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    延髓頭端腹外側(cè)部在腦梗死合并心律失常中的作用

    2017-02-28 09:33:01賈淑偉王玲焦?jié)櫳?/span>
    中國醫(yī)藥導(dǎo)報 2016年31期
    關(guān)鍵詞:心律失常谷氨酸腦梗死

    賈淑偉+王玲+焦?jié)櫳?/p>

    [摘要] 目的 探討延髓頭端腹外側(cè)部在腦梗死合并心律失常中的作用及可能機制。 方法 112只Wistar大鼠隨機分為3組:對照組(n=16)、假手術(shù)組(n=16)和模型組(n=80)。模型組再隨機分為造模后30 min、1 h、2 h、4 h 和8 h組,每組16只,觀察腦梗死后延髓頭端腹外側(cè)部神經(jīng)元活動的變化。另40只大鼠隨機分為5組:對照組(n=8)、生理鹽水組(10 μL,n=8)、L-谷氨酸組(0.5 μmol,10 μL,n=8)、谷氨酸非選擇性NMDA受體拮抗劑MK-801(4 nmol,10 μL)加L-谷氨酸組(n=8)和MK-801加模型組(n=8),以觀察谷氨酸在腦梗死誘發(fā)心律失常中的作用。心電圖用生物信號采集系統(tǒng)采集。腦梗死動物模型制作采用大鼠大腦中動脈栓塞(MCAO),給藥途徑為側(cè)腦室注射,以Fos蛋白作為神經(jīng)元激活的標(biāo)志物。 結(jié)果 對照組和假手術(shù)組大鼠心電圖均無明顯異常,模型組大鼠心律失常的發(fā)生率為78.75%(63/80),明顯高于對照組(P < 0.01),且在心律失常發(fā)生的相應(yīng)時間點延髓頭端腹外側(cè)部Fos蛋白表達(dá)明顯增加(P < 0.01)。側(cè)腦室注射生理鹽水組心電圖無明顯異常,側(cè)腦室注射L-谷氨酸后心律失常發(fā)生率為87.5%(7/8),明顯高于生理鹽水組(P < 0.01),心律失常類型類似于模型組,同時延髓頭端腹外側(cè)部Fos蛋白表達(dá)明顯增高(P < 0.05)。MK-801預(yù)處理后再造模和MK-801預(yù)處理后再側(cè)腦室注射L-谷氨酸組,均無心律失常發(fā)生,延髓頭端腹外側(cè)部Fos蛋白表達(dá)無顯著性變化(P > 0.05)。 結(jié)論 腦梗死合并心律失常的發(fā)生與延髓頭端腹外側(cè)部活動增強有關(guān),且此作用由谷氨酸激活NMDA受體介導(dǎo)。

    [關(guān)鍵詞] 延髓頭端腹外側(cè)部;腦梗死;心律失常;谷氨酸;NMDA受體

    [中圖分類號] R338 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721(2016)11(a)-0011-05

    腦梗死合并心律失常是腦梗死猝死的主要原因之一[1]。大量研究表明,腦自主神經(jīng)功能失衡,特別是交感神經(jīng)過度激活可致心律失常的發(fā)生[2]。合并心律失常的腦梗死患者存在著交感和副交感神經(jīng)活動失衡[3-4],但特異性的心電圖異常與局部顱內(nèi)病變之間的對應(yīng)關(guān)系尚未建立。延髓頭端腹外側(cè)部(rostral ventrolateral medulla,RVLM)是腦內(nèi)控制自主神經(jīng)功能和心血管活動的關(guān)鍵腦區(qū),本研究觀察了RVLM活動變化在腦梗死合并心律失常中的作用及可能機制,以期為臨床治療提供理論依據(jù),并豐富心血管功能活動調(diào)節(jié)的中樞機制。

    1 資料與方法

    1.1 實驗動物

    健康雄性Wistar大鼠,體重(230±20)g,由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實驗動物學(xué)部提供,實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(黑)2013-001,實驗動物使用許可證號:SYXK(黑)2013-002。

    1.2 藥物與試劑

    c-Fos多克隆抗體(sc-52,Santa Cruz)、AP標(biāo)記的山羊抗兔二抗(zb-2308)和AP標(biāo)記的馬抗小鼠二抗(zd-2310)均購自中杉金橋公司。GAPDH單克隆抗體(小鼠)購自碧云天生物技術(shù)研究所。TTC購自中國醫(yī)藥上?;瘜W(xué)試劑公司。

    1.3 儀器

    大鼠腦立體定位儀SN-3,日本Narishige;顯微圖像采集系統(tǒng),日本Olympus;石蠟切片機RM2016,德國徠卡;凝膠成像系統(tǒng),美國Alpha;RM6240B生物信號采集系統(tǒng),中國成都泰盟。

    1.4 實驗分組

    所有大鼠監(jiān)測心電20 min,心電圖正常者用于實驗。為了觀察腦梗死后RVLM神經(jīng)元活動的變化,112只大鼠隨機分為3組:對照組(n=16)、假手術(shù)組(n=16)和模型組(n=80)。模型組再隨機分為造模后30 min、1 h、2 h、4 h和8 h組,每組16只。對照組和假手術(shù)組大鼠在麻醉后或假手術(shù)操作后2 h取材,模型組大鼠在造模后相應(yīng)的時間點取材。用免疫組織化學(xué)技術(shù)和Western blot技術(shù)檢測每只大鼠右側(cè)腦(缺血側(cè))RVLM腦區(qū)Fos蛋白的表達(dá)。為了觀察谷氨酸在腦梗死誘發(fā)心律失常中的作用,40只大鼠隨機分為5組,每組8只:對照組、生理鹽水組(10 μL)、L-谷氨酸組(0.5 μmol,10 μL)、MK-801(4 nmol,10 μL)后20 min再L-谷氨酸組和MK-801(4 nmol,10 μL)后20 min再造模組。所有大鼠在側(cè)腦室注射后或術(shù)后30 min取材。用Western blot技術(shù)檢測每只大鼠右側(cè)腦RVLM腦區(qū)Fos蛋白表達(dá)。

    1.5 腦缺血動物模型制備

    水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉。栓線經(jīng)頸總動脈、頸內(nèi)動脈插入大腦中動脈,進(jìn)線長度距頸總動脈分叉(17.5 ± 0.5)mm[5]。假手術(shù)組栓線到大腦中動脈起始處后立即撤回,其余操作與模型組相同。

    1.6 模型鑒定

    神經(jīng)功能學(xué)評分大于2分且TTC染色梗死區(qū)明顯者計入模型組。

    1.6.1 神經(jīng)功能學(xué)評分 神經(jīng)功能學(xué)評分值為0~4分,其中,沒有神經(jīng)功能缺陷計0分;前肢屈曲計1分;對側(cè)前肢輕度抓爪計2分;讓大鼠自由活動,拉其尾巴后大鼠向輕癱側(cè)繞圈行走計3分;如果大鼠未受任何刺激自發(fā)向輕癱側(cè)繞圈行走計4分[6-8]。

    1.6.2 TTC染色 將大鼠腦做2 mm厚的連續(xù)冠狀切片,置于2%的2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)生理鹽水溶液中,37℃孵育15 min。紅色染色區(qū)為正常腦組織,白色未染色區(qū)為梗死區(qū)。

    1.7 免疫組化檢測

    大鼠灌注固定后將含RVLM的腦組織塊石蠟包埋,冠狀切片(5 μm),水化,修復(fù)抗原,10% H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物后5% BSA封閉,兔來源的Fos抗體(1∶200)4℃孵育過夜,PBS洗3次,二抗(1∶500)37℃孵育30 min,DAB避光染色5 min,水沖,蘇木精染色30 s,水沖,再次脫水、透明,中性樹膠封片,顯微鏡下觀察計數(shù)。Fos表達(dá)陽性神經(jīng)元的核呈黃棕色染色,在高倍鏡(400×)下分別計數(shù)5個區(qū)域陽性神經(jīng)元數(shù),然后取平均值。

    1.8 Western blot檢測

    腦組織加入組織裂解液(RIPA∶PMSF為100∶1)研磨,4℃ 1000 r/min離心15 min得到勻漿液,取上清,BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度,上樣,10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后將蛋白轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上,3%牛血清白蛋白37℃封閉1 h,TBST洗膜,孵一抗(1∶500)4℃過夜,TBST洗膜,孵二抗(1∶1000)37℃ 1 h,TBST洗膜,BCIP/NBT顯色。內(nèi)參為甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)。結(jié)果用Alphaview 3.1.1.0軟件分析。

    1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

    采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,兩組間比較采用t檢驗;多組間比較采用單因素方差分析;以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 MCAO大鼠心電圖變化

    對照組和假手術(shù)組大鼠無心律失常發(fā)生,模型組大鼠心律失常的發(fā)生率高達(dá)78.75%(63/80),明顯高于對照組(P < 0.01),與臨床報道一致[1],但心律失常的發(fā)生率偏高,可能與實驗動物模型腦缺血程度相對均一,而腦梗死患者的損傷程度不可能均一有關(guān)。MCAO后大鼠會出現(xiàn)2次心律失常,分別在MCAO后(15.63±1.58)min,持續(xù)(31.02±1.85)min;(238.36±14.32)min,持續(xù)(26.28±1.36)min。心律失常類型主要是室性期前收縮(室性二聯(lián)律)和室性快速性心律失常。側(cè)腦室注射生理鹽水組心電圖無明顯異常,側(cè)腦室注射L-谷氨酸后心律失常發(fā)生率為87.5%(7/8),明顯高于生理鹽水組(P < 0.01),心律失常類型類似于模型組大鼠。側(cè)腦室注射谷氨酸非選擇性NMDA受體拮抗劑MK-801后的20 min內(nèi)未見心律失常的發(fā)生,20 min后行MCAO和20 min后側(cè)腦室注射L-谷氨酸都未見心律失常的發(fā)生,提示腦梗死能誘發(fā)心律失常,且與谷氨酸作用于NMDA受體的有關(guān)。

    2.2 MCAO后RVLM內(nèi)Fos蛋白表達(dá)免疫組化結(jié)果

    筆者先期進(jìn)行室旁核[8]研究時,分別觀察了MCAO后15 min、30 min、1 h、2 h、4 h、8 h和16 h室旁核活動的改變與心律失常發(fā)生的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)對照組和假手術(shù)組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P > 0.05);室旁核的活動從15 min開始增強,持續(xù)到30 min時達(dá)峰值,認(rèn)為30 min的增強是15 min的延續(xù);16 h后室旁核的活動改變差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P > 0.05)。故本研究只觀察了MCAO后30 min、1 h、2 h、4 h和8 h RVLM活動的改變,發(fā)現(xiàn)在對照組,RVLM內(nèi)只可見極少量淡染的陽性神經(jīng)元;在模型組,RVLM內(nèi)陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯增加且染色加深,與對照組比較,MCAO后30 min和4 h RVLM內(nèi)神經(jīng)元Fos陽性表達(dá)的增加,且差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義(P < 0.01)。見圖2(封四)。

    2.3 MCAO后RVLM內(nèi)Fos蛋白表達(dá)Western blot結(jié)果

    與對照組比較,MCAO后RVLM神經(jīng)元Fos蛋白表達(dá)在30 min和4 h明顯增加(P < 0.01)(圖3),與免疫組化結(jié)果一致,表明MCAO后RVLM神經(jīng)元被激活了兩次,分別在30 min和4 h左右,與MCAO后心律失常發(fā)生時間點相對應(yīng),說明MCAO后心律失常的發(fā)生與RVLM激活有關(guān)。

    2.4 RVLM內(nèi)Fos蛋白表達(dá)的谷氨酸能機制

    與對照組比較,側(cè)腦室注射生理鹽水后RVLM內(nèi)Fos蛋白表達(dá)無明顯變化(P > 0.05),側(cè)腦室注射L-谷氨酸后RVLM內(nèi)Fos蛋白的表達(dá)明顯增加(P < 0.05),側(cè)腦室注射MK-801可阻斷側(cè)腦室注射L-谷氨酸(P > 0.05)和MCAO(P > 0.05)引起的Fos蛋白表達(dá)的增加(圖4)。提示腦梗死后RVLM的激活由腦內(nèi)高水平的谷氨酸作用于NMDA受體所介導(dǎo)。

    A:對照、側(cè)腦室注射生理鹽水(10 μL)、側(cè)腦室注射L-谷氨酸(0.5 μmol,10 μL)以及MK-801(4 nmol,10 μL)預(yù)處理后給予谷氨酸和MCAO后RVLM內(nèi)Fos蛋白表達(dá)的Western blot條帶;B:上述不同條件下RVLM內(nèi)Fos蛋白表達(dá)變化的統(tǒng)計圖,與對照組比較,*P < 0.05

    和MCAO后RVLM內(nèi)Fos蛋白表達(dá)的Western blot結(jié)果

    3 討論

    腦梗死早期合并心律失?;颊撸鸩〖?,變化快,不能用腦疝來解釋[9],許多合并心律失常的腦梗死患者并無原發(fā)心臟病史[10],提示腦梗死合并心律失常的發(fā)生源于中樞神經(jīng)系統(tǒng)。腦自主神經(jīng)功能失衡,特別是交感神經(jīng)過度激活可誘導(dǎo)致命性心律失常的發(fā)生[2],而且合并心律失常的腦梗死患者確實存在交感和副交感神經(jīng)活動失衡[3]。有研究發(fā)現(xiàn),電或化學(xué)刺激RVLM,可使交感神經(jīng)興奮性增加,心率加快,血壓上升和誘發(fā)心電異常,而損毀兩側(cè)RVLM,可使交感神經(jīng)興奮性降低和交感節(jié)律消失,血壓降到神經(jīng)節(jié)阻斷和脊椎動物水平[11-12],可見RVLM是脊髓以上中樞調(diào)控交感神經(jīng)輸出的重要通路,是中樞調(diào)控心血管活動的重要腦區(qū)之一,且可因其活動增強使交感神經(jīng)過度激活而誘發(fā)心電異常。本研究發(fā)現(xiàn)MCAO后,78.75%出現(xiàn)心律失常的大鼠RVLM活動增強,提示腦梗死后心律失常的發(fā)生與RVLM活動增強導(dǎo)致的交感神神經(jīng)過度興奮有關(guān)。

    RVLM內(nèi)可見谷氨酸免疫陽性結(jié)構(gòu)[13-15],刺激RVLM組織切片上的多數(shù)交感節(jié)前神經(jīng)元所產(chǎn)生的快興奮性突觸后電位可被谷氨酸受體阻斷藥消除[16],RVLM內(nèi)微量注射谷氨酸能引起血壓升高和心率加快,刺激丘腦下部所引起的心血管效應(yīng),能被RVLM內(nèi)注射谷氨酸受體阻斷藥阻斷[17]。形態(tài)學(xué)證實,RVLM內(nèi)既存在內(nèi)源性谷氨酸能神經(jīng)元,也存在外源性的谷氨酸能神經(jīng)傳入。前者可投射到脊髓中間外側(cè)柱的交感節(jié)前神經(jīng)元,興奮交感神經(jīng)[18],是延髓到交感節(jié)前神經(jīng)元的所有興奮性傳出的關(guān)鍵部位;后者可能來自孤束核、室旁核(paraventricular nucleus,PVN)等中樞核團(tuán)的纖維投射,這些投射到RVLM的谷氨酸能神經(jīng)元可通過NMDA受體介導(dǎo)交感緊張性興奮[19]。本研究發(fā)現(xiàn),側(cè)腦室注射L-谷氨酸后,RVLM被激活,此激活可被NMDA受體拮抗劑MK-801阻斷,且MK-801也能阻斷MCAO后RVLM的激活。這些結(jié)果提示腦梗死后腦內(nèi)異常增高的谷氨酸可能通過作用于NMDA受體使RVLM激活,進(jìn)而激活脊髓中間外側(cè)柱交感節(jié)前神經(jīng)元,使交感神經(jīng)輸出增加,誘發(fā)心律失常。解剖學(xué)研究發(fā)現(xiàn),貓的PVN存在向RVLM的纖維投射,電刺激PVN細(xì)胞可順行激活RVLM,損毀雙側(cè)RVLM幾乎去除電刺激PVN引起的增壓反應(yīng),表明RVLM介導(dǎo)PVN的增壓反應(yīng),RVLM神經(jīng)元是PVN下行交感興奮通路的一部分,構(gòu)成的PVN-RVLM-脊髓通路在交感神經(jīng)系統(tǒng)和心血管活動的調(diào)節(jié)中起著重要作用[14-15]。Yang等[20]研究發(fā)現(xiàn),刺激PVN可使心率增加、腎交感神經(jīng)興奮,RVLM內(nèi)注射谷氨酸也能使心率增加、腎交感神經(jīng)興奮,若是在刺激PVN的同時給予谷氨酸受體拮抗劑犬尿烯酸,上述現(xiàn)象不再出現(xiàn)。說明從PVN到RVLM的突觸中谷氨酸是作為興奮性神經(jīng)遞質(zhì)而起作用。筆者前期研究發(fā)現(xiàn),MCAO后PVN活動增高[8],提示腦梗死后RVLM活動的增強也可能是腦內(nèi)高濃度的谷氨酸使PVN活動增強的結(jié)果,進(jìn)而使交感神經(jīng)的輸出增加,誘發(fā)心律失常。

    總之,腦梗死合并心律失常的發(fā)生與腦梗死后RVLM活動增強有關(guān),且此作用由谷氨酸激活NMDA受體所介導(dǎo)。

    [參考文獻(xiàn)]

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    (收稿日期:2016-06-13 本文編輯:程 銘)

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