潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中ERK—1、sRAGE表達(dá)研究

楊俊　曹勇　王東旭　潘迪　張營(yíng)　鄭長(zhǎng)青

[摘要] 目的 探討潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶-1（ERK-1）、人可溶性晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（sRAGE）的表達(dá)及意義。 方法 選取90只健康成年雄性BALB/c小鼠，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表分為潰瘍性結(jié)腸炎組（n=30）、細(xì)菌性腸炎組（n=30）及對(duì)照組（n=30），潰瘍性結(jié)腸炎組給予飲用葡聚糖硫酸鈉（DSS）造模，細(xì)菌性腸炎組給予大腸埃希菌菌液灌腸造模，對(duì)照組不做處理。造模成功后處死小鼠，觀察各組小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）、結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分（HPS）；取小鼠結(jié)腸標(biāo)本，應(yīng)用免疫組化法測(cè)定ERK-1、sRAGE表達(dá)。 結(jié)果 與對(duì)照組、細(xì)菌性腸炎組相比，潰瘍性結(jié)腸炎組小鼠DAI、HPS評(píng)分顯著升高（P < 0.05），而細(xì)菌性腸炎組DAI、HPS評(píng)分高于對(duì)照組（P < 0.05）。潰瘍性結(jié)腸炎組小鼠結(jié)腸組織中ERK-1、sRAGE陽(yáng)性表達(dá)率均高于細(xì)菌性腸炎組及對(duì)照組（P < 0.05），而細(xì)菌性腸炎組小鼠結(jié)腸組織中ERK-1表達(dá)高于對(duì)照組（P < 0.05）。經(jīng)Pearson相關(guān)分析顯示，結(jié)腸組織中ERK-1、sRAGE與DAI、HPS評(píng)分呈正相關(guān)（P < 0.05）。 結(jié)論 結(jié)腸組織中ERK-1、sRAGE異常表達(dá)與潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生及病情進(jìn)展有密切關(guān)系。

[關(guān)鍵詞] 細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶-1；人可溶性晚期糖基化終末產(chǎn)物受體；潰瘍性結(jié)腸炎

[中圖分類(lèi)號(hào)] R574.62 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2016）11（c）-0008-04

The expression of ERK-1， sRAGE in colon tissue of mice with ulcerative colitis

YANG Jun CAO Yong WANG Dongxu PAN Di ZHANG Ying ZHENG Changqing

The Second Department of Digestive Internal Medicine， Shengjing Hospital Affiliated to China Medical University， Liaoning Province， Shenyang 117004， China

[Abstract] Objective To investigate the expression and significance of extracellular signal-regulated kinase-1 （ERK-1）， human soluble advanced glycation end product receptor （sRAGE） in colon tissue of mice with ulcerative colitis. Methods 90 healthy adult male BALB/c mice were selected and divided into ulcerative colitis group （n=30）， bacterial enteritis group （n=30） and control group （n=30） according to random number table. The rats in the ulcerative colitis group were given dextran sulfate sodium sulfate （DSS）， and the bacterial enteritis group was given E. coli bacteria liquid enema modeling. The control group had no dispose. The mice disease activity index （DAI）， colonic histopathology score （HPS） of each groups after the modeling were observed. The levels of ERK-1， sRAGE expression in assay colon tissue were determined by immunohistochemistry. Results The DAI， HPS scores of the ulcerative colitis group were higher than those of the bacterial enteritis group and the control group （P < 0.05）， which of the bacterial enteritis group were higher than those of the control group （P < 0.05）. The levels of ERK-1， sRAGE expression in colonic tissues of the ulcerative colitis group were higher than those of the bacterial enteritis group and the control group （P < 0.05）， and ERK-1 expression in the colon tissue of bacterial enteritis group was higher than that of the control group （P < 0.05）. The Pearson analysis showed that the levels of ERK-1， sRAGE expression were positively correlated with DAI， HPS scores （P < 0.05）. Conclusion The abnormal expression of ERK-1 and sRAGE in colon tissue have a close relationship with the occurrence and progression of ulcerative colitis.

[Key words] Extracellular regulated protein kinase-1； Human soluble advanced glycation end product receptor； Ulcerative colitis

潰瘍性結(jié)腸炎是臨床上常見(jiàn)的胃腸疾病，目前發(fā)病機(jī)制尚不明確。已有研究表明，炎癥因子、遺傳背景、結(jié)腸內(nèi)微生態(tài)失衡及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)異常等因素均可能與潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生及病情進(jìn)展有密切的關(guān)系[1-2]。細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶-1（ERK-1）屬于有絲分裂原激活蛋白激酶信號(hào)通路中關(guān)鍵信號(hào)蛋白，通過(guò)磷酸化發(fā)揮著開(kāi)啟及閉合信號(hào)通路的作用，從而起調(diào)控細(xì)胞因子表達(dá)的作用[3]。有研究指出，ERK-1在潰瘍性結(jié)腸炎中存在明顯的磷酸化現(xiàn)象，可活化腫瘤細(xì)胞壞死因子及轉(zhuǎn)移細(xì)胞因子[4]。人可溶性晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（sRAGE）屬于跨膜蛋白，是由晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（RAGE）脫落而成，可作為慢性浸潤(rùn)性炎癥疾病的標(biāo)志物[5]。當(dāng)機(jī)體組織或外周血中sRAGE水平升高則提示機(jī)體處于炎癥浸潤(rùn)狀態(tài)。本研究主要探討ERK-1、sRAGE在潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中的表達(dá)及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取90只健康成年雄性BALB/c小鼠，重量20～25 g，購(gòu)于復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，合格證號(hào)：SCXK（滬）2014-0001。所有動(dòng)物于復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心屏障環(huán)境飼養(yǎng)，動(dòng)物使用合格證號(hào)：SYXK（滬）2014-0008。根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表分為潰瘍性結(jié)腸炎組（n=30）、細(xì)菌性腸炎組（n=30）及對(duì)照組（n=30），所有動(dòng)物均行清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑及儀器

葡聚糖硫酸鈉（DSS）購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，大腸埃希菌菌株購(gòu)于上海士鋒生物科技有限公司；兔抗鼠ERK-1一抗（艾美捷科技有限公司）；兔抗鼠sRAGE一抗（上海康朗生物科技有限公司）；羊抗兔二抗（南京生興生物技術(shù)有限公司）；DAB顯色劑（北京索萊寶科技有限公司）；多聚甲醛（南京新化原化學(xué)有限公司）；辣根過(guò)氧化酶[微蒙生物科技（上海）有限公司]。超聲波清洗儀（型號(hào)：SKE-5S，寧波科麥儀器有限公司）；微量加樣器（北京華儀三譜儀器有限責(zé)任公司）；電子分析天平（型號(hào)：BT125D，賽多利斯儀器有限公司）；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（型號(hào)UV2600，杭州康納科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 建立動(dòng)物模型 潰瘍性結(jié)腸炎組：將5%葡聚糖硫酸鈉（DSS）溶解于純凈水中，讓小鼠自行服用進(jìn)行造模，當(dāng)小鼠持續(xù)有輕重不等的腹瀉、間斷血便、腹痛及全身癥狀，持續(xù)數(shù)周，其間可有急性發(fā)作則為建模成功；細(xì)菌性腸炎組給予大腸埃希菌菌液灌腸造模，每天灌腸1次，每次200 mL，當(dāng)小鼠出現(xiàn)大量水樣便，無(wú)膿血，無(wú)腹痛，伴有嘔吐，容易發(fā)生脫水、出現(xiàn)電解質(zhì)紊亂及酸中毒癥狀時(shí)則為造模成功；對(duì)照組不做處理。造模后各組小鼠持續(xù)觀察12 d，第12天后處死，取出結(jié)腸組織用于相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

1.3.2 癥狀體征觀察及評(píng)分 建模過(guò)程中，觀察各組小鼠便血、大便性狀、體重變化，并參照Cooper經(jīng)典評(píng)分系統(tǒng)[6]，將小鼠每天便血、大便性狀、隱血及體重下降等評(píng)分相加，作為疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）。

1.3.3 組織病理學(xué)炎癥損傷評(píng)分 在距肛門(mén)2、6、10 cm處選取3段長(zhǎng)約1 cm的小鼠結(jié)腸組織，石蠟包埋切片，行HE染色，采用盲法閱片，光鏡下觀察腸黏膜損傷情況，并根據(jù)Cooper經(jīng)典組織學(xué)損傷評(píng)分法進(jìn)行結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分（HPS）。

1.3.4 結(jié)腸組織中ERK-1、sRAGE表達(dá)測(cè)定 造模成功后12 d隨機(jī)從各組中選取10只小鼠，應(yīng)用免疫組化法測(cè)定小鼠結(jié)腸組織中ERK-1、sRAGE表達(dá)水平。各組小鼠處死前24 h于腹腔內(nèi)注射Brd U，共注射3次，每6小時(shí)注射1次，注射完畢12 h后應(yīng)用1.5%～2.5%異氟烷吸入麻醉，然后應(yīng)用脊椎脫臼法處死小鼠，取出結(jié)腸組織，應(yīng)用4%多聚甲醛固定過(guò)夜，石蠟包埋，行冠狀位切片，切片后常溫脫蠟加入3%甲醇溶液，常溫下山羊血清封閉20 min，兔抗鼠ERK-1一抗、兔抗鼠sRAGE一抗，置濕盒4℃過(guò)夜，生物素標(biāo)記二抗，室溫下靜置10 min，加入辣根過(guò)氧化酶，室溫下靜止10 min，滴入DAB顯色劑，室溫顯色5～10 min，中性樹(shù)脂封片。ERK-1陽(yáng)性反應(yīng)為細(xì)胞漿呈黃色顆粒或深黃色顆粒；sRAGE陽(yáng)性反應(yīng)為細(xì)胞核呈棕黃色或深黃色染色。染色深度評(píng)分：0分為無(wú)顯色或顯色不清，1分為淺黃色，2分為深黃色，3分為褐黃色。染色面積：0分為0%～5%，1分為>5%～35%，2分為 >35%～65%；3分為>65%。染色深度與面積之積達(dá)1～3分為“+”，4～6分為“++”，7～9分為“+++”。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)檢驗(yàn)；以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠造模后表現(xiàn)

結(jié)腸性潰瘍組小鼠成功建模后第1天，大便次數(shù)增多，出現(xiàn)黏液稀便；建模后第3天小鼠大便完全為稀便，部分出現(xiàn)為肉眼血便；造模1周后體重減輕，可見(jiàn)膿性血便，飲食明顯減少，毛發(fā)無(wú)光澤，少食賴(lài)動(dòng)。細(xì)菌性腸炎組建模后第1天，大便次數(shù)增加，為軟便；建模第3天后大量水樣便，無(wú)膿血，小鼠出現(xiàn)脫水癥狀。對(duì)照組小鼠無(wú)明顯變化。

2.2 各組小鼠DAI、HPS評(píng)分比較

與對(duì)照組、細(xì)菌性腸炎組相比，潰瘍性結(jié)腸炎組小鼠DAI、HPS評(píng)分顯著升高（P < 0.05），細(xì)菌性腸炎組DAI、HPS評(píng)分顯著高于對(duì)照組（P < 0.05）。

2.3 各組小鼠結(jié)腸組織中ERK-1、sRAGE陽(yáng)性表達(dá)情況

潰瘍性結(jié)腸炎組結(jié)腸組織中ERK-1、sRAGE陽(yáng)性表達(dá)率均顯著高于細(xì)菌性腸炎組及對(duì)照組（P < 0.05），而細(xì)菌性腸炎組結(jié)腸組織中ERK-1表達(dá)顯著高于對(duì)照組（P < 0.05）。見(jiàn)表2、圖2。

2.4 潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中ERK-1、sRAGE表達(dá)與DAI、HPS評(píng)分的關(guān)系

Pearson相關(guān)性分析顯示，潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中ERK-1陽(yáng)性表達(dá)與DAI、HPS評(píng)分呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.332、0.328，P < 0.05）；sRAGE陽(yáng)性表達(dá)與DAI、HPS評(píng)分呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.356、0.372，P < 0.05）。

3 討論

潰瘍性結(jié)腸炎是一種累及直腸及結(jié)腸黏膜組織的慢性炎癥浸潤(rùn)性疾病，目前對(duì)于潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病機(jī)制尚不明確，但普遍認(rèn)為與環(huán)境因素、易感基因、免疫系統(tǒng)及炎癥因子表達(dá)異常等因素有關(guān)[7-8]。腸黏膜免疫系統(tǒng)中相關(guān)免疫調(diào)節(jié)因子、細(xì)胞因子可參與潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生及病情進(jìn)展[9]。ERK-1是一類(lèi)廣泛分布在細(xì)胞內(nèi)的蛋白激酶，是連接決定性基因表達(dá)與細(xì)胞膜表面受體間的重要信號(hào)調(diào)節(jié)酶，ERK-1信號(hào)通路在促進(jìn)結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞增生、分化及抑制上皮細(xì)胞凋亡中起到重要的生理作用[10-12]。本研究中潰瘍性結(jié)腸炎組結(jié)腸組織中ERK-1陽(yáng)性表達(dá)率均高于細(xì)菌性腸炎組及對(duì)照組（P < 0.05），提示ERK-1異常表達(dá)與潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生有密切關(guān)系，而細(xì)菌性腸炎組結(jié)腸組織中ERK-1表達(dá)高于對(duì)照組（P < 0.05），這可能與ERK-1可活化及調(diào)控相關(guān)炎癥因子從而參與腸炎的發(fā)生有關(guān)。經(jīng)Pearson相關(guān)分析顯示，結(jié)腸組織中ERK-1陽(yáng)性表達(dá)與DAI、HPS評(píng)分呈正相關(guān)（r=0.332、0.328，P < 0.05），提示在潰瘍性結(jié)腸炎中ERK-1表達(dá)水平與腸黏膜炎癥損傷及臨床癥狀有密切的關(guān)系?？紤]可能機(jī)制為細(xì)胞有絲分裂刺激因子可激活ERK-1途徑主要細(xì)胞外信號(hào)，被激活的ERK可通過(guò)直接、間接或核轉(zhuǎn)位等方式作用于激活劑蛋白1及核因子，從而控制及調(diào)節(jié)相關(guān)炎癥細(xì)胞因子表達(dá)[13-14]。

sRAGE屬于內(nèi)源性非酶類(lèi)多配體受體，在腎系膜細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞中廣泛表達(dá)，它可促進(jìn)多種炎癥分子結(jié)合，并介導(dǎo)機(jī)體多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[16]。sRAGE在機(jī)體中主要作用是促進(jìn)炎癥發(fā)生、促進(jìn)細(xì)胞因子生長(zhǎng)、增殖及活化各種細(xì)胞因子[17]。Wang等[18]研究指出，炎癥性腸炎患者結(jié)腸組織中sRAGE表達(dá)水平顯著升高，其認(rèn)為sRAGE在潰瘍性腸炎持續(xù)損傷過(guò)程中起到重要的促進(jìn)作用。本研究中潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中sRAGE陽(yáng)性表達(dá)率高于細(xì)菌性腸炎及對(duì)照組，而細(xì)菌性腸炎小鼠結(jié)腸組織sRAGE陽(yáng)性表達(dá)與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），提示sRAGE可能通過(guò)某種途徑參與潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生及進(jìn)展過(guò)程，同時(shí)也體現(xiàn)了sRAGE在潰瘍性結(jié)腸炎中的獨(dú)特致病機(jī)制，可以認(rèn)為sRAGE只參加潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病過(guò)程，而與普通腸炎的發(fā)生關(guān)系不大[19]。Meijer等[20]指出，sRAGE可激活多種炎癥介質(zhì)表達(dá)，并誘導(dǎo)機(jī)體過(guò)氧化反應(yīng)，從而促進(jìn)炎癥因子釋放，介導(dǎo)炎性反應(yīng)。本研究結(jié)腸組織中sRAGE陽(yáng)性表達(dá)與DAI、HPS評(píng)分呈正相關(guān)（r=0.356、0.372，P < 0.05），進(jìn)一步提示sRAGE表達(dá)異?？梢杂绊憹冃越Y(jié)腸炎炎癥因子釋放，并介導(dǎo)腸黏膜潰瘍性損傷。

綜上所述，結(jié)腸組織中ERK-1、sRAGE異常表達(dá)與潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生及病情進(jìn)展有密切關(guān)系。

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（收稿日期：2016-08-20 本文編輯：程 銘）