基于脂質(zhì)組學(xué)的高脂血癥小鼠血清脂肪酸研究

劉佩莉，關(guān) 鑫，李 楠，曹興奮，楊 萍，王曉輝，劉洪斌

基于脂質(zhì)組學(xué)的高脂血癥小鼠血清脂肪酸研究

劉佩莉1，關(guān) 鑫2，李 楠1，曹興奮1，楊 萍1，王曉輝1，劉洪斌1

目的：應(yīng)用高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（LC-Q-TOF-MS）技術(shù)對(duì)高脂血癥小鼠的血清脂肪酸類成分及生物標(biāo)志物進(jìn)行分析。方法：將20只小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組和模型組，建立高脂模型，灌胃給藥，1次/d，持續(xù)15 d。末次給藥后1 h，經(jīng)目?jī)?nèi)眥取血。血清進(jìn)行處理后應(yīng)用LC-Q-TOF-MS技術(shù)，采用負(fù)譜模式掃描樣品，結(jié)合偏最小二乘法（PLS-DA）研究?jī)山M血清脂肪酸類成分差異。結(jié)果：與對(duì)照組相比，模型組小鼠血清中TG[（1.037±0.393）vs（0.810±0.412）]、TC[（3.776± 0.821）vs（3.002±0.648）]、HDL-C[（2.282±0.544）vs（1.896±0.326）]、LDL-C[（0.405±0.148）vs（0.128±0.072）]水平有顯著性差異。分析方法精密度RSD為9.25%，發(fā)現(xiàn)了16個(gè)潛在生物標(biāo)志物。結(jié)論：基于LC-Q-TOF-MS技術(shù)研究了高脂血癥小鼠血清中脂肪酸類成分的代謝物特征，可以將高脂血癥模型組與對(duì)照組進(jìn)行區(qū)分，是發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物的有效手段。

高脂血癥；脂質(zhì)組學(xué)；脂肪酸；生物標(biāo)志物

高脂血癥是指各種原因?qū)е碌难獫{中膽固醇、膽固醇脂、甘油三脂、磷脂、β-脂蛋白、未脂化的脂酸等代謝異常的疾病[1]，是中老年的常見病、多發(fā)病，是冠心病、腦中風(fēng)等心腦血管疾病的危險(xiǎn)因素。而脂代謝紊亂的發(fā)病機(jī)制[2]仍不十分清楚，現(xiàn)已公認(rèn)是由多基因、多因素導(dǎo)致的一類復(fù)雜性病理過程。當(dāng)前生物標(biāo)志物甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇，缺乏必要的特異性和敏感性，只有嚴(yán)重的血脂異常才顯著增加，因此高脂血癥的診斷需要更為敏感的生物標(biāo)志物[3]。已證實(shí)游離脂肪酸，尤其是不飽和脂肪酸與很多系統(tǒng)疾病[4-5]的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。脂肪酸屬于脂質(zhì)的一類，脂質(zhì)組學(xué)[6-7]是研究脂質(zhì)代謝調(diào)控的新學(xué)科，用于檢測(cè)存在于生物基質(zhì)中的全部脂質(zhì)，以及各種刺激或干預(yù)對(duì)脂質(zhì)的響應(yīng)，明確其對(duì)疾病診斷和治療的作用。本研究應(yīng)用LC-Q-TOF-MS技術(shù)對(duì)高脂血癥小鼠血清脂肪酸進(jìn)行分析，從整體代謝角度探討高脂血癥小鼠血清脂肪酸體內(nèi)代謝特征，試圖尋找具有臨床診斷特異性的血清生物標(biāo)志物，以期提高對(duì)高脂血癥疾病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)的能力。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物及分組 昆明小鼠20只，雌雄各半，體質(zhì)量（20±2）g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。自由進(jìn)食、飲水。

1.2 試劑與儀器 試劑：肉豆蔻酸對(duì)照品(批號(hào)M3128，規(guī)格5 g，Sigma公司)；正十七酸(批號(hào)K1325026，規(guī)格5 g，aladdin公司)；硬脂酸對(duì)照品(批號(hào)190032-201202，規(guī)格 200 mg)；棕櫚酸(批號(hào)190029-201202，規(guī)格 200 mg)；亞油酸(批號(hào)111622-201203，規(guī) 格 0.2 mL)；油 酸 (批 號(hào)111621-201205，規(guī) 格 0.2 mL)；月 桂酸 (批 號(hào)111774-200701，規(guī)格20 mg)均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；氯仿(批號(hào)2015年7月29日，規(guī)格500 mL，天津市化學(xué)試劑供銷公司)；甲醇(批號(hào)R141036，規(guī)格4 L，迪馬科技有限公司)；水為超純水。

儀器：Bruker microTOF-QⅡ飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，配置電噴霧離子源，Hystar3.2操作軟件；DIONEX U3000高效液相色譜系統(tǒng)，包括：在線脫氣機(jī)，二元輸液泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，柱溫箱，紫外檢測(cè)器；色譜柱：dionex C182.1 mm×250 mm，5 μm，120 A。

1.3 動(dòng)物模型的建立 造模：高脂飼料喂養(yǎng)法制備小鼠高脂血癥模型。高脂飼料由北京科澳飼料有限公司制備，配方為基礎(chǔ)飼料加蔗糖、煉豬油混合而成，蔗糖20%、豬油20%、膽固醇2%、膽鹽0.3%，喂養(yǎng)14 d，采血預(yù)試高脂血癥是否成立。分組：按照甘油三酯水平隨機(jī)分為2組[8]，分別為正常對(duì)照組（n= 11）和高脂血癥模型組（n=9）。給藥：高脂模型成立后，灌胃給藥，1次/d，持續(xù)灌胃15 d。

1.4 樣品采集與制備 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：分別稱取肉豆蔻酸、硬脂酸、亞油酸、油酸、月桂酸、正十七酸對(duì)照品0.6 mg、0.8 mg、1.15 mg、1.54 mg、0.91 mg、1.47 mg于10 mL量瓶中，棕櫚酸對(duì)照品1.38 mg于25 mL量瓶中，用二氯甲烷：甲醇（2∶1）溶解，并定容至刻度，分別得到儲(chǔ)備液60、80、115、154、91、147、 55.2 μg/mL。用甲醇進(jìn)行逐級(jí)稀釋至濃度分別為60、80、115、15.4、9.1、14.7、55.2 ng/mL。

樣品采集：末次給藥后1 h，經(jīng)目?jī)?nèi)眥取血。經(jīng)離心分離血清，冷凍保存。

樣品制備：取小鼠空白血清30 μL加入1.5 mL離心管中，加入內(nèi)標(biāo)液十七碳酸（1.47 μg/mL）20 μL，加入氯仿和甲醇混合液（1：2）600 μL，渦旋5 min，10 000 r/min離心10 min后，取上清液500 μL，空氣吹干，以500 μL乙腈復(fù)溶，渦旋30 s，用0.45 μm微孔濾膜過濾后測(cè)定。

1.5 血清生化指標(biāo)檢測(cè) 采用全自動(dòng)生化儀測(cè)定甘油三酯（TG）、膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）。

1.6 液質(zhì)聯(lián)用方法 （1）液相色譜條件。色譜柱：dionex C182.1 mm×250 mm，5 μm，120 A；流動(dòng)相：乙腈∶水=90∶10；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL；柱溫：30℃。（2）飛行時(shí)間質(zhì)譜條件。離子源為電噴霧離子化源負(fù)離子模式，源參數(shù)及質(zhì)譜參數(shù)見表1。

1.7 精密度實(shí)驗(yàn) 按“樣品制備方法”，取小鼠空白血清30 μL加入1.5 mL離心管中，加入內(nèi)標(biāo)液十七碳酸（1.47 μg/mL）20 μL，加入氯仿和甲醇混合液（1∶2）600 μL，渦旋5 min，10 000 r/min離心10 min后，取上清液500 μL，空氣吹干，以500 μL乙腈復(fù)溶，渦旋30 s，用0.45 μm微孔濾膜過濾后，連續(xù)分析6針。色譜圖結(jié)果見圖1。

圖1 小鼠高脂血癥血清HPLC-Q-TOF測(cè)定總離子譜圖

1.8 數(shù)據(jù)處理 使用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用()表示。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)及方差齊性檢驗(yàn)，對(duì)非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗(yàn)[8]，P＞0.05資料服從正態(tài)分布。兩組均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 血清生化指標(biāo) 與對(duì)照組相比，模型組小鼠血清中TG、TC、HDL-C、LDL-C水平有顯著性差異，表明高脂血癥小鼠模型成立。見表2。

表2 2組小鼠血清生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果比較（，mmol/L）

表2 2組小鼠血清生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果比較（，mmol/L）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05

組別對(duì)照組模型組TG 0.810±0.412 1.037±0.393aTC 3.002±0.648 3.776±0.821aHDL-C 1.896±0.326 2.282±0.544aLDL-C 0.128±0.072 0.405±0.148a

2.2 精密度實(shí)驗(yàn) 通過進(jìn)樣分析，計(jì)算內(nèi)標(biāo)峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），RSD為9.25%，表明此方法重復(fù)性良好。見表3。

表3 小鼠高脂血癥模型血清脂質(zhì)組學(xué)分析方法精密度

2.3 數(shù)據(jù)分析 通過LC-MS-ESI-TOF分析，得到小鼠血清脂質(zhì)代謝譜圖數(shù)據(jù)，應(yīng)用BRUKER自帶軟件Profile Analyst對(duì)上述數(shù)據(jù)進(jìn)行峰對(duì)齊后歸一降維處理，導(dǎo)出數(shù)據(jù)，應(yīng)用SIMCA-P11.5進(jìn)行偏最小二乘法分析（PLS-DA），模型組與正常對(duì)照組得到良好的區(qū)分，見圖2。應(yīng)用Profile Analyst對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組數(shù)據(jù)進(jìn)行分組處理，結(jié)果以點(diǎn)陣的方式將數(shù)據(jù)分別顯示出來，每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)分子量的信息，差異成分分布在四周，距離密集中心越遠(yuǎn)的點(diǎn)說明差異越大，見圖3。結(jié)合高脂血癥疾病特點(diǎn)，找出最有可能的物質(zhì)成分，提取主要差異物見表4。

圖2 PLS模型矩陣（▲對(duì)照組□模型組）

圖3 小鼠高脂血癥血清脂質(zhì)組學(xué)差異圖譜

3 討論

高脂血癥是體內(nèi)脂質(zhì)代謝異常引起的血脂水平發(fā)生異常的疾病，發(fā)病率高，是動(dòng)脈硬化性心腦血管疾病發(fā)病的危險(xiǎn)因素，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。脂質(zhì)組學(xué)是代謝組學(xué)的一個(gè)分支，應(yīng)用此方法研究疾病的發(fā)病機(jī)理已成為目前的研究熱點(diǎn)[9]。該技術(shù)的關(guān)鍵是找出疾病的代謝差異性物質(zhì)，因此對(duì)方法的可靠性要求較高。四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜是采用四極桿作為質(zhì)量過濾器，TOF作為質(zhì)量分析器，優(yōu)勢(shì)在于可以在寬質(zhì)量范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)高分辨，得到物質(zhì)準(zhǔn)確分子量[10]。本研究采用高脂飼料建立小鼠高脂血癥模型，此模型可重復(fù)率高，造模方法可靠，建立了LC-MS-ESITOF分析方法，并對(duì)其精密度進(jìn)行了考察，從數(shù)據(jù)可知RSD＜10%，重復(fù)性良好。

代謝組學(xué)研究檢測(cè)到的是海量多維的數(shù)據(jù)。分析這些數(shù)據(jù)，需要借助專門的數(shù)理統(tǒng)計(jì)和生物信息學(xué)軟件，從而快速、高效地呈現(xiàn)可視化的分析結(jié)果。目前，代謝組學(xué)常用的軟件[11]可大致分為兩類：一類是開放性軟件，包括MATLAB（matrix laboratory）、SAS（statistics analysis system）、SIMCA（soft independent modeling of class analogy）-P、R軟件、XCMS等；另一類是儀器自帶軟件，包括MarkerLynx（waters）、MassHunter（agilent）、MarkerView（applied biosystems/ MDSSCIEX）、Bruker Profile Analysis（bruker）等。本研究采用BRUKER自帶軟件Profile Analyst進(jìn)行數(shù)據(jù)處理后，再用SIMCA-P11.5進(jìn)行分析。代謝組學(xué)研究中的數(shù)據(jù)分析[12]包括無監(jiān)督模式識(shí)別方法和有監(jiān)督模式識(shí)別方法，其中無監(jiān)督模式識(shí)別方法主要包括主成分分析（principal component analysis，PCA）、分層聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）等；有監(jiān)督識(shí)別模式方法主要包括偏最小二乘判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）、正交信號(hào)校正技術(shù)偏最小二乘分析（orthogonal signal correction partial least square，OPLS）、正交信號(hào)校正技術(shù)偏最小二乘判別分析（orthogonal signal correction partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）、隨機(jī)森林分析（random forests，RF）等。其中，PCA、PLS-DA、OPLS-DA使用最廣泛。本實(shí)驗(yàn)采用有監(jiān)督模式的PLS-DA分析，在明確樣品分類的情況下，使不同類別樣品盡可能地分開，它的分類效果要比PCA更好。本實(shí)驗(yàn)的模型組與正常對(duì)照組得到良好的區(qū)分，表明小鼠高脂血癥模型組與對(duì)照組血清成分有明顯差別。應(yīng)用ProfileAnalyst對(duì)模型組和對(duì)照組數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步分析處理，結(jié)果以點(diǎn)陣的方式將數(shù)據(jù)分別顯示出來，每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)分子量的信息，差異成分分布在四周，距離密集中心越遠(yuǎn)的點(diǎn)說明差異越大，結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)模型組與對(duì)照組血清成分有明顯差異。經(jīng)過數(shù)據(jù)提取，得到一系列差異物質(zhì)，再結(jié)合高脂血癥疾病特點(diǎn)，找出最有可能的物質(zhì)成分。然后將這些物質(zhì)的譜圖與如LIPID MAPS、Lipid Bank、Cyber Lipids和LIPIDAT等數(shù)據(jù)庫(kù)[13-14]進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)而找到潛在的生物標(biāo)志物。

表4 小鼠高脂血癥模型血清脂質(zhì)組學(xué)分析差異物

目前對(duì)脂質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)分析還極具挑戰(zhàn)性，LIPID MAPS[15]是專門研究脂質(zhì)的數(shù)據(jù)庫(kù)。本實(shí)驗(yàn)借助于此數(shù)據(jù)庫(kù)和代謝組學(xué)常用數(shù)據(jù)庫(kù)HMDB對(duì)分子量進(jìn)行搜索，綜合分析找出最有可能的差異物成分。最終發(fā)現(xiàn)，差異代謝物成分共16個(gè)，主要為脂肪酸酰胺類5個(gè)、脂肪酸酯類2個(gè)和硝基、鹵化脂肪酸類9個(gè)，這些物質(zhì)在高脂血癥的發(fā)生發(fā)展過程中可能起到重要作用，它們的結(jié)構(gòu)確認(rèn)有待于進(jìn)一步的深入研究。本研究應(yīng)用脂質(zhì)組學(xué)技術(shù)建立的小鼠血清脂肪酸分析方法精密度符合要求，并用該方法發(fā)現(xiàn)了小鼠高脂血癥造模后血清中脂質(zhì)成分的代謝物變化，為高脂血癥的深入研究提供了有效手段，同時(shí)也能夠?yàn)楦咧Y發(fā)病機(jī)理及臨床診斷、用藥提供研究基礎(chǔ)。

[1]張寧仔，李蘭蘇.實(shí)用心血管內(nèi)科學(xué)手冊(cè)[M].北京：人民軍醫(yī)出版社，1997：834-839.

[2]張沛然，郭改會(huì).高脂血癥的發(fā)病機(jī)制及分類[J].中國(guó)臨床醫(yī)生，2012，40（3）：18-20.

[3]Chen H,Miao H,Feng YL,et al.Metabolomics in Dyslipidemia[J]. Adv Clin Chem,2014,66(10)：101-119.

[4]樓大鈞，朱麒錢，尤巧英，等.代謝綜合征合并糖尿病患者血清磷脂脂肪酸譜與超敏C反應(yīng)蛋白相關(guān)性研究[J].中華內(nèi)分泌代謝雜志，2010，26（3）：211-213.

[5]丁芳，王峰磊，楊波，等.高血壓患者血清脂肪酸與血壓的相關(guān)性研究[J].浙江預(yù)防醫(yī)學(xué)，2015，27（6）：551-555.

[6]Zhang YP,He CY,Qiu L,et al.Serum Unsaturated Free Fatty Acids：A Potential Biomarker Panel for Early-Stage Detection of Colorectal Cancer[J].J Cancer,2016,7(4)：477-483.

[7]Kenwood BM,Merrill Jr.AH.Lipidomics[J].Ency Cell Biol,2016, 1(8)：147-159.

[8]徐叔云，卞如濂，陳修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].第3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：200-210.

[9]Hy?tyl?inen T,Oresic M.Analytical Lipidomics in Metabolic and Clinical Research[J].Trends Endocrin Met,2015,26(12)：671-673.

[10]陳耀祖，凃亞平.有機(jī)質(zhì)譜原理及應(yīng)用[M].北京：科學(xué)出版社，2000：23-25.

[11]Krawetz S.Bioinformatics for Systems Biology[M].New York：Humana Press,2009：581-599.

[12]Arranza IM,Mayoa R,Cormenzanaa MP,et al.Enhancing metabolomics research through data mining[J].J Proteomics,2015,127(8)： 275-288.

[13]Wang M,Wang CY,Han RH,et al.Novel advances in shotgun lipidomics for biology and medicine[J].Prog Lipid Res,2016,61(1)：83-108.

[14]Li N,Song YP,Tang HR,et al.Recent developments in sample preparation and data pre-treatment in metabonomics research[J]. Arch Biochem Biophys,2016,589(1)：4-9.

[15]Quehenberger O,Armando AM,Brown AH,et al.Lipidomics reveals a remarkable diversity of lipids in human plasma[J].J Lipid Res,2010,51(11)：3299-3305.

（收稿：2016-03-02 修回：2016-10-28）

（責(zé)任編輯 王 豐）

Serum Fatty Acids of Hyperlipidemia Mice Based on Lipidomics

LIU Pei-li,GUAN Xin,LI Nan,et al.Tianjin Institute of Pharmaceutical Science,Tianjin（300020）,China

ObjectiveTo investigate the serum fatty acids composition and biomarkers in hyperlipidemia mice using high performance liquid chromatography(LC-Q-TOF-MS)technique.MethodsTotal 20 mice were randomly divided into normal control group and model group.Hyperlipidemia model was established after intragastric administration once a day,continuously intragastric administration at the end of 15 days.One hour after the last administration,the blood was taken from inner canthus.After centrifuge extraction,samples were assayed by LC-Q-TOF-MS technology in negative mode.Data were analyzed by partial least squares(PLS-DA)of two groups of serum fatty acids composition differences.ResultsCompared with the control group,serum TG (1.037±0.393 vs 0.810±0.412),TC(3.776±0.821 vs 3.002±0.648),HDL-C(2.282±0.544 vs 1.896±0.326)and LDL-C(0.405±0.148 vs 0.128±0.072)levels in model group were significantly higher.Analysis of the precision RSD was 9.25%.The results showed 16 potential biomarkers.ConclusionMetabolic characteristics of the serum fatty acids components in hyperlipidemia mice were studied by LC-Q-TOF-MS technology.It could distinguish the hyperlipidemia model group and the control group.It was an effective pathway to find unknown biological markers.

Hyperlipidemia;lipidomics;fatty acids;biological markers

Q95-33;R589.2

A

1007-6948(2017)01-0065-05

10.3969/j.issn.1007-6948.2017.01.018

1.天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所（天津 300020）

2.天津市南開醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合急腹癥研究所（天津300100)

劉佩莉，E-mail：lplyys@163.com