MALAT1在結(jié)直腸癌組織細胞中的表達及對化療敏感性的影響

汪棟++++++金嵐++++++王今++++++白志剛++++++王婷婷++++++趙曉牧++++++吳國聰++++++楊盈赤

[摘要] 目的 探討MALAT1在結(jié)直腸癌組織細胞中的表達及對化療敏感性的影響，并對其機制進行初步研究。 方法 收集首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院普外科2015年6～12月手術(shù)切除結(jié)直腸癌組織33例及相應(yīng)癌旁正常組織33例，采用RT-PCR方法檢測MALAT1的表達水平；采用慢病毒敲減MALAT1后，檢測MALAT1在結(jié)直腸癌細胞sw620及sw480中的表達水平；MTS方法檢測MALAT1在結(jié)直腸癌增殖及化療療效中的作用，Western blot檢測相關(guān)通路蛋白表達變化。 結(jié)果 結(jié)直腸癌組織中MALAT1的表達水平較癌旁正常組織顯著增高（t = 4.138，P = 0.009），慢病毒si-MALAT1顯著敲減MALAT1的表達水平。MALAT1敲減后，sw620及sw480細胞的增殖均減低（t = 2.957，P = 0.009；t = 1.936，P = 0.017），且對氟尿嘧啶、奧沙利鉑的敏感性增加。下調(diào)MALAT1后，PI3K及p-AKT的水平下調(diào)，而總AKT水平無明顯變化。 結(jié)論 MALAT1在結(jié)直腸癌增殖及耐藥過程中發(fā)揮重要作用，其可能成為結(jié)直腸癌潛在的治療靶點。

[關(guān)鍵詞] 結(jié)直腸癌；MALAT1；化療；耐藥

[中圖分類號] R735.35 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）11（b）-0012-05

[Abstract] Objective To explore the expression of MALAT1 in colorectal cancer tissue cells and its influence for the chemotherapy sensitivity， in order to preliminary study the mechanism. Methods Thirty-three cases with colorectal cancer tissue and 33 cases with normal tissue adjacent to carcinoma in Department of General Surgery， Beijing Friendship Hospital， Capital Medical University from June to December 2015 were collected and performed RT-PCR method to detect the levels of MALAT1. After introducing the lentivirus to knock down MALAT1， the expression levels of MALAT1 in sw620 and sw480 of colorectal carcinoma cells were detected. MTS method was used to detect the effectiveness of proliferation and chemotherapy resistance in colorectal cancer. Western blot detection was adopted to detect the protein expression changes of related pathways. Results The expression levels of MALAT1 in colorectal cancer tissue were significantly higher than the normal tissue adjacent to carcinoma （t = 4.138， P = 0.009）， si-MALAT1 knocked down the expression level of MALAT1 obviously. After knockdown of MALAT1， the proliferation of sw480 and sw620 cell was slowed down （t = 2.957， P = 0.009； t = 1.936， P = 0.017）， and they were more sensitive for 5-FU and Oxaliplatin. After decreasing the level of MALAT1， the levels of P13K and p-AKT were decreased， while the level of AKT had no significant difference. Conclusion MALAT1 plays an important role in proliferation and chemotherapy resistance of colorectal cancer， which may be a potential therapeutic target for the treatment of colorectal cancer.

[Key words] Colorectal cancer； MALAT1； Chemotherapy； Drug resistance

長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一種長度大于200個核苷酸的RNA分子，由于缺乏開放閱讀框，lncRNA并不編碼蛋白質(zhì)，而是以RNA的形式在表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后3個層面調(diào)控基因表達[1-2]，從而在腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移等多個過程中發(fā)揮重要作用[3-5]。肺腺癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）是最早發(fā)現(xiàn)的長鏈非編碼RNA之一，最初發(fā)現(xiàn)于人類非小細胞肺癌[6]，在肺癌、膀胱癌、肝癌等多種惡性腫瘤中均呈現(xiàn)異常表達的狀態(tài)，可以影響腫瘤的發(fā)生、侵襲和遷移[7-9]，但是其與腫瘤耐藥相關(guān)性研究較少，目前僅有研究證實MALAT1可以降低胰腺癌細胞的化療敏感性。本研究擬觀察MALAT1對于結(jié)直腸癌細胞增殖及化療藥物應(yīng)答的影響，并對相關(guān)機制進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑

人結(jié)直腸癌細胞株sw620、sw480，保存于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院（以下簡稱“我院”）普外科實驗室；干擾慢病毒siMALAT1和空載慢病毒si-CON購于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清購自美國Gibco公司；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于北京天根生化科技有限公司；SYBRRGreen購于上海東洋坊生物科技有限公司；引物由上海生工生物有限公司合成；一抗及二抗均購自美國CST公司；MTS購于美國Sigma公司；氟尿嘧啶（5-Fu）：上海金穗生物科技有限公司；奧沙利鉑：購于賽諾菲圣德拉堡民生制藥。BCA蛋白定量試劑盒購于江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。組織樣本來源于我院普外科2015年6～12月手術(shù)切除的結(jié)直腸癌組織33例及相應(yīng)癌旁正常組織33例，患者年齡44～85歲，平均（61.4±12.6）歲，其中男18例，女15例。根據(jù)AJCC的結(jié)直腸癌分期，腫瘤浸潤深度情況：T1期0例，T2期6例，T3期15例，T4期11例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況：N0患者10例，N1～N2患者23例；遠處轉(zhuǎn)移情況：M0患者19例，M1患者14例。全部標(biāo)本均由專業(yè)病理科人員指導(dǎo)采集并經(jīng)病理學(xué)證實。

1.2 實驗方法

1.2.1 實時熒光定量PCR法檢測結(jié)直腸癌組織及癌旁正常組織中MALAT1的表達 總RNA采用Trizol法進行提取，按照說明書進行逆轉(zhuǎn)錄。實時定量PCR反應(yīng)體系如下：SYBRRGreen mix 10 μL；上游引物1 μL；下游引物1 μL；cDNA 1 μL；RNA/DNAase free water補至20 μL。反應(yīng)條件：95℃熱啟動10 min；95℃變性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸10 s，共40個循環(huán)。MALAT1及內(nèi)參的引物序列見表1。

1.2.2 制備MALAT1敲減穩(wěn)定細胞株 結(jié)直腸癌細胞sw480，sw620均感染慢病毒siMALAT1以制備MALAT1敲減穩(wěn)定細胞株，分別記作sw480 si-MALAT1及sw620 si-MALAT1。感染空載慢病毒si-CON作為相應(yīng)陰性對照組，分別記作sw480 si-CON以及sw620 si-CON。

1.2.3 MTS法檢測結(jié)直腸癌細胞株的藥物應(yīng)答 sw620 si-CON、sw620 si-MALAT1細胞分別以0.25%胰酶消化，計數(shù)，以2000個/孔接種入96孔板內(nèi)。待細胞貼壁后分別加入不同濃度的化療藥，設(shè)0.001、0.01、0.1、1、10、100、1000 μmol/L共7個藥物濃度，每個藥物濃度設(shè)3孔重復(fù)。藥物處理48 h后加入MTS 20 μL/孔，4 h內(nèi)在酶標(biāo)儀上檢測波長490 nm的OD值?？苁细牧挤ㄓ嬎闼幬飳毎腎C50值，即細胞死亡50%時的藥物濃度。

1.2.4 MTS法檢測結(jié)直腸癌細胞株的生長曲線 sw480 si-CON、sw480 si-MALAT1以及sw620 si-CON、sw620 si-MALAT1細胞分別以0.25%胰酶消化，計數(shù)，以1000個/孔接種入96孔板內(nèi)。于接種后第12、24、48、72小時在酶標(biāo)儀上檢測OD490值。

1.2.5 免疫印跡法檢測細胞株中MALAT1下游蛋白的表達 細胞消化后，收集提取總蛋白，采用BCA法蛋白對其進行定量。以等量蛋白進行10%的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳和半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜。然后將硝酸纖維素膜用5%的脫脂牛奶封閉1 h。之后將纖維素膜與一抗雜交4℃過夜，TBST漂洗3次后與辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h后進行顯色、拍照。用凝膠成像分析系統(tǒng)測定光密度，以GAPDH為內(nèi)參進行蛋白的相對定量分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MALAT1在結(jié)直腸癌及癌旁正常組織中的表達

采用實時熒光定量PCR方法檢測33例結(jié)直腸癌及33例癌旁正常組織標(biāo)本中MALAT1的表達水平。與正常組織相比，結(jié)直腸癌組織中MALAT1的表達量顯著上調(diào)，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t = 4.138，P = 0.009）。見圖1。

2.2 慢病毒顆粒的感染效率

應(yīng)用慢病毒顆粒感染人結(jié)直腸癌SW620、SW480細胞，48 h后在熒光倒置顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達，以分析感染效率。結(jié)果顯示，48 h后轉(zhuǎn)染效率可達80%左右。見圖2。

2.3 不同病毒感染結(jié)直腸癌SW620、sw480細胞后MALAT1表達水平的變化

采用實時熒光定量PCR法檢測不同慢病毒感染人結(jié)直腸癌SW620、SW480細胞后MALAT1的表達變化。結(jié)果顯示，SI-MALAT1病毒的感染使SW620、SW480細胞中MALAT1的表達明顯下降。統(tǒng)計學(xué)分析顯示，MALAT1干擾組與對照組的表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義，即干擾后的相對表達值與未干預(yù)的值（1）比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見表2。

2.4 不同病毒感染結(jié)直腸癌細胞sw620、sw480后細胞的增殖情況

采用MTS方法檢測si-CON、si-MALAT1穩(wěn)定細胞株的增殖能力有無改變。結(jié)果顯示，干擾MALAT1后sw480與sw620的增殖能力均明顯減弱，以72 h時細胞增殖的差異最為明顯（P < 0.05）。見圖3。

2.5 不同病毒感染結(jié)直腸癌細胞sw620后細胞的藥物敏感性

MTS法檢測5-Fu對si-CON及si-MALAT1細胞的IC50分別為（14.48±3.78）、（3.18±0.15）μmol/L（t = 1.429，P = 0.031）。奧沙利鉑對si-CON及si-MALAT1細胞的IC50分別為（53.10±1.39）、（7.71±0.29）μmol/L（t = 2.356，P = 0.006）。藥物的劑量存活曲線如圖4所示，結(jié)果顯示MALAT1干擾之后細胞對奧沙利鉑及5-Fu的敏感性均提高。

2.6 Western blot檢測不同病毒感染的sw620細胞株中各種下游蛋白水平

Western blot檢測si-CON與siMALAT1細胞的PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白的表達，結(jié)果顯示PI3K及p-AKT明顯下調(diào)，而總AKT水平無明顯變化。見圖5。

3 討論

lncRNA是指轉(zhuǎn)錄本長度大于200 nt的功能性RNA分子，由于沒有開放閱讀框而不能編碼蛋白質(zhì)。盡管如此，lncRNA仍然可以通過多種方式影響蛋白表達，包括調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合因子的活性，轉(zhuǎn)錄后加工生成多種RNA，誘導(dǎo)染色質(zhì)修飾復(fù)合物的定位與結(jié)合等，從而參與腫瘤細胞的各種生物學(xué)行為，包括增殖、侵襲、遷移以及腫瘤化療耐藥等[10-11]。

MALAT1是最早發(fā)現(xiàn)的長鏈非編碼RNA之一，最初發(fā)現(xiàn)于人類非小細胞肺癌，是一個高度保守的lncRNA，在種屬間存在高度同源序列，因此推測其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中可能扮演重要角色[12]，有文獻報道，MALAT1在肝癌、非小細胞肺癌及前列腺癌等多種腫瘤組織中表達上調(diào)，提示MALAT1可能是致癌的lncRNA[13]。本研究采用RT-PCR的方法檢測11對結(jié)直腸癌組織及癌旁正常組織中MALAT1的表達，結(jié)果顯示MALAT1在癌組織中明顯上調(diào)（P = 0.013），這也與之前在其他腫瘤中的研究結(jié)果一致[14-16]。

為了進一步研究MALAT1在結(jié)直腸癌中的生物學(xué)功能，本研究利用慢病毒感染建立了MALAT1干擾及其空載對照的結(jié)腸癌細胞穩(wěn)定株。通過RT-PCR的方法對干擾效果進行驗證，干擾后sw620和sw480的MALAT1表達水平分別為相應(yīng)的對照組的0.15倍和0.22倍，證明干擾效果較好。Schmidt等[7]在干擾MALAT1之后對非小細胞肺癌細胞A549的增殖情況進行檢測，發(fā)現(xiàn)MALAT1表達下調(diào)能有效抑制A549細胞的增殖，Wang等[13]的實驗同樣證實MALAT1可促進胃癌細胞的增殖。本研究MALAT1敲減后兩株結(jié)直腸癌細胞的增殖性明顯降低。在用不同濃度的5-Fu/奧沙利鉑處理細胞48 h后，MALAT1干擾的sw620細胞對化療藥物5-Fu和奧沙利鉑的敏感性明顯升高。

5-Fu和奧沙利鉑是常用的治療結(jié)直腸癌的化療藥物，已在臨床應(yīng)用多年，但是耐藥一直是臨床上令人棘手的問題。多項研究證實lncRNA與腫瘤耐藥的發(fā)生密切相關(guān)[17-18]。例如CUDR在耐多柔比星鱗癌細胞中高表達，細胞轉(zhuǎn)染CUDR后Caspase-3通路功能下調(diào)，提示CUDR可能通過調(diào)控Caspase-3通路進而調(diào)控腫瘤耐藥[14]。而Yang等[15]研究者發(fā)現(xiàn)lncRNA HOTAIR在肝癌組織中顯著上調(diào)，而干擾HOTAIR的表達水平后可顯著逆轉(zhuǎn)HepG2細胞對順鉑及多柔比星的耐藥性。因此本研究希望能探討MALAT1與結(jié)直腸癌化療耐藥的關(guān)系，本研究采用慢病毒敲減MALAT1在兩株結(jié)直腸癌細胞中的表達水平，觀察MALAT1敲減之后細胞的增殖及對于不同化療藥物敏感性的變化，結(jié)果顯示MALAT1敲減后結(jié)直腸癌細胞增殖減慢且對化療藥物的敏感性增強，提示MALTA1可能為克服結(jié)直腸癌耐藥的潛在靶點。

為了進一步探討MALAT1調(diào)控結(jié)直腸癌增殖和耐藥的可能機制，本研究利用Western blot分析了PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白的表達水平。PI3K/AKT信號傳導(dǎo)通路是細胞增殖的重要通路之一，在調(diào)節(jié)細胞的增殖方面起重要作用，其與藥物耐藥性關(guān)系的研究也越來越多，被認為是化療耐藥治療的重要靶點[16-17]。文獻報道PI3K/AKT信號傳導(dǎo)通路在多種胃腸道惡性腫瘤中過度活化[18]。Oki等[19]報道了AKT的活化與多種化療藥物如5-Fu、順鉑等耐藥相關(guān)，而Jin等[20]發(fā)現(xiàn)卵巢癌吉西他濱耐藥細胞株中PI3K/AKT通路異常活化，而在乳腺癌細胞株MCF7中，PI3k/AKT活性的升高導(dǎo)致其對紫杉醇和5-Fu等耐藥，而抑制該通路可以逆轉(zhuǎn)MCF7的耐藥性。

本研究結(jié)果顯示，在結(jié)直腸癌細胞sw620中敲低MALAT1之后，PI3K及p-AKT的表達水平顯著下降，而總AKT水平并未明顯變化。由此提示MALAT1可能通過激活PI3K/AKT信號通路影響結(jié)直腸癌細胞的增殖和藥物應(yīng)答，其可能是潛在的結(jié)直腸癌治療靶點。

目前對于MALAT1的研究主要是通過腫瘤細胞培養(yǎng)，但其在體內(nèi)與體外的作用是否一致，還有待進一步研究。腫瘤的信號通路交錯成網(wǎng)，因此除了PI3K/AKT信號通路，可能尚有其他信號通路參與到結(jié)直腸癌耐藥的機制中，這些信號通路之間的相互作用仍需深入探討，為更好地克服腫瘤耐藥提供理論依據(jù)。

基于以上細胞學(xué)實驗，MALAT1在結(jié)直腸癌中表達顯著上調(diào)，在結(jié)直腸癌增殖及耐藥過程中扮演重要角色，其可能通過PI3K/AKT信號通路發(fā)揮重要的生物學(xué)作用，影響結(jié)直腸癌的增殖及化療耐藥，其可能是潛在的結(jié)直腸癌治療靶點。

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