人參皂苷Rh2通過激活p38誘導K562細胞自噬凋亡的實驗研究

劉小霞+夏菁++唐家鋒+周明華+陳地龍+劉澤洪

[摘要]為了研究人參皂苷Rh2對人白血病細胞K562的凋亡作用，并從自噬角度來探討其機制。實驗采用CCK8方法檢測人參皂苷單體Rh2對人白血病K562細胞增殖抑制作用；流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡；Hoechest染色觀察細胞核染色質(zhì)的形態(tài)；吖啶橙和MDC染色觀察Rh2對細胞自噬的影響；Western blot和RTPCR檢測Rh2對白血病細胞自噬重要基因的表達的影響；運用自噬抑制劑（3MA）研究自噬對細胞增殖和凋亡的影響。CCK8顯示人參皂苷Rh2在低濃度時能有效抑制白血病細胞增殖，且其抑制作用具有濃度和時間依賴性；FCM和Hoechest顯示Rh2能增加細胞的凋亡和染色質(zhì)呈凋亡形態(tài)改變；吖啶橙和MDC染色發(fā)現(xiàn)Rh2組細胞的綠色熒光增強，并出現(xiàn)大量酸性自噬小泡；Western blot和RTPCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)Rh2能上調(diào)Beclin1，LC3A，LC3B，激活型Caspase3和pp38的表達；運用細胞自噬劑（3MA）會削弱Rh2對K562的增殖抑制和促凋亡作用。人參皂苷Rh2可能通過激活磷酸化的p38，誘導細胞自噬途徑，從而抑制K562細胞增殖和促進凋亡作用。

[關(guān)鍵詞]人參皂苷Rh2； 白血病； 自噬； 凋亡

白血病是嚴重危害人類生命健康的造血系統(tǒng)惡性腫瘤，是國內(nèi)十大高發(fā)惡性腫瘤之一。迄今，白血病的治療仍主要采用傳統(tǒng)的大劑量聯(lián)合化療，但此療法副作用甚大，復發(fā)率很高，尤其對機體免疫與造血系統(tǒng)有極大的損害。因此，可以從傳統(tǒng)的中藥中尋找天然低毒的藥物來治療白血病。其中人參Panax ginseng CAMeyer是我國傳統(tǒng)中草藥，在腫瘤的治療方面具有很高的藥用價值[1]。S型人參皂苷單體Rh2[（S）Rh2]是人參中天然活性成分之一，是一種從紅參中分離得到的原人參二醇型單糖鏈皂苷單體化合物，其毒性低，相對分子質(zhì)量小，脂溶性好，具有很強的抗腫瘤活性[2]。

目前大家認為，細胞死亡包括3種類型：即壞死、凋亡和自噬性細胞死亡，其中，自噬是屬于比較熱門的Ⅱ型細胞程序性死亡方式[3]。細胞程序性死亡中，自噬可能比凋亡扮演更為主動和重要的角色。自噬在腫瘤細胞起到雙刃劍作用，可以保護腫瘤細胞，也可以殺傷腫瘤細胞[4]。作者選取人紅白血病K562細胞株作為研究對象，為了進一步弄清楚人參皂苷Rh2對白血病的藥理作用，并從自噬途徑研究人參皂苷Rh2促進人白血病細胞自噬凋亡機制，為Rh2應用于臨床治療白血病奠定實驗和理論基礎。

1材料

11K562細胞株人紅白血病K562細胞株購自上海ATCC細胞庫。每次取對數(shù)生長期的K562細胞以5×108個/L接種于10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，在37 ℃，5%CO2飽和濕度下培養(yǎng)，每2～3 d傳代或換液。

12藥品Rh2購自成都曼斯特科技有限公司（純度98%），取200 μL DMSO加入20 mg Rh2使之充分溶解，配制成100 mg·L-1原液，-20 ℃冷凍保存。實驗前用含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)液稀釋成所需濃度。

13試劑胎牛血清，RPMI 1640培養(yǎng)基（美國Hyclone公司）；CCK8試劑盒（日本同仁化學研究所）；Annexin VPI雙標凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物公司）；吖啶橙，MDC染液，3MA自噬抑制劑（美國Sigma公司）；MAPK通路抗體試劑盒，Beclin1，LC3A/B多克隆抗體（美國Cell Signaling Technology）；Bcl2，Bax多克隆抗體（美國Epitomics公司）。

14儀器超凈工作臺（Sanyo）；倒置顯微鏡、倒置熒光顯微鏡（Olympus）；低溫離心機（Sigma）；酶標儀，垂直電泳儀，電轉(zhuǎn)儀，ChemiDocXRS化學發(fā)光成像系統(tǒng)，PCR儀（BioRad）；二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo）。

2方法

21CCK8 法培養(yǎng)對數(shù)生長期的K562細胞，以1×104 個/孔接種于96孔板中。分為空白對照組、藥物組和本底對照組，每組設6個復孔，每孔200 μL，（S）Rh2 20～100 μmol·L-1；本底對照組：只加RPMI 1640培養(yǎng)液。培養(yǎng)24，48，72 h后，每孔加入10 μL CCK8檢測液，輕輕搖勻，孵育25 h 后，用酶標儀（波長450 nm）檢測每孔吸光度（A），并計算細胞增殖抑制率和半數(shù)抑制濃度（IC50）。

22FCM檢測早期凋亡培養(yǎng)對數(shù)生長期的K562細胞，調(diào)整細胞濃度分別至5×108 個/L，接種于6孔細胞培養(yǎng)板中。實驗分為4組：Ⅰ組為空白對照組，正常培養(yǎng)；Ⅱ組加入（S）Rh2 60 μmol·L-1；Ⅲ組加入5 mmol·L-1的自噬抑制劑3MA；Ⅳ組同時加入（S）Rh2 60 μmol·L-1和3MA 5 mmol·L-1。每孔3 mL培養(yǎng)液，在37 ℃，5%CO2飽和濕度下培養(yǎng)24，48 h后，分別收集各組細胞，用預冷001 mol·L-1PBS（pH 72）洗滌2次，4 ℃ 1 200 ×g離心5 min。加入RNA酶和碘化丙啶（PI） 和Annexin V，置于冰上染色處理30 min，每組細胞2×104個，上流式細胞儀檢測，重復實驗3次。

23Hoechst染色取對數(shù)生長期的K562細胞調(diào)整細胞密度為5×108 個/L，接種于6孔培養(yǎng)板。實驗分組：空白對照組含01% DMSO的RPMI 1640完全培養(yǎng)液；藥物組60 μmol ·L-1的Rh2培養(yǎng)48 h后，收集空白對照組和藥物組細胞，用預冷PBS洗滌細胞2次，加甲醇乙醇（3∶1）固定液室溫固定15 min；離心去除固定液加Hoechst染色液避光、室溫染色30 min，PBS洗滌1次，調(diào)整細胞濃度，滴片，熒光顯微鏡下觀察。

24吖啶橙染色K562細胞用人參皂苷（S）Rh2 60 μmol·L-1處理24 h后，收集細胞，新選配制的吖啶橙（2 μ·mL-1），37 ℃避光孵育15 min，在EP管中，用PBS漂洗3次后，調(diào)整細胞濃度，取一滴細胞懸液滴到玻片上，待細胞沉積到玻片上時，吸去上層液體，封片置于熒光顯微鏡下觀察酸性的自噬小泡。50%甘油封片，置于倒置熒光顯微鏡下觀察、采圖，實驗重復3次。

25Western blot取對數(shù)生長期的K562細胞，調(diào)整細胞濃度到5×108 個/L，接種到細胞培養(yǎng)瓶中。實驗分組為對照組和藥物組（S）Rh2（20，40，60 μmol·L-1），置培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。提取蛋白并將各組蛋白濃度調(diào)成4 g·L-1，沸水中煮沸5 min，蛋白完全變性后，冷卻，每個樣品取10 μL加入泳道中，保證每孔中有40 μg待測蛋白樣品，行SDSPAGE電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜；5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后，分別加入抗體MAPK信號通路抗體按1∶500稀釋；Bcl2，Bax，Caspase3（激活型），LC3A和LC3B按1∶1 000稀釋抗體，及Beclin1和βactin按1∶2 000稀釋抗體，4 ℃孵育過夜；用TBST漂洗3次，每次10 min置于脫色搖床上；分別加入以1∶2 000稀釋的辣根過氧化物酶標記二抗，再用TBST漂洗3次，每次10 min置于脫色搖床上；最后在保鮮膜上滴入ECL化學發(fā)光液，在暗室進行X膠片曝光，洗片，膠片晾干后。掃描膠片，Quantity One軟件定量分析，此實驗重復3次。

26RTPCR參照試劑盒說明書進行，Trizol提取細胞總RNA。采用TAKARA反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒逆轉(zhuǎn)錄cDNA。應用TAKARA的SYBRⅡ試劑，PCR反應體系為10 μL。檢測自噬重要基因的mRNA 水平。引物由上海生工生物公司提供，引物序列見表1。以GAPDH為內(nèi)參基因，用目的基因與GAPDH 的起始拷貝數(shù)比值表示目的基因的相對表達量，實驗重復3次。

3結(jié)果

31CCK8檢測細胞增殖抑制能力藥物組與對照組比較，人參皂苷（S）Rh2能有效抑制白血病K562細胞增殖，并呈濃度和時間依耐性且K562細胞48 h的IC50為60 μmol·L-1。因此，選擇Rh2（60 μmol·L-1）作為實驗研究最大濃度，見圖1。

32流式細胞術(shù)測細胞凋亡Rh2 （60 μmol·L-1） 處理K562細胞24 h 后，F(xiàn)CM檢測結(jié)果顯示加藥與對照組比較1）P<005（圖5，6，8同）。

組細胞早期和晚期凋亡數(shù)量明顯增多，其早期凋亡率分別為（1200±260）%，且隨著濃度的增高，早期凋亡率增高，分別與對照組（318±052）%相比，差異有統(tǒng)計學意義（P<005）；晚期凋亡率分別為（1632±345）%，且隨著濃度的增高，晚期凋亡率增高，分別與空白對照組（319±073）%相比，差異均有統(tǒng)計學意義（P<005）。

33Hoechst染色檢測細胞凋亡Rh2（60 μmol·L-1）誘導K562細胞48 h后，用Hoechst染色顯示，細胞核出現(xiàn)染色質(zhì)濃縮、核碎裂、核邊集的細胞凋亡現(xiàn)象，并且細胞發(fā)出藍色熒光較對照組細胞強，見圖2，說明Rh2能誘導K562細胞凋亡。

34MDC染色觀察細胞自噬人參皂苷（S）Rh2（60 μmol·L-1）處理K562細胞24 h后，用MDC染色后，觀察細胞內(nèi)綠色熒光強度，見圖3，經(jīng)人參皂苷（S）Rh2誘導后，K562細胞中的酸性自噬小泡均明顯增加，對照組綠色的自噬小泡基本看不見，說明人參皂苷（S）Rh2能夠增強細胞自噬。

35吖啶橙染色觀察細胞自噬人參皂苷（S）Rh2（60 μmol·L-1）處理K562細胞24 h后，用吖啶橙染色后，觀察細胞內(nèi)的自噬體，見圖4，細胞內(nèi)綠色代表酸性自噬小體，紅色代表核仁，經(jīng)人參皂苷（S）Rh2誘導后，K562細胞中的酸性自噬小泡均明顯增加，對照組綠色的自噬小泡基本看不見。

36RTPCR檢測自噬重要調(diào)控基因的表達與對照組比較，K562細胞經(jīng)60 μmol·L-1的（S）Rh2作用24 h后，自噬相關(guān)基因（Atg3，Atg5，Atg7，Atg12）在2種細胞中變化不明顯，而自噬重要調(diào)控基因Beclin1，LC3A，LC3B的表達卻明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P<005），見圖5。

37Western blot檢測自噬重要蛋白的表達與對照組比較，K562細胞經(jīng)不同濃度的（S）Rh2作用后，Beclin1，LC3A，LC3B蛋白的表達水平明顯增高，見圖6。人參皂苷（S）Rh2能在分子水平上增加自噬重要的蛋白和基因的表達，進一步確定了（S）Rh2能誘導白血病K562細胞發(fā)生自噬。

38（S）Rh2通過自噬抑制細胞增殖作用CCK8檢測細胞的增殖能力，發(fā)現(xiàn)單獨用自噬抑制劑3MA能輕微降低細胞活力，但是無統(tǒng)計學意義；單獨使用（S）Rh2能明顯降低細胞活力，差異有統(tǒng)計學意義（P<005）；然而在聯(lián)合加入自噬抑制劑3MA和（S）Rh2后，與單獨加入（S）Rh2組比較，細胞活力有明顯的回升，差異有統(tǒng)計學意義（P<005），說明

39（S）Rh2通過自噬誘導細胞凋亡用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡發(fā)現(xiàn)，細胞加入自噬抑制劑時，與對照組比較無明顯改變；單獨使用（S）Rh2時，細胞凋亡明顯增加，差異有統(tǒng)計學意（P<005）；然而在聯(lián)合加入自噬抑制劑3MA和（S）Rh2后，與單獨加入（S）Rh2組比較，細胞凋亡有明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<005），說明細胞自噬能增強人參皂苷（S）Rh2對白血病K562細胞的促凋亡作用，見表2。

310Western blot檢測自噬對（S）Rh2誘導細胞凋亡作用的影響單獨運用自噬抑制劑3MA后，細胞自噬關(guān)鍵蛋白LC3A/B有下降的趨勢，單獨運用（S）Rh2后，細胞自噬關(guān)鍵蛋白LC3A/B和激活型的Caspase3表達明顯上升，當同時加入自噬抑制劑3MA和（S）Rh2后，細胞的自噬關(guān)鍵蛋白LC3A/B和激活型Caspase3的表達比單獨運用（S）Rh2時明顯下降，說明抑制自噬后細胞凋亡現(xiàn)象減少，自噬可促進人參皂苷（S）Rh2誘導K562的凋亡作用，見圖7。

與對照組比較1）P<005，與Rh2組比較2）P<005。

311Rh2通過激活磷酸化p38調(diào)控K562細胞自噬凋亡10，20，40，60 μmol·L-1Rh2 作用于K562細胞24 h后，Western blot結(jié)果顯示，p38蛋白的表達幾乎沒變化，pp38的表達增加，提示Rh2可能通過激活磷酸化p38調(diào)控K562細胞自噬凋亡，見圖8。

4討論

目前，許多研究者認為自然界中有豐富抗腫瘤的天然藥物，本課題組前期實驗表明人參提取物人參總皂苷和單體能在體外抑制白血病和肝癌細胞增殖，阻滯周期，促進凋亡。其他國內(nèi)外研究人員也研究證實，人參皂苷單體能抑制各種腫瘤細胞的增殖，促進腫瘤細胞發(fā)生凋亡[56]。因此采用CCK8法研究人參皂苷單體Rh2對白血病細胞K562增殖抑制作用，發(fā)現(xiàn)人參皂苷單體Rh2能有效抑制白血病細胞的增長。通過流式細胞術(shù)發(fā)現(xiàn)人參皂苷單體Rh2能促進細胞發(fā)生凋亡，Hoechst染色同樣證明了Rh2能誘導細胞凋亡。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)Rh2能夠

增加Bax/Bcl2的比例，同時激活Caspase3，說明了Rh2能通過線粒體途徑誘導細胞發(fā)生凋亡。

細胞自噬和凋亡密切相關(guān)，凋亡的早期，細胞出現(xiàn)應激反應，會出現(xiàn)自噬。為了探討人參皂苷（S）Rh2對白血病細胞自噬的關(guān)系，運用了吖啶橙和MDC染色。發(fā)現(xiàn)加藥組早期細胞出現(xiàn)酸性的自噬泡，PCR和Western blot結(jié)果顯示自噬相關(guān)基因和蛋白分子（Beclin1，LC3A和LC3B）的表達均升高，證明了人參皂苷（S）Rh2能誘導白血病細胞發(fā)生自噬。 自噬異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，可以從不同生物學行為影響腫瘤的進程，其中有細胞周期、增殖、凋亡、耐藥、血管生成及腫瘤的治療等方面的調(diào)控[7]。文獻研究報道，自噬和細胞凋亡的關(guān)系存在兩面性，維持細胞生存和促進細胞死亡[8]。前面的實驗證明了人參皂苷Rh2既能誘導白血病K562細胞凋亡又能誘導其發(fā)生自噬，那么細胞自噬和凋亡關(guān)系是怎樣的呢？實驗表明，當同時加入自噬抑制劑3MA和Rh2時，與單獨加入Rh2相比，K562的細胞凋亡減少和細胞活力增強。說明抑制細胞自噬，可削弱人參皂苷Rh2對白血病細胞增殖抑制和誘導凋亡的作用，提示人參皂苷Rh2可以通過誘導白血病細胞發(fā)生自噬，促進細胞凋亡。

目前，MAPK信號通路能調(diào)控自噬和細胞凋亡[9]。作者前期的研究已經(jīng)證實人參皂苷Rh2誘導細胞自噬，3甲基腺嘌呤（3MA）通過抑制ClassⅢ PI3K 的活性抑制自噬，抑制細胞自噬可以削弱人參皂苷Rh2對K562的抑制增殖和促凋亡作用[10]。為了研究人參皂苷Rh2誘導細胞自噬凋亡的可能機制，作者運用了Western blot檢測MAPK信號通路的關(guān)鍵的蛋白p38，發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rh2分別能夠激活p38，發(fā)生磷酸化激活。證明了參皂苷Rh2可能能通過激活磷酸化p38調(diào)控K562細胞自噬凋亡。

[參考文獻]

[1]Rokot N T， Kairupan T S， Cheng K C， et al A role of ginseng and its constituents in the treatment of central nervous system disorders [J] Evid Based Complement Alternat Med：eCAM， 2016， 2016：2614742

[2]Jeong M K， Cho C K， Yoo H S General and genetic toxicology of enzymetreated ginseng extract：toxicology of ginseng Rh2 [J]. J Pharmacopuncture， 2016， 19（3）：213

[3]Sbrana F V， Cortini M， Avnet S， et al The role of autophagy in the maintenance of stemness and differentiation of mesenchymal stem cells [J] Stem Cell Rev Rep， 2016，12（6）：621

[4]Duffy A， Le J， Sausville E， et al Autophagy modulation：a target for cancer treatment development [J] Cancer Chemother Pharmacol， 2015， 75（3）：439

[5]Liu X， Sun Y， Yue L， et al JNK pathway and relative transcriptional factor were involved in ginsenoside Rh2mediated G1 growth arrest and apoptosis in human lung adenocarcinoma A549 cells [J] Genet Mol Res：GMR， 2016， 15（3）：gmr15039003

[6]Liu Z H， Li J， Xia J， et al Ginsenoside 20（s）Rh2 as potent natural histone deacetylase inhibitors suppressing the growth of human leukemia cells [J] Chem Biol Interact， 2015， 242：227

[7]Zhang D， Tang B， Xie X， et al The interplay between DNA repair and autophagy in cancer therapy [J] Cancer Biol Ther， 2015， 16（7）：1005

[8]Helgason G V， Holyoake T L， Ryan K M Role of autophagy in cancer prevention， development and therapy [J] Essays Biochem， 2013， 55：133

[9]Ge J， Liu Y， Li Q， et al Resveratrol induces apoptosis and autophagy in Tcell acute lymphoblastic leukemia cells by inhibiting Akt/mTOR and activating p38MAPK [J] Biomed Environ Sci：BES， 2013， 26（11）：902

[10]Wu J C， Lai C S， Badmaev V， et al Tetrahydrocurcumin， a major metabolite of curcumin， induced autophagic cell death through coordinative modulation of PI3K/AktmTOR and MAPK signaling pathways in human leukemia HL60 cells [J] Mol Nutr Food Res， 2011， 55（11）：1646

[責任編輯張寧寧]