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    基于代謝組學技術(shù)的不同白酒揮發(fā)性成分差異分析

    2022-03-24 08:48:44張春生趙文靜董良飛
    現(xiàn)代食品 2022年4期
    關(guān)鍵詞:酒樣組學揮發(fā)性

    ◎ 張春生,趙文靜,董良飛,施 蕊

    (1.云南財經(jīng)大學 旅游與酒店管理學院,云南 昆明 650221;2.云南財經(jīng)大學 統(tǒng)計與數(shù)學學院,云南 昆明 650221;3.西南林業(yè)大學 園林園藝學院,云南 昆明 650224)

    白酒系世界七大蒸餾酒之一,其歷史悠久、風味獨特,深受我國廣大消費者的喜愛與青睞。白酒是一種復雜的多組分體系,主要成分為乙醇和水,約占總質(zhì)量的98%~99%,剩余的微量成分為一些酯類、醛類、酸類、芳香族及高級醇類化合物[1]。雖然這些微量成分總占比不足2%,但卻是影響白酒品質(zhì)的關(guān)鍵,其種類、含量及相互間比例的差異賦予了白酒不同的香型與風味[2-3]。目前,用于白酒微量成分分析的技術(shù)手段主要有色譜[4]、質(zhì)譜[5]、光譜[6]和電子傳感技術(shù)[7]等,其中氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(Gas Chromatography-Mass Spectrometry,GC-MS)對于低沸點的揮發(fā)性組分靈敏度高、分離性好,已廣泛用于白酒的摻假識別[8]、香型判定[9]及年份鑒定[10]等。此外,近年的應(yīng)用實踐表明,頂空固相微萃取箭型(Headspace Solid-Phase Microextraction Arrow,HS-SPME Arrow)技術(shù)可顯著降低前處理時白酒揮發(fā)性成分的流失,且新型的SPME Arrow比常規(guī)型號擁有更大的吸附表面積與體積,富集效果更佳,檢測結(jié)果也更接近真實酒樣[11-12]。

    代謝組學是繼蛋白質(zhì)組學和基因組學后新近興起的一種組學技術(shù),旨在利用現(xiàn)代分析儀器對生物體內(nèi)的小分子代謝物(相對分子量<1 kDa)進行檢測與鑒定,以尋找內(nèi)源分子與生理病理變化間的相對關(guān)系[13]。根據(jù)研究對象的不同,代謝組學可分為靶向和非靶向兩類,前者主要聚焦一類、一組或一群特定代謝物的分析,后者則是無偏向性地對所有檢出的代謝物進行全面分析[14],其間最關(guān)鍵、最核心的問題是多變量數(shù)據(jù)矩陣的處理[15]。代謝組學自20世紀90年代末誕生以來發(fā)展迅速,目前已成為臨床醫(yī)學、生命科學、環(huán)境科學等領(lǐng)域的重要研究工具,同時也為食品科學研究提供了新思路、新方法,如食品成分分析[16]、質(zhì)量鑒別[17]、風險監(jiān)測[18]。

    基于此,本文將新型HS-SPME Arrow與GC-MS聯(lián)用,結(jié)合代謝組學技術(shù)建立白酒揮發(fā)性成分差異分析方法,以同一品牌不同醬香型白酒為例,在全面解析揮發(fā)性成分的基礎(chǔ)上對差異成分進行篩選和標示,以期為白酒品質(zhì)的客觀評定提供理論依據(jù)和現(xiàn)實參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    1.1.1 實驗材料

    實驗選取貴州茅臺鎮(zhèn)某酒業(yè)公司兩種酒精度為53%(體積分數(shù))的醬香型白酒(編號為GB和1915)作為研究對象,GB和1915各成一組,每組設(shè)3個平行酒樣,6個酒樣依次編號為GB-a、GB-b、GB-c、1915-a、1915-b和1915-c。質(zhì)控樣本由GB和1915酒樣等量混合制備而成,對應(yīng)編號依次為mix01、mix02、mix03。

    1.1.2 儀器與試劑

    Agilent 8890-5977B氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀;Agilent DVB/CAR/PDMS三相Arrow萃取頭;Millipore-Q超純水系統(tǒng)。正己烷(Merck)為色譜純;氯化鈉(國藥)為分析純;標準品(Sigma-Aldrich)為色譜純;實驗用水為超純水。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 酒樣前處理

    取1 mL酒樣于進樣瓶中,向瓶內(nèi)加入5 mL飽和氯化鈉溶液和10 μL正己烷內(nèi)標液,采用全自動HSSPME進行揮發(fā)性成分萃取富集以供GC-MS分析。

    1.2.2 固相微萃取條件

    老化溫度:250 ℃,老化時間:5 min;孵化溫度:60 ℃,孵化時間:10 min;萃取溫度:60 ℃,萃取時間:20 min;轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速:400 r·min-1;解吸時間:5 min。

    1.2.3 氣相色譜及質(zhì)譜條件

    色 譜 柱:DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)毛細管柱;進樣口溫度:250 ℃;升溫程序:40 ℃保持5 min,以6 ℃·min-1升至280 ℃,維持5 min。載氣:氦氣;流速:1 mL·min-1;質(zhì)譜條件:EI離子源,離子源溫度230 ℃,傳輸線溫度280 ℃,電離電壓70 eV,四極桿溫度150 ℃。

    1.3 數(shù)據(jù)處理

    基于邁維(嘉興)生物技術(shù)有限公司MVGC 1.0數(shù)據(jù)庫,運用MassHunter軟件(Agilent)進行質(zhì)譜峰信息提取,經(jīng)數(shù)據(jù)過濾、保留指數(shù)計算、歸一化處理完成酒樣揮發(fā)性成分的定性定量分析。采用多元統(tǒng)計方法對酒樣質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)、正交偏最小二乘法判別分 析(Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis,OPLS-DA),并對差異判定模型進行評價。結(jié)合OPLS-DA模型的變量重要性投影VIP值(Variable Importance in Project)、P值(P-value)和差異倍數(shù)FC值(Fold Change)篩選差異成分,運用3.5.0版R軟件Pheatmap程序(版本1.0.12)繪制差異成分聚類熱圖,對差異倍數(shù)值進行對數(shù)處理(log2FC)進一步明晰差異顯著的前20個成分。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 酒樣揮發(fā)性成分總體分析

    GB、1915酒樣和質(zhì)控樣本mix經(jīng)前處理后,在優(yōu)化設(shè)定的GC-MS條件下首先獲得總離子流圖,繼而基于MVGC 1.0數(shù)據(jù)庫,運用MassHunter軟件完成酒樣揮發(fā)性成分定性定量分析。表1的統(tǒng)計結(jié)果顯示,GB和1915兩種酒樣無論是揮發(fā)性成分的種類還是數(shù)量都保持高度一致,即15類229個揮發(fā)性成分,這是由于兩酒樣系同一品牌的兩款同香型白酒所致。229個揮發(fā)性成分中,被視為白酒香味主體物質(zhì)的酯類數(shù)量占絕對優(yōu)勢,達82個,占比超35%,其次為芳烴類、雜環(huán)化合物、酮、醛、烷烴等,酸、硫化物、醚、烯烴和其他類物質(zhì)檢出量均不超過2個,占比均不足1%。

    表1 GB和1915兩種酒樣揮發(fā)性成分分類與數(shù)量統(tǒng)計表

    2.2 酒樣差異判定與差異揮發(fā)性成分篩選

    2.2.1 主成分分析(PCA)

    主成分分析是一種常用的“線性降維”方法,即在盡可能保證數(shù)據(jù)矩陣“信息量不丟失、不減少”的情況下使用少數(shù)幾個綜合指標(主成分)概覽和揭示原始變量的內(nèi)部結(jié)構(gòu),并將多維度數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為可視化的散點圖[19]。通過主成分分析可初步了解樣品組間和組內(nèi)樣品間的相似性或差異度大小,GB和1915兩種酒樣質(zhì)譜數(shù)據(jù)主成分分析結(jié)果見圖1。從二維主成分分析結(jié)果,即圖1(a)中可以直觀看出,GB和1915酒樣組間分離明顯,這說明雖然兩種酒樣揮發(fā)性成分種類、數(shù)量高度一致,但含量方面存在可視化差異,從組內(nèi)差異來看,1915酒樣總體小于GB酒樣,這意味著1915酒樣間的相似度更高,揮發(fā)性成分的質(zhì)量控制更為穩(wěn)定。三維主成分分析結(jié)果如圖1(b)所示,由圖可知,PC1、PC2和PC3的可解釋差異分別為74.8%、12.17%和5.76%,累計可解釋差異達92.73%[15]。

    圖1 兩種酒樣二維和三維主成分分析散點圖

    2.2.2 正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)

    PCA雖能有效提取樣品間的差異度信息,但對相關(guān)性較小的變量并不敏感,PLS-DA(Partial Least Squares Discriminant Analysis)作為一種有監(jiān)督模式識別的分析方法可有效消除此缺陷[15]。OPLS-DA則是一種結(jié)合了正交信號矯正和PLS-DA的回歸建模方法,其最大特點是可以去除自變量與分類變量無關(guān)的數(shù)據(jù)變異,從而使模型變得簡單和易于解釋,判別效果及主成分得分圖的可視化效果更加明顯[20-21]。根據(jù)OPLS-DA模型對GB和1915兩種酒樣質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行分析后繪制的OPLS-DA得分圖如圖2(a)所示,沿橫坐標方向可以看出,1915酒樣分布在置信區(qū)間左側(cè),GB酒樣分布在置信區(qū)間右側(cè),兩酒樣組間分離明顯,沿縱坐標方向可以看出,GB酒樣組間差異度較大,這與PCA分析結(jié)果相一致,PC1、PC2兩者累計可解釋差異86.5%。OPLS-DA模型驗證圖2(b)顯示,R2X=0.865,R2Y=0.999,Q2=0.991,即模型符合要求,具備出色的預(yù)測能力[15]。

    圖2 OPLS-DA得分圖和模型驗證圖

    2.2.3 差異揮發(fā)性成分篩選

    基于OPLS-DA結(jié)果,采用將差異倍數(shù)值FC、P值與OPLS-DA模型的變量重要性投影VIP值相結(jié)合的方法進行差異成分篩選,凡滿足FC≥2,F(xiàn)C≤0.5,P<1和VIP≥1任一條件,即認為該成分在兩酒樣組間存在顯著差異。據(jù)此標準,GB與1915酒樣數(shù)據(jù)結(jié)果經(jīng)篩查共得到12類79個差異顯著的揮發(fā)性成分(表1),占共有物質(zhì)(229個)的34.50%。其中差異較多的成分分別為酯(19個)、雜環(huán)化合物(16個)和芳烴(14個)3類物質(zhì),分別占比24.05%、20.25%和17.72%,累計占差異成分總數(shù)的62.03%。

    2.3 酒樣揮發(fā)性差異成分分析

    2.3.1 差異成分聚類熱圖分析為更直觀地觀察差異成分的變化規(guī)律,采用等方差縮放(Unit Variance Scaling,UV)方法對各變量進行歸一化處理,進而運用R軟件的Pheatmap程序繪制GB與1915酒樣組間差異成分聚類熱圖,結(jié)果如圖3所示。經(jīng)統(tǒng)計,79個差異成分中,1915酒樣有26個揮發(fā)性成分相對含量顯著高于GB酒樣,占79個差異成分的32.91%,53個揮發(fā)性成分相對含量顯著低于GB酒樣,占79個差異成分的67.09%。

    圖3 差異成分聚類熱圖

    2.3.2 差異成分分析

    對GB和1915兩種酒樣差異成分的差異倍數(shù)進行對數(shù)處理(log2FC),含量差異較大的前20個成分見表2。與GB相比,1915酒樣中的2-二甲基-4-乙烯基-1-苯、(2,2-二乙氧基乙基)-苯、1,2,3,4-四氫-2,6-二甲基萘、2-萘酚、4-十一烷酮、(Z)-6-十五碳烯-2-酮、4-十三烷酮、2,4,6-三(1-甲基乙基)苯酚、3-甲基-2(3H)-苯并呋喃酮以及苯乙醛的相對含量明顯較高;4-甲基-2-(2-甲基丙基)-1,3-二氧戊環(huán)、異戊基二甲基吡嗪、吡咯、2,3-二甲基-5-[(甲硫基)丙基]吡嗪、甲基丁酸乙酯、2-O-庚-4-基1-O-(2-甲基丙基)苯-1,2-二羧酸酯、N-(1-甲基乙基)-苯甲胺、萘、3-甲醛以及1-(2,4-二羥基苯基)-乙酮的相對含量明顯較低。

    表2 GB和1915酒樣含量差異最大的20個成分表

    續(xù)表2

    3 結(jié)論

    白酒風味物質(zhì)種類繁多,含量甚微,傳統(tǒng)的單一手段難以準確快速地完成樣品(組)間的差異判定與成分篩選。本研究將HS-SPME-Arrow-GC-MS檢測手段與代謝組學技術(shù)結(jié)合應(yīng)用于不同白酒揮發(fā)性組分差異分析中。經(jīng)比對,兩種醬香型白酒檢出成分的種類、數(shù)量高度一致,酯類物質(zhì)占比超35%。主成分分析結(jié)果顯示,兩酒樣組間可視化差異明顯,1915酒樣組內(nèi)相似度更高,提取到的PC1、PC2和PC3累計可解釋差異達92.73%?;贠PLS-DA建立的差異成分識別模型,229個檢出成分中共篩選出12類79個差異成分,酯類、雜環(huán)化合物和芳烴為差異個數(shù)最多的3類成分,1915酒樣中26個差異成分相對含量高于GB。通過對酒樣組間差異成分的倍數(shù)進行對數(shù)處理明確得出了差異最大的前20個成分。本研究建立的不同白酒揮發(fā)性成分差異分析方法高效可行,結(jié)果可視化效果佳,可為白酒的真?zhèn)舞b別和品質(zhì)評定提供理論依據(jù)與實踐參考。

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