妇的丰满在线观看| 最好的美女福利视频网| 欧美一级毛片孕妇| 男女下面进入的视频免费午夜| 99久久无色码亚洲精品果冻| 精品无人区乱码1区二区| 日本五十路高清| 又爽又黄无遮挡网站| 男女下面进入的视频免费午夜| 成人18禁在线播放| 国产欧美日韩精品亚洲av| 国产伦精品一区二区三区四那| 国产精品爽爽va在线观看网站| 不卡av一区二区三区| 亚洲五月天丁香| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 中国美女看黄片| 人妻夜夜爽99麻豆av| 很黄的视频免费| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 99热只有精品国产| 麻豆一二三区av精品| 国产av不卡久久| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 国产精品野战在线观看| 午夜亚洲福利在线播放|